Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

קביעת פעילות הקרישה של שלפוחית חוץ-תאית (EV) באמצעות זמן קרישה המופעל על ידי EV (EV-ACT)

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65661
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 4, 1,2, 1
1Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, 3Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, 4Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

Summary

פרוטוקול זה חוקר את השימוש בפלזמה עשירה בשלפוחית חוץ-תאית (EV) כאינדיקטור ליכולת הקרישה של EV. פלזמה עשירה ב- EV מתקבלת באמצעות תהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית והסתיידות לאחר מכן.

Abstract

תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) במחלות שונות זוכה לתשומת לב מוגברת, במיוחד בשל פעילותן החזקה כחומר קרישה. עם זאת, יש צורך דחוף בבדיקה ליד המיטה כדי להעריך את פעילות הקרישה של EV במסגרות קליניות. מחקר זה מציע להשתמש בזמן הפעלת תרומבין של פלזמה עשירה ברכב חשמלי כמדד לפעילות הקרישה של EV. נהלים סטנדרטיים ננקטו כדי להשיג דם שלם נתרן ציטרלי, ואחריו צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לקבל פלזמה עשירה EV. הפלזמה העשירה ברכב חשמלי וסידן כלורי נוספו לכוס הבדיקה, והשינויים בצמיגות נוטרו בזמן אמת באמצעות אנלייזר. זמן הקרישה הטבעי של פלזמה עשירה ב-EV, המכונה EV-ACT, נקבע. התוצאות הראו עלייה משמעותית ב-EV-ACT כאשר EV הוסר מפלזמה שהתקבלה ממתנדבים בריאים, בעוד שהיא ירדה משמעותית כאשר EV הועשר. יתר על כן, EV-ACT קוצר במידה ניכרת בדגימות אנושיות מרעלת הריון, שבר בירך וסרטן ריאות, מה שמצביע על רמות גבוהות של EV פלזמה וקידום קרישת יתר בדם. עם ההליך הפשוט והמהיר שלו, EV-ACT מראה הבטחה כמבחן ליד המיטה להערכת תפקוד הקרישה בחולים עם רמות גבוהות של EV בפלזמה.

Introduction

פקקת, הנגרמת על ידי קרישיות יתר, ממלאת תפקיד משמעותי במחלות שונות, כולל טראומה מוחית1, רעלת הריון2, גידולים3 וחולי שבר4. המנגנון העומד בבסיס קרישיות יתר הוא מורכב, ולאחרונה הושם דגש על תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) בהפרעות קרישה. כלי רכב חשמליים הם גופים דמויי שלפוחית בעלי מבנה דו-שכבתי המתנתקים מקרום התא, בקוטר שבין 10 ננומטר ל-1000 ננומטר. הם קשורים למגוון תהליכי מחלה, במיוחד הפרעות קרישה5. מספר מחקרים זיהו רכבים חשמליים כמנבא מבטיח לסיכון לפקקת 6,7. פעילות הקרישה של כלי רכב חשמליים תלויה בביטוי של גורמי קרישה, בעיקר גורם רקמה (TF) ופוספטידיל-סרין (PS). כלי רכב חשמליים בעלי פעילות פרוקוגנטית חזקה משפרים באופן משמעותי את היעילות הקטליטית של טנאז וקומפלקס פרותרומבין, ובכך מקדמים פיברינוגן בתיווך טרומבין ופקקת מקומית8. רמות גבוהות של כלי רכב חשמליים והקשר הסיבתי שלהם עם קרישיות יתר נצפו במחלות רבות9. לפיכך, סטנדרטיזציה של זיהוי כלי רכב חשמליים ודיווח על פעילותם המונעת קרישה היא תחום חשוב בחקירה10.

