Summary
Denne protokol undersøger brugen af ekstracellulært vesikel (EV)-rigt plasma som en indikator for EV's koagulative evne. EV-rigt plasma opnås gennem en proces med differentiel centrifugering og efterfølgende genkalkning.
Abstract
Rollen af ekstracellulære vesikler (EV) i forskellige sygdomme får øget opmærksomhed, især på grund af deres potente prokoagulerende aktivitet. Der er dog et presserende behov for en sengetest for at vurdere EV's prokoagulerende aktivitet i kliniske omgivelser. Denne undersøgelse foreslår anvendelse af trombinaktiveringstid for EV-rig plasma som et mål for EVs prokoagulerende aktivitet. Standardiserede procedurer blev anvendt til at opnå natriumcitreret fuldblod efterfulgt af differentiel centrifugering for at opnå EV-rig plasma. Det EV-rige plasma og calciumchlorid blev tilsat til testkoppen, og ændringerne i viskoelasticitet blev overvåget i realtid ved hjælp af en analysator. Den naturlige koagulationstid for EV-rig plasma, kaldet EV-ACT, blev bestemt. Resultaterne afslørede en signifikant stigning i EV-ACT, når EV blev fjernet fra plasma opnået fra raske frivillige, mens den faldt signifikant, når EV blev beriget. Desuden blev EV-ACT betydeligt forkortet i humane prøver fra præeklampsi, hoftebrud og lungekræft, hvilket indikerer forhøjede niveauer af plasma EV og fremme af blodhyperkoagulation. Med sin enkle og hurtige procedure viser EV-ACT lovende som en sengetest til evaluering af koagulationsfunktionen hos patienter med høje plasma-EV-niveauer.
Introduction
Trombose, som er forårsaget af hyperkoagulabilitet, spiller en væsentlig rolle i forskellige sygdomme, herunder hjernetrauma1, præeklampsi2, tumorer3 og brudpatienter4. Mekanismen bag hyperkoagulabilitet er kompleks, og der er for nylig lagt vægt på ekstracellulære vesiklers (EV) rolle i koagulationsforstyrrelser. EV'er er vesikellignende legemer med en dobbeltlagsstruktur, der løsner sig fra cellemembranen, der spænder i diameter fra 10 nm til 1000 nm. De er forbundet med en række sygdomsprocesser, især koagulationsforstyrrelser5. Flere undersøgelser har identificeret elbiler som en lovende prædiktor for tromboserisiko 6,7. EV'ers prokoagulerende aktivitet afhænger af ekspressionen af koagulationsfaktorer, primært vævsfaktor (TF) og phosphatidylserin (PS). EV'er med robust prokoagulerende aktivitet forbedrer signifikant den katalytiske effektivitet af tenase- og protrombinkompleks og fremmer derved thrombinmedieret fibrinogen og lokal trombose8. Forhøjede niveauer af elbiler og deres årsagssammenhæng med hyperkoagulabilitet er blevet observeret i adskillige sygdomme9. Derfor er standardisering af detektion af elbiler og rapportering af deres prokoagulerende aktivitet et vigtigt undersøgelsesområde10.
Til dato er der kun få kommercielle sæt til rådighed til at detektere elbilers prokoagulerende aktivitet. MP-aktivitetsanalysen og MP-TF-assayet, produceret af en kommerciel virksomhed, er funktionelle assays, der bruges til at måle EV's prokoagulerende aktivitet i plasma11. Disse assays anvender et princip svarende til enzymbundne immunosorbentassays til påvisning af PS og TF på elbiler. Disse kits er dog dyre og begrænset til nogle få forskningsinstitutioner på højt niveau. Processen er kompleks og tidskrævende, hvilket gør det udfordrende at implementere dem i kliniske omgivelser. Derudover blander et kommercielt udviklet prokoagulant phospholipidassay (PPL) PS-frit plasma med testplasma og måler koagulationstiden for kvantitativt at detektere niveauer af PS-positive EV'er12. Disse analyser fokuserer dog primært på PS og TF på elbiler og overser andre koagulationsveje, som cirkulerende elbiler kan være involveret i12.
