Summary
Questo protocollo studia l'uso del plasma ricco di vescicole extracellulari (EV) come indicatore della capacità coagulativa delle vescicole extracellulari. Il plasma ricco di EV si ottiene attraverso un processo di centrifugazione differenziale e successiva ricalcificazione.
Abstract
Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) in varie malattie sta guadagnando sempre più attenzione, in particolare a causa della loro potente attività procoagulante. Tuttavia, c'è un urgente bisogno di un test al letto del paziente per valutare l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari in ambito clinico. Questo studio propone l'uso del tempo di attivazione della trombina del plasma ricco di EV come misura dell'attività procoagulante di EV. Sono state impiegate procedure standardizzate per ottenere sangue intero citrato di sodio, seguite da centrifugazione differenziale per ottenere plasma ricco di EV. Il plasma ricco di EV e il cloruro di calcio sono stati aggiunti alla coppetta di prova e le variazioni della viscoelasticità sono state monitorate in tempo reale utilizzando un analizzatore. È stato determinato il tempo di coagulazione naturale del plasma ricco di EV, denominato EV-ACT. I risultati hanno rivelato un aumento significativo dell'EV-ACT quando l'EV è stato rimosso dal plasma ottenuto da volontari sani, mentre è diminuito significativamente quando l'EV è stato arricchito. Inoltre, l'EV-ACT è stato considerevolmente ridotto nei campioni umani di preeclampsia, frattura dell'anca e cancro del polmone, indicando livelli elevati di EV plasmatica e la promozione dell'ipercoagulazione del sangue. Con la sua procedura semplice e rapida, EV-ACT si mostra promettente come test al letto del paziente per valutare la funzione della coagulazione in pazienti con alti livelli plasmatici di EV.
Introduction
La trombosi, causata dall'ipercoagulabilità, svolge un ruolo significativo in varie malattie, tra cui il trauma cerebrale1, la pre-eclampsia2, i tumori3 e i pazienti con fratture4. Il meccanismo alla base dell'ipercoagulabilità è complesso e recentemente è stata posta l'enfasi sul ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nei disturbi della coagulazione. Le vescicole extracellulari sono corpi simili a vescicole con una struttura a doppio strato che si staccano dalla membrana cellulare, con un diametro compreso tra 10 nm e 1000 nm. Sono associati a una varietà di processi patologici, in particolare ai disturbi della coagulazione5. Diversi studi hanno identificato le vescicole extracellulari come un promettente predittore del rischio di trombosi 6,7. L'attività procoagulante delle vescicole extracellulari dipende dall'espressione dei fattori della coagulazione, principalmente il fattore tissutale (TF) e la fosfatidilserina (PS). Le vescicole extracellulari con una robusta attività procoagulante migliorano significativamente l'efficienza catalitica della tenasi e del complesso protrombinico, promuovendo così il fibrinogeno mediato dalla trombina e la trombosi locale8. Livelli elevati di vescicole extracellulari e la loro relazione causale con l'ipercoagulabilità sono stati osservati in numerose malattie9. Di conseguenza, la standardizzazione del rilevamento delle vescicole extracellulari e la segnalazione della loro attività procoagulante è un'importante area di indagine10.
Ad oggi, sono disponibili solo pochi kit commerciali per rilevare l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari. Il saggio MP-Activity e il test MP-TF, prodotti da un'azienda commerciale, sono saggi funzionali utilizzati per misurare l'attività procoagulante di EV nel plasma11. Questi saggi impiegano un principio simile a quello dei saggi di immunoassorbimento enzimatico per rilevare PS e TF sulle vescicole extracellulari. Tuttavia, questi kit sono costosi e limitati a pochi istituti di ricerca di alto livello. Il processo è complesso e richiede molto tempo, il che rende difficile implementarli in ambito clinico. Inoltre, un test di fosfolipidi procoagulanti (PPL) sviluppato commercialmente mescola il plasma privo di PS con il plasma di prova, misurando il tempo di coagulazione per rilevare quantitativamente i livelli di EV PS-positivi12. Tuttavia, questi saggi si concentrano principalmente su PS e TF sulle vescicole extracellulari, trascurando altre vie di coagulazione in cui le vescicole extracellulari circolanti possono essere coinvolte12.