נכון להיום, רק ערכות מסחריות מעטות זמינות לאיתור פעילות הקרישה של כלי רכב חשמליים. בדיקת MP-Activity ובדיקת MP-TF, המיוצרת על ידי חברה מסחרית, הן בדיקות פונקציונליות המשמשות למדידת פעילות הקרישה של EV בפלזמה11. בדיקות אלה משתמשות בעיקרון דומה לזה של בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים כדי לזהות PS ו- TF על כלי רכב חשמליים. עם זאת, ערכות אלה יקרות ומוגבלות למספר מוסדות מחקר ברמה גבוהה. התהליך מורכב וגוזל זמן, ולכן קשה ליישם אותם במסגרות קליניות. בנוסף, בדיקת פוספוליפיד מקרישה (PPL) שפותחה באופן מסחרי מערבבת פלזמה נטולת PS עם פלסמת בדיקה, ומודדת את זמן הקרישה כדי לזהות כמותית רמות של PS-positive EVs12. עם זאת, בדיקות אלה מתמקדות בעיקר ב-PS וב-TF על כלי רכב חשמליים, תוך התעלמות ממסלולי קרישה אחרים שבהם כלי רכב חשמליים עשויים להיות מעורביםב-12.

מערכת קרישת הפלזמה מורכבת וכוללת רכיבים "בלתי נראים" ו"נראים", כולל חומרי קרישה, נוגדי קרישה, מערכות פיברינוליטיות ורכבים חשמליים המרחפים בפלזמה. מבחינה פיזיולוגית, רכיבים אלה שומרים על איזון דינמי. במצבים פתולוגיים, עלייה משמעותית במחזור הדם של כלי רכב חשמליים תורמת לקרישיות יתר, במיוחד בחולים עם טראומה מוחית, רעלת הריון, שברים וסוגים שונים של סרטן13. כיום, הערכת מצב הקרישה במעבדות קליניות כוללת בעיקר הערכת מערכת הקרישה, מערכת נוגדי הקרישה ופיברינוליזה 14,15,16,17. זמן פרותרומבין, זמן תרומבופלסטין חלקי פעיל, זמן תרומבין ויחס מנורמל בינלאומי משמשים בדרך כלל להערכת רמות פקטורי הקרישה במערכת הקרישה18. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו כי בדיקות אלה אינן משקפות באופן מלא את קרישיות יתר של מחלות מסוימות19. שיטות בדיקה אחרות, כגון טרומבואלסטומטריה (TEG), TEG סיבובי וניתוח סונוקרוט מודדות שינויים ויסקו-אלסטיים בדם מלא20,21. מכיוון שדגימות דם שלמות מכילות תאי דם וטסיות דם רבים, בדיקות אלה נוטות יותר להצביע על מצב הקרישה של הדגימה בכללותה. כמה חוקרים דיווחו על תפקידם של תאי דם וטסיות בפעילות קרישה22,23. מחקר שנערך לאחרונה גילה גם כי בדיקות קודמות של תפקודי קרישה נתקלות בקשיים באיתור שינויים בפעילות הקרישה של מיקרו-חלקיקים24. לכן, הוצעה השערה כי ניתן להעריך את פונקציית הקרישה של כלי רכב חשמליים על ידי מדידות ויסקו-אלסטיות של זמן הקרישה הפעיל (ACT) בפלזמה עשירה ב-EV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

איסוף דגימות האדם אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הכללי של האוניברסיטה הרפואית בטיאן-ג'ין. איסוף הדם הוורידי האנושי עקב בקפדנות אחר ההנחיה שפורסמה על ידי ועדת הבריאות הלאומית של סין, כלומר WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. בקצרה, נאסף דם מאנשים בריאים בהסכמה מדעת מווריד האזור הברכיאלי הקדמי, והדגימות עורבבו באמצעות נוגד קרישה נתרן ציטראט 3.2% ביחס של 1:9. כאשר נאספו רק דגימות נוגדות קרישה של נתרן ציטראט, כלי האיסוף הראשון הושלך לפח. זרימת העיבוד החלה תוך 0.5 שעות מאיסוף הדגימה. נבדקים בריאים בוגרים גויסו לאיסוף דגימות לאחר קבלת הסכמה מדעת. קריטריוני אי הכללת המטופל היו: (1) פקקת תוך וסקולרית לאחרונה, (2) פגיעה בתפקוד הכבד והכליות, (3) יתר לחץ דם, היפרליפידמיה, סוכרת ומחלות כרוניות אחרות, (4) טיפול באספירין או נוגדי קרישה, (5) וסת והריון.