Plasmakoagulationssystemet er indviklet og omfatter både "usynlige" og "synlige" komponenter, herunder koaguleringsmidler, antikoagulantia, fibrinolytiske systemer og EV'er suspenderet i plasmaet. Fysiologisk opretholder disse komponenter en dynamisk balance. Under patologiske tilstande bidrager signifikant øgede EV'er i omløb til hyperkoagulabilitet, især hos patienter med hjernetraumer, præeklampsi, brud og forskellige former for kræft13. I øjeblikket involverer evalueringen af koagulationsstatus i kliniske laboratorier primært vurdering af koagulationssystemet, antikoagulationssystemet og fibrinolyse 14,15,16,17. Protrombintid, aktiveret partiel tromboplastintid, trombintid og internationalt normaliseret forhold anvendes almindeligvis til at evaluere koagulationsfaktorniveauer i koagulationssystemet18. Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at disse tests ikke fuldt ud afspejler visse sygdommes hyperkoagulerbarhed19. Andre analysemetoder, såsom tromboelastometri (TEG), rotations-TEG og Sonoclot-analyse, måler viskoelastiske ændringer i fuldblod 20,21. Da fuldblodsprøver indeholder adskillige blodlegemer og blodplader, er disse tests mere tilbøjelige til at indikere koagulationsstatus for prøven som helhed. Nogle forskere har rapporteret om blodcellernes og blodpladernes rolle i prokoagulerende aktivitet 22,23. En nylig undersøgelse opdagede også, at tidligere koagulationsfunktionstest står over for vanskeligheder med at detektere ændringer i mikropartiklers prokoagulerende aktivitet24. Derfor er der foreslået en hypotese om, at EV'ers prokoagulerende funktion kan evalueres ved viskoelastiske målinger af den aktiverede koagulationstid (ACT) i EV-rig plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Indsamlingen af humane prøver blev godkendt af den medicinske etiske komité på Tianjin Medical University General Hospital. Indsamlingen af humant venøst blod fulgte nøje retningslinjen udstedt af National Health Commission of China, nemlig WS / T 661-2020 retningslinje for indsamling af venøse blodprøver. Kort fortalt blev blod indsamlet fra raske individer med informeret samtykke fra den forreste brachialområdevene, og prøverne blev blandet under anvendelse af 3,2% natriumcitratantikoagulant i et forhold på 1:9. Når kun natriumcitratantikoagulerende prøver blev indsamlet, blev den første opsamlingsbeholder kasseret. Forarbejdningsflowet blev påbegyndt inden for 0,5 timer efter prøveindsamling. Voksne raske forsøgspersoner blev rekrutteret til prøveindsamling efter at have indhentet informeret samtykke. Patienteksklusionskriterier var: (1) en nylig intravaskulær trombose, (2) nedsat lever- og nyrefunktion, (3) hypertension, hyperlipidæmi, diabetes og andre kroniske sygdomme, (4) aspirin eller antikoagulerende behandling, (5) menstruation og graviditet.
1. Dyrkning af EV-rig plasma
- Centrifuger prøverne ved 120 x g i 20 minutter ved stuetemperatur for at fjerne blodlegemer. Supernatanten er trombocytrig plasma. Derefter overføres den øverste 1/2 af supernatanten til et nyt centrifugeglas med pipette.
- Det blodpladerige plasma centrifugeres ved 1500 x g i 20 minutter ved stuetemperatur for at fjerne blodpladerne. Supernatanten er blodpladefattigt plasma. Derefter overføres den øverste 1/2 af supernatanten til et nyt centrifugeglas.
- Centrifuger det blodpladefattige plasma ved 13000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur for at fjerne celleaffald. Supernatanten er EV-rig plasma. Derefter overføres den øverste 1/2 af supernatanten til et nyt centrifugeglas til efterfølgende testning.