Il sistema di coagulazione plasmatica è complesso e comprende sia componenti "invisibili" che "visibili", tra cui coagulanti, anticoagulanti, sistemi fibrinolitici e vescicole extracellulari sospese nel plasma. Fisiologicamente, questi componenti mantengono un equilibrio dinamico. In condizioni patologiche, un aumento significativo delle vescicole extracellulari in circolo contribuisce all'ipercoagulabilità, in particolare nei pazienti con traumi cerebrali, preeclampsia, fratture e vari tipi di cancro13. Attualmente, la valutazione dello stato della coagulazione nei laboratori clinici coinvolge principalmente la valutazione del sistema di coagulazione, del sistema anticoagulante e della fibrinolisi 14,15,16,17. Il tempo di protrombina, il tempo di tromboplastina parziale attivata, il tempo di trombina e il rapporto normalizzato internazionale sono comunemente usati per valutare i livelli di fattore della coagulazione nel sistema di coagulazione18. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che questi test non riflettono pienamente l'ipercoagulabilità di alcune malattie19. Altri metodi di analisi, come la tromboelastometria (TEG), il TEG rotazionale e l'analisi Sonoclot, misurano le variazioni viscoelastiche del sangue intero20,21. Poiché i campioni di sangue intero contengono numerose cellule del sangue e piastrine, è più probabile che questi test indichino lo stato di coagulazione del campione nel suo complesso. Alcuni ricercatori hanno riportato il ruolo delle cellule del sangue e delle piastrine nell'attività procoagulante22,23. Uno studio recente ha anche scoperto che i precedenti test di funzionalità della coagulazione incontrano difficoltà nel rilevare i cambiamenti nell'attività procoagulante delle microparticelle24. Pertanto, è stata proposta l'ipotesi che la funzione procoagulante delle vescicole extracellulari possa essere valutata mediante misurazioni viscoelastiche del tempo di coagulazione attivato (ACT) nel plasma ricco di vescicole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La raccolta di campioni umani è stata approvata dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale Generale dell'Università Medica di Tianjin. La raccolta del sangue venoso umano ha seguito rigorosamente le linee guida emesse dalla Commissione sanitaria nazionale cinese, ovvero WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. In breve, il sangue è stato raccolto da individui sani con il consenso informato dalla vena dell'area brachiale anteriore e i campioni sono stati miscelati utilizzando l'anticoagulante citrato di sodio al 3,2% in un rapporto di 1:9. Quando sono stati raccolti solo campioni di anticoagulanti di citrato di sodio, il primo recipiente di raccolta è stato scartato. Il flusso di elaborazione è stato avviato entro 0,5 ore dalla raccolta del campione. Soggetti adulti sani sono stati reclutati per la raccolta del campione dopo aver ottenuto il consenso informato. I criteri di esclusione dei pazienti erano: (1) una recente trombosi intravascolare, (2) compromissione della funzionalità epatica e renale, (3) ipertensione, iperlipidemia, diabete e altre malattie croniche, (4) aspirina o trattamento anticoagulante, (5) mestruazioni e gravidanza.
1. Isolamento di plasma ricco di EV
- Centrifugare i campioni a 120 x g per 20 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le cellule del sangue. Il surnatante è il plasma ricco di piastrine. Quindi, trasferire la metà superiore del surnatante in una nuova provetta da centrifuga con una pipetta.
- Centrifugare il plasma ricco di piastrine a 1500 x g per 20 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le piastrine. Il surnatante è il plasma povero di piastrine. Quindi trasferire la metà superiore del surnatante in una nuova provetta da centrifuga.
- Centrifugare il plasma povero di piastrine a 13000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari. Il surnatante è plasma ricco di EV. Quindi, trasferire la metà superiore del surnatante in una nuova provetta da centrifuga per il test successivo.
2. Rilevamento di EV-ACT del campione da parte dell'analizzatore
- Accendere l'analizzatore di coaguli (vedere la tabella dei materiali) e preriscaldare lo strumento a 37 °C. Installare la sonda monouso e la tazza di prova, quindi avviare la procedura di controllo qualità della macchina.