1. בידוד פלזמה עשירה ברכב חשמלי

  1. צנטריפוגה את הדגימות ב 120 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר תאי דם. הסופרנאטנט הוא פלזמה עשירה בטסיות. לאחר מכן, מעבירים את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש עם פיפטה.
  2. צנטריפוגה את הפלזמה עשירה טסיות ב 1500 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את טסיות. הסופרנאטנט הוא פלזמה ענייה בטסיות. לאחר מכן מעבירים את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש.
  3. צנטריפוגה את הפלזמה ענייה טסיות ב 13000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת התא. הסופרנאטנט הוא פלזמה עשירה ב-EV. לאחר מכן, העבירו את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש לבדיקה הבאה.

2. זיהוי EV-ACT של הדגימה על ידי המנתח

  1. הפעל את מנתח הקריש (ראה טבלת חומרים) וחמם את המכשיר ל- 37 מעלות צלזיוס. התקן את הבדיקה החד פעמית ואת הבדיקה ולאחר מכן התחל את הליך בקרת האיכות של המכונה.
    הערה: כאשר ערך אות ההתנגדות הצמיגה על המסך מוצג כקו ישר, פירוש הדבר שהזיהוי אינו מופרע ובקרת האיכות של מצב המנתח מוסמכת. ניתן להתחיל בהליך הבדיקה לאחר אישור הבדיקה העצמית.
  2. הזן מידע לדוגמה במערכת. לאחר מכן, העבירו 200 מיקרוליטר של פלזמה עשירה ברכב חשמלי לכוס הבדיקה, ולאחר מכן 20 מילימטר 170 מיקרוליטר של סידן כלורי. לחץ על לחצן התחל. מוט הערבוב המגנטי בכוס הבדיקה יערבב באופן מלא את הדגימה עם סידן כלורי. סגור את הכיסוי, והבדיקה תתחיל לזהות את השינוי בהתנגדות הדגימה.
    הערה: לאחר סיום הבדיקה, המנתח יבקש באופן אוטומטי "הבדיקה הושלמה". הזמן של EV-ACT מוצג ונרשם על ידי המערכת. התוצאה באה לידי ביטוי ביחידת הזמן "שנייה". השליכו את הבדיקה ובדקו את הכוס.

3. בקרת איכות מבוססת ציטומטריה של זרימה של דגימת פלזמה עשירה ברכב חשמלי

  1. כלי רכב חשמליים זוהו לראשונה לפי גודלם (0.1-1 מיקרומטר). התאם מראש את הפרמטרים של ציטומטר הזרימה והגדר את "השער" של EV באמצעות חרוזי פוליסטירן הזמינים מסחרית (0.5, 0.9 ו- 3.0 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים).
    הערה: תערובת החרוזים מורכבת מכדורי פלורסנט בקטרים שונים המכסים את טווח הגדלים של מיקרו-שלפוחיות (0.5 ו-0.9 מיקרומטר) וטסיות דם (0.9 מיקרומטר ו-3 מיקרומטר).
  2. כוונן את המתח של הפיזור הקדמי והפיזור הצדדי, וודא שהמיקרוספרות בגודל 0.9 מיקרומטר נופלות באזור המתאים. ניתן לצייר את אזור הרכב החשמלי על פי קוטר המיקרספרה.
  3. העבירו 50 μL של פלזמה עשירה ב-EV לתוך צינור הזרימה, ולאחר מכן 450 μL של מלח חיץ פוספט מסונן. מערבבים היטב את הנוזל בצינור הזרימה. לבסוף, זהה את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה25.
  4. השתמש בחלקיקים פלואורסצנטיים של קשת אולטרה (ראה טבלת חומרים) כדי לכמת את מספר EVs.In הקצר, הוסף 10 μL של החלקיקים לדגימה לפני זיהוי הזרימה, וחשב את ריכוז EV באמצעות הנוסחה הבאה לאחר השלמת זיהוי הדגימה: 10,120 * EV (#) / (microbeads * נפח) * גורם דילול26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זמן הפעלת הטרומבין של פלזמה עשירה ברכב חשמלי נמדד באמצעות מנתח שיטה ויסקו-אלסטית למדידת זמן קרישת פלזמה. המכונה מורכבת מארבעה רכיבים עיקריים: ממיר אותות אלקטרוניים, גשוש, מיכל גילוי וגוף חימום (איור 1A,B). הגשושית משתמשת בתנודות בתדירות גבוהה ומשרעת נמוכה כדי לזהות שינויים בצמיגות הפלזמה. בקרת איכות יומית כוללת בעיקר בקרת איכות אוויר כדי להעריך את יציבות פלטפורמת הבדיקה ולזהות הפרעות פיזיות לבדיקה. בקרת איכות הביצועים כוללת בדיקה עם שמן צמיגות סטנדרטי כדי להבטיח שערך ההתנגדות שזוהה על ידי הגשושית נופל בטווח שנקבע.

