Summary
이 프로토콜은 EV의 응고 능력의 지표로 세포외 소포체(EV)가 풍부한 혈장의 사용을 조사합니다. EV가 풍부한 플라즈마는 차등 원심분리 및 후속 재석회화 과정을 통해 얻어집니다.
Abstract
다양한 질병에서 세포외 소포체(EV)의 역할은 특히 강력한 응고 활성으로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 그러나 임상 환경에서 EV의 응고 활성을 평가하기 위한 병상 검사가 시급히 필요합니다. 이 연구는 EV의 응고제 활성의 척도로 EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간을 사용할 것을 제안합니다. 나트륨 구연산 전혈을 얻기 위해 표준화된 절차를 사용한 후 EV가 풍부한 혈장을 얻기 위해 차등 원심분리를 수행했습니다. EV가 풍부한 플라즈마와 염화칼슘을 테스트 컵에 첨가하고 분석기를 사용하여 점탄성의 변화를 실시간으로 모니터링했습니다. EV-ACT라고 하는 EV가 풍부한 혈장의 자연 응고 시간을 측정했습니다. 그 결과, 건강한 지원자로부터 얻은 혈장에서 EV를 제거했을 때 EV-ACT가 크게 증가한 반면, EV가 농축되었을 때 EV-ACT가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, 자간전증, 고관절 골절 및 폐암의 인간 샘플에서 EV-ACT가 상당히 단축되어 혈장 EV 수치가 상승하고 혈액 과응고가 촉진되었음을 나타냅니다. 간단하고 빠른 시술을 통해 EV-ACT는 혈장 EV 수치가 높은 환자의 응고 기능을 평가하기 위한 병상 검사로서 가능성을 보여줍니다.
Introduction
혈액 응고 과잉에 의해 발생하는 혈전증은 뇌 외상(brain trauma)1, 자간전증(pre-eclampsia)2, 종양(tumors)3, 골절 환자(fracture patients)4 등 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 과응고성의 기전은 복잡하며, 최근에는 응고 장애에서 세포외 소포체(EV)의 역할이 강조되고 있습니다. EV는 직경이 10nm에서 1000nm에 이르는 세포막에서 분리되는 이중층 구조를 가진 소포 모양의 몸체입니다. 이는 다양한 질병 과정, 특히 응고 장애와 관련이 있다5. 여러 연구에서 EV가 혈전증 위험의 유망한 예측 인자로 확인되었습니다 6,7. EV의 응고 활성은 응고 인자, 주로 조직 인자(TF)와 포스파티딜세린(PS)의 발현에 따라 달라집니다. 강력한 프로응고제 활성을 가진 EV는 테나아제와 프로트롬빈 복합체의 촉매 효율을 크게 향상시켜 트롬빈 매개 피브리노겐과 국소 혈전증을 촉진한다8. EV의 높은 수준과 과응고성과의 인과 관계는 수많은 질병에서 관찰되었다9. 결과적으로, EV의 검출을 표준화하고 그들의 응고제 활성을 보고하는 것은 중요한 조사 영역이다10.
현재까지 EV의 응고 활성을 감지하는 데 사용할 수 있는 상용 키트는 소수에 불과합니다. 상업 회사에서 생산한 MP-활성 분석 및 MP-TF 분석은 혈장11에서 EV의 응고제 활성을 측정하는 데 사용되는 기능 분석입니다. 이 분석은 효소 결합 면역 흡착 분석과 유사한 원리를 사용하여 EV에서 PS 및 TF를 검출합니다. 그러나 이러한 키트는 비싸고 소수의 고급 연구 기관으로 제한됩니다. 이 프로세스는 복잡하고 시간이 많이 걸리기 때문에 임상 환경에서 구현하기가 어렵습니다. 또한, 상업적으로 개발된 프로코아응고제 인지질(PPL) 분석은 PS-free 혈장과 테스트 혈장을 혼합하여 응고 시간을 측정하여 PS 양성 EV의 수준을 정량적으로 검출한다12. 그러나 이러한 분석은 주로 EV의 PS 및 TF에 초점을 맞추고 순환 EV가12에 관여할 수 있는 다른 응고 경로를 간과합니다.