NOTA: Quando il valore del segnale di resistenza viscosa sullo schermo viene visualizzato come una linea retta, significa che il rilevamento non viene interferito e che il controllo di qualità dello stato dell'analizzatore è qualificato. La procedura di test può essere avviata dopo che l'autotest è stato qualificato. - Immettere le informazioni di esempio nel sistema. Quindi, trasferire 200 μL di plasma ricco di EV nella coppetta di prova, seguiti da 20 mM 170 μL di cloruro di calcio. Fare clic sul pulsante Start. L'asta di agitazione magnetica nella tazza di prova mescolerà completamente il campione e il cloruro di calcio. Chiudere il coperchio e la sonda inizierà a rilevare la variazione della resistenza del campione.
NOTA: Al termine del test, l'analizzatore visualizzerà automaticamente "test completato". L'ora di EV-ACT viene visualizzata e registrata dal sistema. Il risultato è espresso nell'unità di tempo "secondo". Gettare la sonda e testare la coppetta.
3. Controllo di qualità basato sulla citometria a flusso del campione di plasma ricco di EV
- Le vescicole extracellulari sono state identificate per la prima volta in base alle loro dimensioni (0,1-1 μm). Regolare in anticipo i parametri del citometro a flusso e impostare il "gate" di EV utilizzando perle di polistirene disponibili in commercio (0,5, 0,9 e 3,0 μm) (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: La miscela di microsfere è costituita da sfere fluorescenti di diversi diametri che coprono la gamma di dimensioni di microvescicole (0,5 e 0,9 μm) e piastrine (0,9 μm e 3 μm). - Regolare la tensione della dispersione diretta e della dispersione laterale e assicurarsi che le microsfere da 0,9 μm cadano nella regione appropriata. La regione EV può essere disegnata in base al diametro della microsfera.
- Trasferire 50 μL di plasma ricco di EV nel tubo di flusso, seguito da 450 μL di soluzione salina tampone fosfato filtrata. Mescolare accuratamente il liquido nel tubo di flusso. Infine, rilevare i campioni utilizzando la citometria a flusso25.
- Utilizzare le particelle fluorescenti ultra arcobaleno (vedere la tabella dei materiali) per quantificare il numero di EVs.In brief, aggiungere 10 μL di particelle al campione prima del rilevamento del flusso e calcolare la concentrazione di EV utilizzando la seguente formula al termine del rilevamento del campione: 10.120 * EV (#) / (microsfere * volume) * fattore di diluizione26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il tempo di attivazione della trombina del plasma ricco di EV è stato misurato utilizzando un analizzatore con metodo viscoelastico per la misurazione del tempo di coagulazione del plasma. La macchina è composta da quattro componenti principali: un convertitore di segnale elettronico, una sonda, un serbatoio di rilevamento e un elemento riscaldante (Figura 1A,B). La sonda utilizza oscillazioni ad alta e bassa ampiezza per rilevare le variazioni della viscosità del plasma. Il controllo di qualità giornaliero comprende principalmente il controllo della qualità dell'aria per valutare la stabilità della piattaforma di prova e identificare eventuali disturbi fisici alla sonda. Il controllo della qualità delle prestazioni prevede test con olio a viscosità standard per garantire che il valore di resistenza rilevato dalla sonda rientri nell'intervallo impostato.
Dopo aver ottenuto plasma ricco di EV, le vescicole extracellulari sono state misurate utilizzando la citometria a flusso per il controllo della qualità del campione. I campioni non qualificati mostrano un cluster distinto con particelle di dimensioni leggermente più grandi vicino al "gate" di EV (Figura 2A). Al contrario, campioni qualificati ricchi di EV mostrano che la maggior parte dei segnali rientra nel "gate" di EV come un singolo gruppo (Figura 2B).
Per valutare la concentrazione di EV in campioni di plasma ricchi di EV provenienti da volontari sani, è stata eseguita la centrifugazione a supervelocità (1.00.000 x g, 70 min). I risultati hanno rivelato che un aumento della concentrazione di EV ha ridotto l'EV-ACT, mentre una diminuzione della concentrazione di EV ha prolungato l'EV-ACT (Figura 3A). Il tempo di EV-ACT può mostrare una correlazione negativa con i livelli di EV. Sono stati esaminati diversi campioni di pazienti clinici e i risultati hanno dimostrato che i campioni di plasma ricchi di EV di pazienti con preeclampsia, fratture dell'anca e cancro ai polmoni (da sinistra a destra) avevano tempi di EV-ACT significativamente più brevi rispetto ai volontari sani (Figura 3B).