לאחר קבלת פלזמה עשירה ב-EV, כלי רכב חשמליים נמדדו באמצעות ציטומטריית זרימה לבקרת איכות דגימה. דגימות לא מוסמכות מציגות צביר מובחן עם גודל חלקיקים מעט גדול יותר ליד "השער" של EV (איור 2A). לעומת זאת, דגימות מוסמכות עשירות ברכב חשמלי מראות שרוב האותות נמצאים בתוך ה"שער" של הרכב החשמלי כקבוצה אחת (איור 2B).

כדי להעריך את ריכוז הרכב החשמלי בדגימות פלזמה עשירות ברכב חשמלי ממתנדבים בריאים, בוצעה צנטריפוגה סופר-מהירה (1,00,000 x גרם, 70 דקות). התוצאות הראו שעלייה בריכוז הרכב החשמלי קיצרה את ה-EV-ACT, בעוד שירידה בריכוז הרכב החשמלי האריכה את ה-EV-ACT (איור 3A). זמן EV-ACT עשוי להציג מתאם שלילי עם רמות EV. נבדקו מספר דגימות מחולים קליניים, והממצאים הראו כי דגימות פלזמה עשירות ב-EV מחולים עם רעלת הריון, שברים בירך וסרטן ריאות (משמאל לימין) היו קצרות משמעותית בהשוואה למתנדבים בריאים (איור 3B).

לסיכום, שיטה ניסיונית מהירה וחסכונית לאיתור פעילות מעודדי קרישה של EV נקבעה באופן ראשוני, וטומנת בחובה הבטחה ליישומים קליניים בבדיקות ליד המיטה.