2. Analysatorens påvisning af EV-ACT af prøven
- Tænd for koagulationsanalysatoren (se materialetabellen), og forvarm instrumentet til 37 °C. Installer engangssonden og testkoppen, og start derefter maskinens kvalitetskontrolprocedure.
BEMÆRK: Når den viskøse modstandssignalværdi på skærmen vises som en lige linje, betyder det, at detekteringen ikke forstyrres, og at kvalitetskontrol af analysatorstatus er kvalificeret. Testproceduren kan startes, når selvtesten er kvalificeret. - Indtast eksempeloplysninger i systemet. Derefter overføres 200 μL EV-rigt plasma til testkoppen efterfulgt af 20 mM 170 μL calciumchlorid. Klik på startknappen. Den magnetiske omrøringsstang i testkoppen blander prøven og calciumchlorid fuldt ud. Luk dækslet, og sonden begynder at registrere ændringen i prøvemodstand.
BEMÆRK: Når testen er afsluttet, vil analysatoren automatisk spørge "test afsluttet". Tidspunktet for EV-ACT vises og registreres af systemet. Resultatet udtrykkes i tidsenheden "sekund". Kassér sonden og test koppen.
3. Flowcytometribaseret kvalitetskontrol af den EV-rige plasmaprøve
- Elbiler blev først identificeret ved deres størrelse (0,1-1 μm). Juster parametrene for flowcytometeret på forhånd, og indstil "porten" til EV ved hjælp af kommercielt tilgængelige polystyrenperler (0,5, 0,9 og 3,0 μm) (se materialetabel).
BEMÆRK: Perleblandingen består af fluorescerende kugler med forskellige diametre, der dækker størrelsesområdet for mikrovesikler (0,5 og 0,9 μm) og blodplader (0,9 μm og 3 μm). - Juster spændingen på Forward Scatter og Side Scatter, og sørg for, at 0,9 μm mikrosfærerne falder i det relevante område. EV-regionen kan tegnes i henhold til mikrosfærens diameter.
- Der overføres 50 μL EV-rigt plasma til flowrøret efterfulgt af 450 μL filtreret fosfatbuffersaltvand. Bland væsken grundigt i flowrøret. Endelig detekteres prøverne ved hjælp af flowcytometri25.
- Brug Ultra Rainbow fluorescerende partikler (se materialetabel) til at kvantificere antallet af EVs.In kort, tilsæt 10 μL af partiklerne til prøven før flowdetektionen, og beregn EV-koncentrationen ved hjælp af følgende formel, når prøvedetekteringen er afsluttet: 10,120 * EV (#) / (mikroperler * volumen) * fortyndingsfaktor26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trombinaktiveringstiden for EV-rigt plasma blev målt ved hjælp af en viskoelastisk metodeanalysator til måling af plasmakoagulationstid. Maskinen består af fire hovedkomponenter: en elektronisk signalkonverter, en sonde, en detekteringstank og et varmeelement (figur 1A, B). Sonden anvender oscillationer med høj frekvens og lav amplitude til at detektere ændringer i plasmaviskositeten. Daglig kvalitetskontrol involverer primært luftkvalitetskontrol for at vurdere testplatformens stabilitet og identificere eventuelle fysiske forstyrrelser i sonden. Kvalitetskontrol af ydeevne involverer test med standard viskositetsolie for at sikre, at modstandsværdien detekteret af sonden falder inden for det indstillede område.
Efter opnåelse af EV-rig plasma blev EV'er målt ved hjælp af flowcytometri til prøvekvalitetskontrol. Ukvalificerede prøver udviser en tydelig klynge med lidt større partikelstørrelse nær EV's "port" (figur 2A). I modsætning hertil viser kvalificerede EV-rige prøver, at de fleste signaler falder inden for "porten" til EV som en enkelt gruppe (figur 2B).