혈장 응고 시스템은 복잡하며 응고제, 항응고제, 섬유소 용해 시스템 및 혈장에 부유하는 EV를 포함하여 "보이지 않는" 구성 요소와 "보이는" 구성 요소로 구성됩니다. 생리학적으로 이러한 구성 요소는 동적 균형을 유지합니다. 병리학적 상태에서, 순환 중인 EV의 현저한 증가는 특히 뇌 외상, 자간전증, 골절 및 다양한 유형의 암 환자에서 과응고에 기여한다13. 현재 임상 실험실에서 응고 상태를 평가하는 것은 주로 응고 시스템, 항응고 시스템 및 섬유소 용해를 평가하는 것을 포함합니다 14,15,16,17. 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 트롬빈 시간 및 국제 정규화 비율은 일반적으로 응고 시스템18에서 응고 인자 수준을 평가하는 데 사용된다. 그러나 최근 연구에 따르면 이러한 검사는 특정 질병의 과응고 가능성을 완전히 반영하지 못한다19. 혈전 탄성 측정법(TEG), 회전 TEG 및 소노클로트 분석과 같은 다른 분석 방법은 전혈 점탄성 변화를 측정합니다20,21. 전혈 샘플에는 수많은 혈액 세포와 혈소판이 포함되어 있기 때문에 이러한 검사는 샘플 전체의 응고 상태를 나타낼 가능성이 더 큽니다. 일부 연구자들은 혈액 세포와 혈소판이 응고제 활성에서 차지하는 역할에 대해 보고했습니다 22,23. 최근 연구에서는 이전의 응고 기능 검사가 미세입자의 응고 활성의 변화를 감지하는 데 어려움을 겪는다는 사실도 발견했다24. 따라서 EV가 풍부한 혈장에서 활성화된 응고 시간(ACT)의 점탄성 측정으로 EV의 응고 기능을 평가할 수 있다는 가설이 제안되었습니다.
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Protocol
인체 검체 채취는 천진 의과대학 종합병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 인간 정맥혈 채취는 중국 국가위생건강위원회에서 발행한 지침, 즉 WS/T 661-2020 정맥혈 표본 채취 지침을 엄격히 따랐습니다. 간단히 말해서, 전방 상완 부위 정맥에서 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액을 수집하고, 샘플을 3.2% 구연산나트륨 항응고제를 1:9의 비율로 혼합했습니다. 구연산나트륨 항응고제 검체만 채취했을 때, 첫 번째 채취 용기는 폐기되었습니다. 처리 흐름은 샘플 수집 후 0.5시간 이내에 시작되었습니다. 건강한 성인 피험자는 정보에 입각한 동의를 얻은 후 샘플 수집을 위해 모집되었습니다. 환자 제외 기준은 (1) 최근 혈관 내 혈전증, (2) 간 및 신장 기능 장애, (3) 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 및 기타 만성 질환, (4) 아스피린 또는 항응고제 치료, (5) 월경 및 임신이었습니다.
1. EV가 풍부한 플라즈마의 분리
- 샘플을 실온에서 120 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈액 세포를 제거합니다. 상청액은 혈소판이 풍부한 혈장입니다. 그런 다음 상층액의 상부 1/2을 피펫이 있는 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 혈소판이 풍부한 혈장을 실온에서 1500 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈소판을 제거합니다. 상청액은 혈소판이 부족한 혈장입니다. 그런 다음 상층액의 상부 1/2을 새 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 혈소판이 부족한 혈장을 실온에서 13000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 상층액은 EV가 풍부한 혈장입니다. 그런 다음 후속 테스트를 위해 상층액의 상부 1/2을 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
2. 분석기에 의한 시료의 EV-ACT 검출
- 응고 분석기( 재료 표 참조)를 켜고 기기를 37°C로 예열합니다. 일회용 프로브와 테스트 컵을 설치한 다음 기계의 품질 관리 절차를 시작합니다.