Figure 1
איור 1: התרשים הסכמטי והתמונה הפיזית של מנתח הקריש. (A) ו-(B) מייצגים את המרכיבים העיקריים של המנתח, ואת הגדרות הפעולה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ציטומטריית זרימה מייצגת של EV בפלזמה עשירה ב-EV. (A) דגימות פלזמה עשירות ברכב חשמלי בלתי מסויגות. (B) דגימות פלזמה מוסמכות עשירות ברכב חשמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות מייצגות של EV-ACT של המדגם. (A) תוצאות EV-ACT לאחר הסרת EV וריכוז EV בדגימות עשירות EV ממתנדבים בריאים (משמאל לימין, השעיית משקעים לאחר צנטריפוגה על, פלזמה עשירה ברכב חשמלי וסופרנאטנט לאחר אולטרה-צנטריפוגה). (B) תוצאות EV-ACT של דגימות עשירות ברכב חשמלי ממתנדבים וחולים בריאים (משמאל לימין, רעלת הריון, שבר בירך, סרטן ריאות ומתנדב בריא). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה תוארה הכנת פלזמה עשירה ב-EV, ורציונליות השיטה אומתה באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, דגימות הפלזמה המסוידות נותחו במשך זמן ACT באמצעות מנתח קריש המבוסס על עקרונות צמיגות24. כפי שניתן לראות באיור 3A, נמצא כי ריכוז כלי הרכב החשמליים המתקבלים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה מקצר את זמן ה-EV-ACT, בעוד שהסופרנאטנט לאחר אולטרה-צנטריפוגה, אשר הפחית את רמות ה-EV, הציג זמני EV-ACT ממושכים. ממצאים אלה מצביעים על קשר הדוק בין תוצאות EV-ACT לבין רמות הרכב החשמלי. באיור 3B, דגימות EV-ACT של פלזמה ממטופלים עם רעלת הריון, שברים בירך וסרטן ריאות הושוו למתנדבים בריאים, וחשפו זמני EV-ACT קצרים יותר באופן משמעותי בקבוצות המחלה. דיווחים קודמים הצביעו על רמות גבוהות של כלי רכב חשמליים מקדמי קרישה בפלזמה למחלות אלה 27,28,29. עם זאת, יש לציין כי גורמים אחרים הקיימים בפלזמה עשויים להשפיע על תוצאות EV-ACT, ויש צורך בחקירה נוספת של גורמים משפיעים אלה. בדיקה זו מציעה להכיר בתפקיד המכריע של כלי רכב חשמליים במצב קרישיות יתר של מחלות מסוימות ומטפלת בהיעדר שיטת זיהוי זולה ומהירה לפעילות קרישה של כלי רכב חשמליים.

בתוך מערכת דגימות הדם המבודדת, ניתן לחלק חומרים הקשורים לקרישה לתאי דם, טסיות דם, מטבוליטים של תאים (בעיקר EVs), ורכיבים "בלתי נראים" אחרים (כגון גורמי קרישה וגורמים נוגדי קרישה)30,31,32. בהתחשב במורכבות מנגנון הקרישה, מערכת הזיהוי פושטה לפלזמה עשירה ברכב חשמלי כדי למזער הפרעות מגורמים אחרים. צעדים מרכזיים בתהליך זה כוללים מניעת ייצור של כלי רכב חשמליים מלאכותיים במהלך עיבוד הדגימה ומזעור זיהום טסיות. לכן, יש צורך ליזום את הליך הצנטריפוגה הדיפרנציאלית בתוך 0.5 שעות ולהשלים את הגילוי בתוך 2 שעות לאחר איסוף הדגימה. מחקרים קודמים הוכיחו כי שימוש בכוח צנטריפוגלי גבוה מספיק ושמירה על המחצית העליונה של הסופרנאטנט יכולים להפחית ביעילות את זיהום טסיותהדם 33. ציטומטריית זרימה שימשה לאיתור שאריות טסיות בפלזמה עשירה ב- EV, מה שאישר את נוכחותן הנמוכה מאוד. דגימות בלתי מוסמכות נובעות בעיקר מזיהום טסיות ופיצול תאים הנגרם על ידי תהליך הטיפול. זיהום טסיות מאופיין בנוכחות חלקיקים מחוץ ל"שער" של כלי רכב חשמליים, בעוד פיצול תאים מופיע כאשכול נפרד בתוך "שער" הרכבים החשמליים.

מחקרים אחרונים אישרו רמות גבוהות משמעותית של פלזמה EVs במחלות מסוימות34,35. כלי רכב חשמליים אלה מקדמים קרישה בעיקר באמצעות נוכחות של פוספטידיל-סרין (PS) וגורם רקמה (TF) על פני השטח שלהם. לכן, זמן ה-ACT של פלזמה עשירה ברכב חשמלי תלוי במידה רבה ברמת כלי הרכב החשמליים הקרישיים. מגבלה אחת של בדיקה זו היא הצורך להבטיח כי רמות גורמי הקרישה אינן משתנות באופן משמעותי במידה שהם משפיעים על זמן הקרישה במהלך ניתוח EV-ACT. עם זאת, מחקרים על שינויים ברמות פקטורי הקרישה לאחר הופעת המחלה הם נדירים יחסית, ויש להעריך את השפעתם על EV-ACT במחקר נוסף. יתר על כן, שימוש מופרז בתרופות נוגדות קרישה יכול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות EV-ACT, ולכן אין להשתמש בשיטה זו במהלך טיפול כזה.