For at evaluere EV-koncentrationen i EV-rige plasmaprøver fra raske frivillige blev der udført superhastighedscentrifugering (1,00,000 x g, 70 min). Resultaterne afslørede, at en stigning i EV-koncentrationen forkortede EV-ACT, mens et fald i EV-koncentrationen forlængede EV-ACT (figur 3A). EV-ACT-tid kan udvise en negativ korrelation med EV-niveauer. Flere prøver fra kliniske patienter blev undersøgt, og resultaterne viste, at EV-rige plasmaprøver fra patienter med præeklampsi, hoftefrakturer og lungekræft (fra venstre mod højre) havde signifikant kortere EV-ACT-tider sammenlignet med raske frivillige (figur 3B).
Afslutningsvis blev der foreløbigt etableret en hurtig og omkostningseffektiv eksperimentel metode til påvisning af EV-prokoagulerende aktivitet, hvilket gav løfte om kliniske anvendelser i sengeundersøgelser.
Figur 1: Det skematiske diagram og det fysiske billede af koagulationsanalysatoren. (A) og (B) repræsenterer henholdsvis analysatorens hovedkomponenter og driftsindstillingerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ flowcytometri af EV i EV-rig plasma. (A) Ukvalificerede EV-rige plasmaprøver. B) Kvalificerede EV-rige plasmaprøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater af stikprøvens EV-ACT. A) EV-ACT-resultater efter EV-fjernelse og EV-koncentration i EV-rige prøver fra raske frivillige (fra venstre mod højre, sedimentsuspension efter supercentrifugering, EV-rig plasma og supernatant efter ultracentrifugering). (B) EV-ACT-resultater af EV-rige prøver fra raske frivillige og patienter (Fra venstre mod højre, præeklampsi, hoftebrud, lungekræft og raske frivillige). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev fremstillingen af EV-rig plasma beskrevet, og metodens rationalitet blev verificeret ved hjælp af flowcytometri. Derefter blev de recalcified plasmaprøver analyseret for ACT-tid ved hjælp af en koagulationsanalysator baseret på viskoelasticitetsprincipper24. Som vist i figur 3A viste det sig, at koncentrationen af EV'er opnået ved ultracentrifugering forkortede EV-ACT-tiden, mens supernatanten efter ultracentrifugering, som havde reduceret EV-niveauerne, udviste forlængede EV-ACT-tider. Disse resultater tyder på en tæt sammenhæng mellem EV-ACT-resultater og EV-niveauer. I figur 3B blev EV-ACT af plasmaprøver fra patienter med præeklampsi, hoftefrakturer og lungekræft sammenlignet med raske frivillige, hvilket afslørede signifikant kortere EV-ACT-tider i sygdomsgrupperne. Tidligere rapporter har indikeret forhøjede niveauer af koagulationsfremmende EV'er i plasma for disse sygdomme 27,28,29. Det skal dog bemærkes, at andre faktorer, der er til stede i plasma, kan påvirke EV-ACT-resultaterne, og yderligere udforskning af disse påvirkende faktorer er berettiget. Denne analyse foreslår at anerkende EV'ernes afgørende rolle i den hyperkoagulerbare tilstand af visse sygdomme og adresserer manglen på en billig og hurtig detektionsmetode til EV-prokoagulerende aktivitet.
Inden for det isolerede blodprøvesystem kan koagulationsrelaterede stoffer opdeles i blodlegemer, blodplader, cellemetabolitter (hovedsageligt EV'er) og andre "usynlige" komponenter (såsom koagulationsfaktorer og antikoagulerende faktorer)30,31,32. I betragtning af koagulationsmekanismens kompleksitet blev detektionssystemet forenklet til EV-rigt plasma for at minimere interferens fra andre faktorer. De vigtigste trin i denne proces omfatter forebyggelse af generering af kunstige elbiler under prøvebehandling og minimering af blodpladekontaminering. Det er derfor nødvendigt at indlede differenscentrifugeringsproceduren inden for 0,5 timer og afslutte detektionen inden for 2 timer efter prøveopsamling. Tidligere undersøgelser har vist, at anvendelse af tilstrækkelig høj centrifugalkraft og fastholdelse af den øverste halvdel af supernatanten effektivt kan reducere trombocytkontaminering33. Flowcytometri blev brugt til at detektere resterende blodplader i EV-rig plasma, hvilket bekræfter deres meget lave tilstedeværelse. Ukvalificerede prøver skyldes primært trombocytkontaminering og cellefragmentering forårsaget af håndteringsprocessen. Trombocytforurening er karakteriseret ved tilstedeværelsen af partikler uden for "porten" til elbiler, mens cellefragmentering fremstår som en særskilt klynge inden for "porten" til elbiler.