알림: 화면에 점성 저항 신호 값이 직선으로 표시되면 감지가 방해받지 않고 분석기 상태의 품질 관리가 자격이 있음을 의미합니다. 자체 테스트가 검증된 후 테스트 절차를 시작할 수 있습니다. - 시스템에 샘플 정보를 입력합니다. 그런 다음 200μL의 EV가 풍부한 혈장을 테스트 컵으로 옮긴 다음 20mM 170μL의 염화칼슘을 옮깁니다. 시작 버튼을 클릭합니다. 테스트 컵의 자석 교반 막대는 샘플과 염화칼슘을 완전히 혼합합니다. 덮개를 닫으면 프로브가 샘플 저항의 변화를 감지하기 시작합니다.
알림: 테스트가 완료되면 분석기에서 자동으로 "테스트 완료"라는 메시지를 표시합니다. EV-ACT 시간이 시스템에 의해 표시되고 기록됩니다. 결과는 시간 단위 "초"로 표현됩니다. 프로브를 버리고 컵을 테스트하십시오.
3. EV가 풍부한 혈장 샘플의 유세포 분석 기반 품질 관리
- EV는 먼저 크기(0.1-1μm)로 식별되었습니다. 유세포 분석기의 파라미터를 미리 조정하고 시판되는 폴리스티렌 비드(0.5, 0.9 및 3.0μm)를 사용하여 EV의 "게이트"를 설정합니다( 재료 표 참조).
참고: 비드 혼합물은 미세소포(0.5 및 0.9μm)와 혈소판(0.9μm 및 3μm)의 크기 범위를 포괄하는 다양한 직경의 형광 구체로 구성됩니다. - 전방 산란과 측면 산란의 전압을 조정하고 0.9μm 마이크로스피어가 적절한 영역에 속하는지 확인합니다. EV 영역은 마이크로스피어의 직경에 따라 그릴 수 있습니다.
- 50μL의 EV가 풍부한 혈장을 플로우 튜브로 옮긴 다음 450μL의 여과된 인산염 완충 식염수를 전달합니다. 플로우 튜브에 액체를 완전히 혼합하십시오. 마지막으로, 유세포 분석(25)을 이용하여 샘플들을 검출한다.
- Ultra Rainbow Fluorescent Particles( 재료 표 참조)를 사용하여 브리프의 EVs.In 수를 정량화하고, 유동 검출 전에 샘플에 10μL의 입자를 추가하고, 샘플 검출이 완료된 후 10,120 * EV (#) / (마이크로비즈 * 부피) * 희석 계수26 공식을 사용하여 EV 농도를 계산합니다.
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Representative Results
EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간은 혈장 응고 시간 측정을 위해 점탄성 방법 분석기를 사용하여 측정하였다. 이 기계는 전자 신호 변환기, 프로브, 감지 탱크 및 발열체의 네 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다(그림 1A,B). 프로브는 고주파 및 저진폭 진동을 활용하여 플라즈마 점도의 변화를 감지합니다. 일상적인 품질 관리에는 주로 테스트 플랫폼의 안정성을 평가하고 프로브에 대한 물리적 장애를 식별하기 위한 공기 품질 관리가 포함됩니다. 성능 품질 관리에는 프로브에서 감지한 저항 값이 설정 범위 내에 있는지 확인하기 위해 표준 점도 오일로 테스트하는 작업이 포함됩니다.
EV가 풍부한 혈장을 얻은 후 시료 품질 관리를 위해 유세포 분석을 사용하여 EV를 측정했습니다. 비정규화 샘플은 EV의 "게이트" 근처에서 입자 크기가 약간 더 큰 뚜렷한 클러스터를 나타냅니다(그림 2A). 이와는 대조적으로, 적격한 EV가 풍부한 샘플은 대부분의 신호가 단일 그룹으로서 EV의 "게이트" 내에 있음을 보여줍니다(그림 2B).
건강한 지원자의 EV가 풍부한 혈장 샘플에서 EV 농도를 평가하기 위해 초고속 원심분리(1,00,000 x g, 70분)를 수행했습니다. 그 결과, EV 농도가 증가하면 EV-ACT가 단축되는 반면, EV 농도가 감소하면 EV-ACT가 연장되는 것으로 나타났습니다(그림 3A). EV-ACT 시간은 EV 수준과 음의 상관 관계를 나타낼 수 있습니다. 임상 환자의 여러 샘플을 조사한 결과, 자간전증, 고관절 골절 및 폐암 환자(왼쪽에서 오른쪽으로)의 EV가 풍부한 혈장 샘플이 건강한 지원자에 비해 EV-ACT 시간이 현저히 짧다는 것이 입증되었습니다(그림 3B).
결론적으로, EV 응고제 활성을 검출하기 위한 빠르고 비용 효율적인 실험 방법이 예비적으로 확립되어 병상 검사에서 임상 적용에 대한 가능성을 제시했습니다.
그림 1: 응고 분석기의 개략도 및 물리적 이미지. (A) 및 (B)는 각각 분석기의 주요 구성 요소와 작동 설정을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EV가 풍부한 혈장에서 EV의 대표적인 유세포 분석. (A) 부적격 EV가 풍부한 혈장 샘플. (B) 적격한 EV가 풍부한 혈장 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 샘플의 EV-ACT의 대표 결과. (A) 건강한 지원자의 EV가 풍부한 샘플에서 EV 제거 및 EV 농도 후 EV-ACT 결과(왼쪽에서 오른쪽으로, 초원심분리 후 침전물 현탁액, EV가 풍부한 플라즈마 및 초원심분리 후 상층액). (B) 건강한 지원자 및 환자로부터 얻은 EV가 풍부한 샘플의 EV-ACT 결과(왼쪽에서 오른쪽으로, 자간전증, 고관절 골절, 폐암 및 건강한 지원자). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 EV가 풍부한 혈장의 제조를 설명하고 유세포 분석을 사용하여 방법의 합리성을 검증했습니다. 이어서, 재석회화된 혈장 샘플은 점탄성 원리24에 기초한 응고 분석기를 사용하여 ACT 시간 동안 분석하였다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 초원심분리를 통해 얻은 EV의 농도는 EV-ACT 시간을 단축하는 것으로 나타났으며, EV 수준을 감소시킨 초원심분리 후 상층액은 EV-ACT 시간이 연장되는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 EV-ACT 결과와 EV 수준 사이에 밀접한 관계가 있음을 시사합니다. 그림 3B에서는 자간전증, 고관절 골절 및 폐암 환자의 혈장 샘플의 EV-ACT를 건강한 지원자와 비교하여 질병 그룹에서 EV-ACT 시간이 상당히 짧다는 것을 보여주었습니다. 이전 보고에 따르면 이러한 질병에 대한 혈장 내 응고 촉진 EV 수치가 상승했습니다 27,28,29. 그러나 혈장에 존재하는 다른 요인이 EV-ACT 결과에 영향을 미칠 수 있으며 이러한 영향 요인에 대한 추가 연구가 필요합니다. 이 분석법은 특정 질병의 과응고 상태에서 EV의 중요한 역할을 인식하고 EV 응고제 활성에 대한 저비용 및 신속한 검출 방법의 부족을 해결할 것을 제안합니다.