קיימות מספר שיטות לקביעת כלי רכב חשמליים מקרישי דם, שלכל אחת מהן יתרונות וחסרונות. Piwkham et al. העריכו את פעילות קרישה EV על ידי ערבוב תרחיף EV עם פלזמה רגילה והתבוננות בזמן היווצרות קריש דם באמבט מים ב 37 ° C36. למרות ששיטה זו פשוטה, התצפית הסובייקטיבית על זמן היווצרות הקריש יכולה להוביל לשינויים בתוצאות בין צופים שונים. Patil et al. השתמשו בבדיקת קרישה סטנדרטית פנימית לבדיקת מיקרו-חלקיקים מעודדי קרישה באמצעות ארס צפע ראסל על מד קרישהחצי אוטומטי 37. שיטת זיהוי זו משתמשת בציוד חצי אוטומטי, המציע יעילות ופשטות גבוהות. עם זאת, תוספת ארס צפע ראסל להפעלת פקטור X מתעלמת מנוכחותם של נוגדי קרישה אחרים בפלזמה, כגון חלבון לקטדהרין. שיטה זו מעריכה תוצאות בהתבסס על האיזון בין כלי רכב חשמליים מעודדי קרישה לבין רכיבים נוגדי קרישה בפלזמה, ומספקת השתקפות מדויקת יותר של פונקציית הקרישה של דגימת הפלזמה.

בדיקות תפקודי הקרישה הקיימות מתמקדות בעיקר בזמן הפעלת תרומבין בדם שלם או בדם עשיר בטסיות, או מזהות ליקויים בגורמי קרישה24. פיתוח שיטת בדיקה לפעילות מעודדי קרישה של EV יסייע להבהיר את תפקידם של כלי רכב חשמליים במחלות ובטיפולים עתידיים. תהליך הכנת הדגימה הפשוט, הכולל תוספת של CaCl2 בלבד, הופך את הבדיקה לנוחה עבור רופאים לקבוע במהירות את מצב תפקוד הקרישה של המטופלים. מבחן EV-ACT קל לביצוע, עם תוצאות זמינות תוך 10-15 דקות, מה שהופך אותו מתאים היטב לפיתוח כמבחן ליד המיטה. מחקרים קודמים זיהו באופן טנטטיבי יישומים של EV-ACT ברעלת הריון, גידולים ושברים. מחקר עתידי ימשיך לחקור את סיכויי היישום הקליני של EV-ACT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים הצהירו כי אין ניגודי עניינים פוטנציאליים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מענק מס '81930031, 81901525. בנוסף, אנו מודים לטיינג'ין Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. על שסיפקה לנו מכונות והדרכה טכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA For quantitative detection of MP
Calcium chloride Werfen (china) 0020006800 20 mM
Century Clot analyzer Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer BD, USA Used to detect MP
Megamix polystyrene beads Biocytex, Marseille, France 7801 The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68 (2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

Tags

רפואה גיליון 198 זמן קרישה המופעל על ידי EV בדיקת לילה זמן הפעלת טרומבין דם שלם נתרן ציטרציה צנטריפוגה דיפרנציאלית פלזמה עשירה ב- EV צמיגות סידן כלורי אנלייזר זמן קרישה טבעי EV-ACT מתנדבים בריאים רעלת הריון שבר בירך סרטן ריאות קרישת יתר בדם תפקוד קרישה
קביעת פעילות הקרישה של שלפוחית חוץ-תאית (EV) באמצעות זמן קרישה המופעל על ידי EV (EV-ACT)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, Y., Li, K., Qin, Q., Zhang, J., … More

Gao, Y., Li, K., Qin, Q., Zhang, J., Liu, L. Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT). J. Vis. Exp. (198), e65661, doi:10.3791/65661 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter