Summary
Este protocolo investiga o uso de plasma rico em vesículas extracelulares (VE) como indicador da capacidade coagulativa da VE. O plasma rico em EV é obtido através de um processo de centrifugação diferencial e subsequente recalcificação.
Abstract
O papel das vesículas extracelulares (VE) em várias doenças vem ganhando atenção crescente, particularmente devido à sua potente atividade pró-coagulante. No entanto, há uma necessidade urgente de um teste à beira do leito para avaliar a atividade pró-coagulante da EV em ambientes clínicos. Este estudo propõe o uso do tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV como medida da atividade pró-coagulante da EV. Procedimentos padronizados foram empregados para obtenção de sangue total citrato de sódio, seguido de centrifugação diferencial para obtenção de plasma rico em EV. O plasma rico em EV e o cloreto de cálcio foram adicionados à ventosa, e as mudanças na viscoelasticidade foram monitoradas em tempo real usando um analisador. O tempo natural de coagulação do plasma rico em EV, referido como EV-ACT, foi determinado. Os resultados revelaram um aumento significativo no EV-ACT quando EV foi removido do plasma obtido de voluntários saudáveis, enquanto diminuiu significativamente quando EV foi enriquecido. Além disso, EV-ACT foi consideravelmente encurtado em amostras humanas de pré-eclâmpsia, fratura de quadril e câncer de pulmão, indicando níveis elevados de EV plasmático e promoção de hipercoagulação sanguínea. Com seu procedimento simples e rápido, o EV-ACT mostra-se promissor como um teste à beira do leito para avaliar a função da coagulação em pacientes com altos níveis plasmáticos de EV.
Introduction
A trombose, causada pela hipercoagulabilidade, desempenha um papel significativo em várias doenças, incluindo traumatismo cranioencefálico1, pré-eclâmpsia2, tumores3 e pacientes fraturados4. O mecanismo subjacente à hipercoagulabilidade é complexo, e ênfase recente tem sido dada ao papel das vesículas extracelulares (VE) nos distúrbios de coagulação. EVs são corpos vesiculares com uma estrutura bicamada que se desprendem da membrana celular, variando em diâmetro de 10 nm a 1000 nm. Estão associados a uma variedade de processos patológicos, particularmente distúrbios de coagulação5. Vários estudos identificaram os EVs como um preditor promissor do risco de trombose 6,7. A atividade pró-coagulante dos EVs depende da expressão de fatores de coagulação, principalmente fator tecidual (FT) e fosfatidilserina (PS). EVs com atividade pró-coagulante robusta aumentam significativamente a eficiência catalítica da tenase e do complexo protrombina, promovendo fibrinogênio mediado por trombina e trombose local8. Níveis elevados de EV e sua relação causal com a hipercoagulabilidade têm sido observados em inúmeras doenças9. Consequentemente, padronizar a detecção de EVs e relatar sua atividade pró-coagulante é uma importante área de investigação10.
Até o momento, apenas alguns kits comerciais estão disponíveis para detectar a atividade pró-coagulante dos EVs. O ensaio MP-Atividade e o ensaio MP-TF, produzidos por uma empresa comercial, são ensaios funcionais utilizados para medir a atividade pró-coagulante da EV no plasma11. Esses ensaios empregam um princípio semelhante ao dos ensaios imunoenzimáticos para detectar PS e FT em EVs. No entanto, esses kits são caros e limitados a algumas instituições de pesquisa de alto nível. O processo é complexo e demorado, tornando desafiador implementá-los em ambientes clínicos. Além disso, um ensaio de fosfolipídios pró-coagulantes (PPL) desenvolvido comercialmente mistura plasma livre de PS com plasma teste, medindo o tempo de coagulação para detectar quantitativamente os níveis de EVs PS-positivos12. No entanto, esses ensaios se concentram principalmente em PS e TF em EVs, ignorando outras vias de coagulação nas quais os EVs circulantes podem estar envolvidos12.
O sistema de coagulação do plasma é intrincado e compreende componentes "invisíveis" e "visíveis", incluindo coagulantes, anticoagulantes, sistemas fibrinolíticos e EVs suspensos no plasma. Fisiologicamente, esses componentes mantêm um equilíbrio dinâmico. Em condições patológicas, o aumento significativo dos VE na circulação contribui para a hipercoagulabilidade, particularmente em pacientes com traumatismo cranioencefálico, pré-eclâmpsia, fraturas e vários tipos de câncer13. Atualmente, a avaliação do estado de coagulação em laboratórios clínicos envolve principalmente a avaliação do sistema de coagulação, sistema de anticoagulação e fibrinólise 14,15,16,17. O tempo de protrombina, o tempo de tromboplastina parcial ativada, o tempo de trombina e a razão normalizada internacional são comumente utilizados para avaliar os níveis de fatores de coagulação no sistema de coagulação18. No entanto, estudos recentes têm revelado que esses testes não refletem totalmente a hipercoagulabilidade de certas doenças19. Outros métodos de ensaio, como a tromboelastometria (TEG), o TEG rotacional e a análise de sonoclots, medem as alterações viscoelásticas do sangue total20,21. Uma vez que as amostras de sangue total contêm numerosas células sanguíneas e plaquetas, estes testes são mais susceptíveis de indicar o estado de coagulação da amostra como um todo. Alguns pesquisadores têm relatado o papel das células sanguíneas e plaquetas na atividade pró-coagulante22,23. Um estudo recente também descobriu que testes prévios de função da coagulação enfrentam dificuldades em detectar alterações na atividade pró-coagulante das micropartículas24. Portanto, foi proposta a hipótese de que a função pró-coagulante dos EVs pode ser avaliada por medidas viscoelásticas do tempo de coagulação ativado (TCA) em plasma rico em EV.
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Protocol
A coleta de amostras humanas foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica do Tianjin Medical University General Hospital. A coleta de sangue venoso humano seguiu rigorosamente a diretriz emitida pela Comissão Nacional de Saúde da China, ou seja, a Diretriz WS/T 661-2020 para Coleta de Amostras de Sangue Venoso. Resumidamente, o sangue foi coletado de indivíduos sadios com consentimento informado da veia da região anterior do braço, e as amostras foram misturadas com anticoagulante citrato de sódio a 3,2% na proporção de 1:9. Quando apenas espécimes de anticoagulante citrato de sódio foram coletados, o primeiro vaso de coleta foi descartado. O fluxo de processamento foi iniciado em até 0,5 h após a coleta das amostras. Indivíduos adultos saudáveis foram recrutados para coleta de amostras após a obtenção do consentimento informado. Os critérios de exclusão dos pacientes foram: (1) trombose intravascular recente, (2) comprometimento da função hepática e renal, (3) hipertensão, hiperlipidemia, diabetes e outras doenças crônicas, (4) tratamento com aspirina ou anticoagulante, (5) menstruação e gravidez.
1. Isolamento de plasma rico em EV
- Centrifugar as amostras a 120 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente para remover as células sanguíneas. O sobrenadante é o plasma rico em plaquetas. Em seguida, transfira o 1/2 superior do sobrenadante para um novo tubo de centrífuga com uma pipeta.
- Centrifugar o plasma rico em plaquetas a 1500 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente para remover as plaquetas. O sobrenadante é o plasma pobre em plaquetas. Em seguida, transfira o 1/2 superior do sobrenadante para um novo tubo de centrífuga.
- Centrifugar o plasma pobre em plaquetas a 13000 x g durante 2 minutos à temperatura ambiente para remover os detritos celulares. O sobrenadante é o plasma rico em EV. Em seguida, transfira o 1/2 superior do sobrenadante para um novo tubo de centrífuga para testes subsequentes.
2. Detecção de EV-ACT da amostra pelo analisador
- Ligue o analisador de coágulos (consulte a Tabela de Materiais) e pré-aqueça o instrumento a 37 °C. Instale a sonda descartável e o copo de teste e, em seguida, inicie o procedimento de controle de qualidade da máquina.
NOTA: Quando o valor do sinal de resistência viscosa na tela é exibido como uma linha reta, isso significa que a detecção não é interferida e o controle de qualidade do status do analisador é qualificado. O procedimento de teste pode ser iniciado após a qualificação do autoteste. - Insira informações de exemplo no sistema. Em seguida, transferir 200 μL de plasma rico em EV para a xícara teste, seguido por 20 mM 170 μL de cloreto de cálcio. Clique no botão Iniciar. A haste de agitação magnética no copo de teste misturará totalmente a amostra e o cloreto de cálcio. Feche a tampa e a sonda começará a detectar a mudança na resistência da amostra.
NOTA: Depois que o teste for concluído, o analisador solicitará automaticamente "teste concluído". O tempo de EV-ACT é exibido e registrado pelo sistema. O resultado é expresso na unidade de tempo "segundo". Descarte a sonda e teste o copo.
3. Controle de qualidade baseado em citometria de fluxo da amostra de plasma rico em EV
- Os EVs foram primeiramente identificados por seu tamanho (0,1-1 μm). Ajustar os parâmetros do citômetro de fluxo com antecedência e ajustar o "gate" do EV usando esferas de poliestireno disponíveis comercialmente (0,5, 0,9 e 3,0 μm) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A mistura de esferas consiste em esferas fluorescentes de diferentes diâmetros cobrindo a faixa de tamanho de microvesículas (0,5 e 0,9 μm) e plaquetas (0,9 μm e 3 μm). - Ajuste a tensão do Forward Scatter e do Side Scatter e certifique-se de que as microesferas de 0,9 μm caiam na região apropriada. A região do VE pode ser desenhada de acordo com o diâmetro da microesfera.
- Transferir 50 μL de plasma rico em EV para o tubo de fluxo, seguido por 450 μL de solução salina tampão fosfato filtrado. Misture bem o líquido no tubo de fluxo. Finalmente, detectar as amostras por citometria de fluxo25.
- Use partículas fluorescentes Ultra Rainbow (ver Tabela de Materiais) para quantificar o número de EVs.In breve, adicionar 10 μL das partículas à amostra antes da detecção do fluxo e calcular a concentração de EV usando a seguinte fórmula após a detecção da amostra estar completa: 10.120 * EV (#) / (microesferas * volume) * fator de diluição26.
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Representative Results
O tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV foi medido usando um analisador de método viscoelástico para medir o tempo de coagulação do plasma. A máquina é composta por quatro componentes principais: um conversor eletrônico de sinais, uma sonda, um tanque de detecção e um elemento de aquecimento (Figura 1A,B). A sonda utiliza oscilações de alta frequência e baixa amplitude para detectar mudanças na viscosidade do plasma. O controle de qualidade diário envolve principalmente o controle da qualidade do ar para avaliar a estabilidade da plataforma de teste e identificar quaisquer distúrbios físicos na sonda. O controle de qualidade de desempenho envolve testes com óleo de viscosidade padrão para garantir que o valor de resistência detectado pela sonda esteja dentro da faixa definida.
Após a obtenção de plasma rico em EV, os EVs foram medidos usando citometria de fluxo para controle de qualidade da amostra. Amostras não qualificadas exibem um aglomerado distinto com tamanho de partícula ligeiramente maior perto do "portão" do EV (Figura 2A). Em contraste, amostras qualificadas ricas em EV mostram que a maioria dos sinais está dentro do "gate" do EV como um único grupo (Figura 2B).