Nylige undersøgelser har bekræftet signifikant forhøjede niveauer af plasma-EV'er i visse sygdomme34,35. Disse elbiler fremmer primært koagulation gennem tilstedeværelsen af phosphatidylserin (PS) og vævsfaktor (TF) på deres overflade. Derfor er ACT-tiden for EV-rig plasma i høj grad afhængig af niveauet af koagulerende EV'er. En begrænsning ved denne test er behovet for at sikre, at niveauerne af koagulationsfaktorer ikke ændres væsentligt i det omfang, de påvirker koagulationstiden under EV-ACT-analyse. Undersøgelser af ændringer i koagulationsfaktorniveauer efter sygdomsdebut er imidlertid relativt sjældne, og deres virkning på EV-ACT skal evalueres i yderligere forskning. Desuden kan overdreven brug af antikoagulerende lægemidler påvirke EV-ACT-resultaterne betydeligt, så denne metode bør ikke anvendes under en sådan behandling.
Der findes flere metoder til bestemmelse af prokoagulerende elbiler, hver med sine fordele og ulemper. Piwkham et al. evaluerede EV-prokoagulationsaktivitet ved at blande EV-suspension med normalt plasma og observere tidspunktet for dannelse af blodpropper i et vandbad ved 37 °C36. Selvom denne metode er enkel, kan den subjektive observation af koagulationsdannelsestid føre til resultatvariationer blandt forskellige observatører. Patil et al. anvendte et internt standardiseret koagulationsassay til prokoagulerende mikropartikeltest ved hjælp af Russell vipergift på et halvautomatisk koagulometer37. Denne detektionsmetode bruger halvautomatisk udstyr, der tilbyder høj effektivitet og enkelhed. Tilsætningen af Russell hugormegift for at aktivere faktor X overser imidlertid tilstedeværelsen af andre antikoagulantia i plasma, såsom lactadherinprotein. Denne metode vurderer resultater baseret på balancen mellem prokoagulerende EV'er og antikoagulerende komponenter i plasmaet, hvilket giver en mere nøjagtig afspejling af plasmaprøvens koagulationsfunktion.
Eksisterende koagulationsfunktionstest fokuserer primært på trombinaktiveringstid i fuldblod eller blodpladerigt blod eller påviser mangler i koagulationsfaktorer24. Udvikling af en testmetode til EV-prokoagulerende aktivitet vil hjælpe med at belyse EV'ers rolle i sygdom og fremtidige behandlinger. Den enkle prøveforberedelsesproces, der kun involverer tilsætning afCaCl2, gør analysen praktisk for klinikere til hurtigt at bestemme patienternes koagulationsfunktionsstatus. EV-ACT-testen er nem at udføre med resultater tilgængelige inden for 10-15 minutter, hvilket gør den velegnet til udvikling som sengetest. Tidligere undersøgelser har forsøgsvis identificeret anvendelser af EV-ACT i præeklampsi, tumorer og brud. Fremtidig forskning vil fortsætte med at udforske de kliniske anvendelsesmuligheder for EV-ACT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærede, at der ikke er nogen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China, bevilling nr. 81930031, 81901525. Derudover takker vi Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. for at give os maskiner og teknisk vejledning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
References
- Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
- Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
- Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
- You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
- Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
- Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
- Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
- Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
- Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
- Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
- Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
- Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
- Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
- Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
- Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
- Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
- Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
- Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
- Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
- Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
- Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
- Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
- Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
- Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
- Kubo, H.
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
- Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
- Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
- Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
- Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
- Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
- Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
- Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
- Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).