분리된 혈액 샘플 시스템 내에서 응고 관련 물질은 혈액 세포, 혈소판, 세포 대사 산물(주로 EV) 및 기타 "보이지 않는" 구성 요소(예: 응고 인자 및 항응고 인자)로 나눌 수 있습니다.30,31,32. 응고 메커니즘의 복잡성을 감안할 때, 검출 시스템은 다른 요인의 간섭을 최소화하기 위해 EV가 풍부한 플라즈마로 단순화되었습니다. 이 공정의 주요 단계에는 시료 처리 중 인공 EV 생성을 방지하고 혈소판 오염을 최소화하는 것이 포함됩니다. 따라서 0.5시간 이내에 차등 원심분리 절차를 시작하고 샘플 채취 후 2시간 이내에 검출을 완료해야 합니다. 종래의 연구들은 충분히 높은 원심력을 사용하고 상층액의 상부 1/2을 유지하는 것이 혈소판 오염을 효과적으로 감소시킬 수 있다는 것을 입증하였다33. 유세포 분석은 EV가 풍부한 혈장에서 잔류 혈소판을 검출하는 데 사용되어 매우 낮은 존재를 확인했습니다. 적격하지 않은 샘플은 주로 취급 공정으로 인한 혈소판 오염 및 세포 단편화로 인해 발생합니다. 혈소판 오염은 EV의 "게이트" 외부에 입자가 존재하는 것이 특징인 반면, 세포 단편화는 EV의 "게이트" 내에서 뚜렷한 클러스터로 나타납니다.
최근 연구에서는 특정 질병에서 혈장 EV 수치가 크게 상승한 것으로 확인되었습니다34,35. 이러한 EV는 주로 표면에 포스파티딜세린(PS)과 조직 인자(TF)가 존재하여 응고를 촉진합니다. 따라서 EV가 풍부한 혈장의 ACT 시간은 응고제 EV의 수준에 따라 크게 달라집니다. 이 테스트의 한 가지 한계는 응고 인자 수준이 EV-ACT 분석 중 응고 시간에 영향을 미치는 정도까지 크게 변하지 않도록 해야 한다는 것입니다. 그러나 질병 발병 후 응고 인자 수준의 변화에 대한 연구는 상대적으로 드물며, EV-ACT에 미치는 영향은 추가 연구에서 평가되어야 합니다. 또한 항응고제의 과도한 사용은 EV-ACT 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 이러한 치료 중에 이 방법을 사용해서는 안 됩니다.
응고제 EV를 결정하기 위한 몇 가지 방법이 있으며 각각 장점과 단점이 있습니다. Piwkham et al.은 EV 현탁액을 정상 혈장과 혼합하고 37°C의 수조에서 혈전 형성 시간을 관찰하여 EV 프로코아응고제 활성을 평가했다36. 이 방법은 간단하지만 혈전 형성 시간에 대한 주관적인 관찰은 다른 관찰자 간에 결과 변동을 유발할 수 있습니다. Patil et al.은 반자동 응고계37에서 Russell viper 독을 사용하여 응고제 미세입자 테스트를 위해 사내 표준화된 응고 분석을 사용했습니다. 이 탐지 방법은 반자동 장비를 사용하여 고효율과 단순성을 제공합니다. 그러나 X 인자를 활성화하기 위해 Russell viper 독을 첨가하는 것은 lactadherin 단백질과 같은 혈장 내 다른 항응고제의 존재를 간과합니다. 이 방법은 혈장 내 응고제 EV와 항응고제 성분 간의 균형을 기반으로 결과를 평가하여 혈장 샘플의 응고 기능을 보다 정확하게 반영합니다.
기존의 응고 기능 검사는 주로 전혈 또는 혈소판이 풍부한 혈액의 트롬빈 활성화 시간에 초점을 맞추거나 응고 인자의 결핍을 발견하는 데 중점을 둔다24. EV 응고제 활성에 대한 테스트 방법을 개발하면 질병 및 향후 치료에서 EV의 역할을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. CaCl2만 첨가하는 간단한 시료 전처리 공정으로 임상의가 환자의 응고 기능 상태를 신속하게 확인할 수 있습니다. EV-ACT 검사는 수행하기 쉽고 10-15분 이내에 결과를 얻을 수 있으므로 병상 검사로 개발하기에 적합합니다. 이전 연구에서는 자간전증, 종양 및 골절에 대한 EV-ACT의 적용을 잠정적으로 확인했습니다. 향후 연구는 EV-ACT의 임상 적용 가능성을 계속 탐구할 것입니다.
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Disclosures
모든 저자는 잠재적인 이해 상충이 없다고 선언했습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81930031, 81901525)의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 기계 및 기술 지침을 제공해 주신 Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
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