Para avaliar a concentração de EV em amostras de plasma ricas em EV de voluntários saudáveis, a centrifugação em supervelocidade (1.00.000 x g, 70 min) foi realizada. Os resultados revelaram que um aumento na concentração de EV encurtou EV-ACT, enquanto uma diminuição na concentração de EV prolongou EV-ACT (Figura 3A). O tempo EV-ACT pode apresentar uma correlação negativa com os níveis de VE. Várias amostras de pacientes clínicos foram examinadas, e os achados demonstraram que amostras de plasma rico em EV de pacientes com pré-eclâmpsia, fraturas de quadril e câncer de pulmão (da esquerda para a direita) tiveram tempos de TCE-VE significativamente menores em comparação com voluntários saudáveis (Figura 3B).
Em conclusão, um método experimental rápido e custo-efetivo para detectar a atividade pró-coagulante do EV foi preliminarmente estabelecido, sendo promissor para aplicações clínicas em exames à beira do leito.
Figura 1: Diagrama esquemático e imagem física do analisador de coágulos. (A) e (B) representam os principais componentes do analisador e as configurações de operação, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Citometria de fluxo representativa do EV no plasma rico em EV. (A) Amostras de plasma ricas em EV não qualificadas. (B) Amostras qualificadas de plasma rico em EV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos do EV-ACT da amostra. (A) Resultados do EV-ACT após a remoção do EV e concentração do EV em amostras ricas em EV de voluntários saudáveis (da esquerda para a direita, suspensão de sedimento após supercentrifugação, plasma rico em EV e sobrenadante após ultracentrifugação). (B) Resultados EV-ACT de amostras ricas em EV de voluntários e pacientes saudáveis (Da esquerda para a direita, pré-eclâmpsia, fratura de quadril, câncer de pulmão e voluntário saudável). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, a preparação de plasma rico em EV foi descrita, e a racionalidade do método foi verificada por citometria de fluxo. Posteriormente, as amostras de plasma recalcificadas foram analisadas quanto ao tempo de TCA utilizando um analisador de coágulos baseado nos princípios de viscoelasticidade24. Como mostrado na Figura 3A, a concentração de EVs obtidos por ultracentrifugação encurtou o tempo de EV-ACT, enquanto o sobrenadante após ultracentrifugação, que teve níveis reduzidos de EV, exibiu tempos de EV-ACT prolongados. Esses achados sugerem uma estreita relação entre os resultados do EV-ACT e os níveis de VE. Na Figura 3B, o TCE-VE de amostras de plasma de pacientes com pré-eclâmpsia, fraturas de quadril e câncer de pulmão foi comparado com voluntários saudáveis, revelando tempos significativamente menores de TCE-VE nos grupos da doença. Relatos prévios indicaram níveis elevados de EVs promotores de coagulação no plasma para essas doenças 27,28,29. No entanto, deve-se notar que outros fatores presentes no plasma podem influenciar os desfechos do ACT-EV, e uma exploração mais aprofundada desses fatores de influência é necessária. Este ensaio propõe reconhecer o papel crucial dos EVs no estado de hipercoagulabilidade de certas doenças e aborda a falta de um método de detecção rápido e de baixo custo para a atividade pró-coagulante dos EV.
Dentro do sistema de coleta de sangue isolado, as substâncias relacionadas à coagulação podem ser divididas em células sanguíneas, plaquetas, metabólitos celulares (principalmente EVs) e outros componentes "invisíveis" (como fatores de coagulação e fatores anticoagulantes)30,31,32. Dada a complexidade do mecanismo de coagulação, o sistema de detecção foi simplificado para plasma rico em EV para minimizar a interferência de outros fatores. As principais etapas desse processo incluem a prevenção da geração de EVs artificiais durante o processamento da amostra e a minimização da contaminação plaquetária. Portanto, é necessário iniciar o procedimento de centrifugação diferencial dentro de 0,5 h e completar a detecção dentro de 2 h após a coleta da amostra. Estudos prévios demonstraram que o uso de força centrífuga suficientemente alta e a retenção da metade superior do sobrenadante podem efetivamente reduzir a contaminação plaquetária33. A citometria de fluxo foi utilizada para detectar plaquetas residuais no plasma rico em EV, confirmando sua presença muito baixa. As amostras não qualificadas resultam principalmente da contaminação plaquetária e da fragmentação celular causada pelo processo de manuseio. A contaminação plaquetária é caracterizada pela presença de partículas fora do "portão" dos EVs, enquanto a fragmentação celular aparece como um aglomerado distinto dentro do "gate" dos EVs.
Estudos recentes têm confirmado níveis significativamente elevados de EVs plasmáticos em determinadas doenças34,35. Esses EVs promovem primariamente a coagulação através da presença de fosfatidilserina (PS) e fator tecidual (FT) em sua superfície. Portanto, o tempo de TCA do plasma rico em EV é amplamente dependente do nível de EVs coagulantes. Uma limitação deste teste é a necessidade de garantir que os níveis de fatores de coagulação não mudem significativamente na medida em que afetam o tempo de coagulação durante a análise EV-ACT. No entanto, estudos sobre mudanças nos níveis de fator de coagulação após o início da doença são relativamente escassos, e seu efeito sobre o TCE-EV precisa ser avaliado em novas pesquisas. Além disso, o uso excessivo de drogas anticoagulantes pode afetar significativamente os resultados do ACT EV, portanto, esse método não deve ser empregado durante esse tratamento.
Existem vários métodos para determinar EVs pró-coagulantes, cada um com suas vantagens e desvantagens. avaliaram a atividade pró-coagulante do EV misturando a suspensão do EV com plasma normal e observando o tempo de formação do coágulo sanguíneo em banho-maria a 37 °C36. Embora esse método seja simples, a observação subjetiva do tempo de formação do coágulo pode levar a variações nos resultados entre diferentes observadores. Patil e col. empregaram um ensaio de coagulação padronizado in house para teste de micropartículas pró-coagulantes usando veneno de víbora Russell em um coagulômetro semi-automatizado37. Este método de detecção utiliza equipamentos semiautomáticos, oferecendo alta eficiência e simplicidade. No entanto, a adição do veneno da víbora Russell para ativar o fator X ignora a presença de outros anticoagulantes no plasma, como a proteína lactaderina. Este método avalia os resultados com base no balanço entre EVs pró-coagulantes e componentes anticoagulantes no plasma, fornecendo uma reflexão mais precisa da função de coagulação da amostra de plasma.
Os testes de função de coagulação existentes concentram-se principalmente no tempo de ativação da trombina no sangue total ou no sangue rico em plaquetas, ou detectam deficiências nos fatores de coagulação24. O desenvolvimento de um método de teste para a atividade pró-coagulante de EV ajudará a elucidar o papel dos EVs na doença e em tratamentos futuros. O processo simples de preparação da amostra, envolvendo a adição de apenas CaCl2, torna o ensaio conveniente para os médicos determinarem rapidamente o estado funcional da coagulação dos pacientes. O teste EV-ACT é fácil de executar, com resultados disponíveis dentro de 10-15 minutos, tornando-o adequado para o desenvolvimento como um teste à beira do leito. Estudos anteriores identificaram provisoriamente aplicações do EV-ACT em pré-eclâmpsia, tumores e fraturas. Pesquisas futuras continuarão a explorar as perspectivas de aplicação clínica do EV-ACT.
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Disclosures
Todos os autores declararam não haver potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, bolsa nº 81930031, 81901525. Além disso, agradecemos a Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. por nos fornecer máquinas e orientação técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
References
- Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
- Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
- Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
- You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
- Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
- Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
- Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
- Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
- Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
- Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
- Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
- Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
- Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
- Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
- Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
- Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
- Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
- Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
- Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
- Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
- Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
- Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
- Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
- Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
- Kubo, H.
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
- Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
- Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
- Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
- Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
- Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
- Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
- Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
- Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).