In conclusione, è stato preliminarmente stabilito un metodo sperimentale rapido ed economico per rilevare l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari, promettente per le applicazioni cliniche negli esami al letto del paziente.
Figura 1: Il diagramma schematico e l'immagine fisica dell'analizzatore di coaguli. (A) e (B) rappresentano rispettivamente i componenti principali dell'analizzatore e le impostazioni di funzionamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Citometria a flusso rappresentativa delle vescicole extracellulari nel plasma ricco di vescicole extracellulari. (A) Campioni di plasma ricchi di vescicole extracellulari non qualificati. (B) Campioni di plasma qualificati ricchi di EV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi dell'EV-ACT del campione. (A) Risultati dell'EV-ACT dopo la rimozione delle EV e la concentrazione di EV in campioni ricchi di EV di volontari sani (da sinistra a destra, sospensione di sedimenti dopo supercentrifugazione, plasma ricco di EV e surnatante dopo ultracentrifugazione). (B) Risultati EV-ACT di campioni ricchi di EV da volontari e pazienti sani (da sinistra a destra, preeclampsia, frattura dell'anca, cancro del polmone e volontario sano). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo studio è stata descritta la preparazione di plasma ricco di EV e la razionalità del metodo è stata verificata utilizzando la citometria a flusso. Successivamente, i campioni di plasma ricalcificato sono stati analizzati per il tempo di ACT utilizzando un analizzatore di coaguli basato sui principi di viscoelasticità24. Come mostrato nella Figura 3A, è stato riscontrato che la concentrazione di EV ottenuta attraverso l'ultracentrifugazione riduce il tempo di EV-ACT, mentre il surnatante dopo l'ultracentrifugazione, che aveva ridotto i livelli di EV, mostrava tempi EV-ACT prolungati. Questi risultati suggeriscono una stretta relazione tra i risultati di EV-ACT e i livelli di EV. Nella Figura 3B, l'EV-ACT di campioni di plasma di pazienti con preeclampsia, fratture dell'anca e cancro del polmone è stato confrontato con volontari sani, rivelando tempi EV-ACT significativamente più brevi nei gruppi di malattia. Rapporti precedenti hanno indicato livelli elevati di vescicole extracellulari che promuovono la coagulazione nel plasma per queste malattie 27,28,29. Tuttavia, va notato che altri fattori presenti nel plasma possono influenzare gli esiti di EV-ACT ed è giustificata un'ulteriore esplorazione di questi fattori di influenza. Questo test si propone di riconoscere il ruolo cruciale delle vescicole extracellulari nello stato ipercoagulabile di alcune malattie e affronta la mancanza di un metodo di rilevamento rapido e a basso costo per l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari.
All'interno del sistema di campionamento del sangue isolato, le sostanze correlate alla coagulazione possono essere suddivise in cellule del sangue, piastrine, metaboliti cellulari (principalmente EV) e altri componenti "invisibili" (come fattori della coagulazione e fattori anticoagulanti)30,31,32. Data la complessità del meccanismo di coagulazione, il sistema di rilevamento è stato semplificato al plasma ricco di EV per ridurre al minimo l'interferenza di altri fattori. Le fasi chiave di questo processo includono la prevenzione della generazione di vescicole extracellulari artificiali durante l'elaborazione del campione e la riduzione al minimo della contaminazione piastrinica. Pertanto, è necessario avviare la procedura di centrifugazione differenziale entro 0,5 ore e completare la rilevazione entro 2 ore dalla raccolta del campione. Studi precedenti hanno dimostrato che l'uso di una forza centrifuga sufficientemente elevata e il mantenimento della metà superiore del surnatante possono ridurre efficacemente la contaminazione piastrinica33. La citometria a flusso è stata utilizzata per rilevare le piastrine residue nel plasma ricco di EV, confermando la loro presenza molto bassa. I campioni non qualificati derivano principalmente dalla contaminazione piastrinica e dalla frammentazione cellulare causata dal processo di manipolazione. La contaminazione piastrinica è caratterizzata dalla presenza di particelle al di fuori del "cancello" delle vescicole extracellulari, mentre la frammentazione cellulare appare come un cluster distinto all'interno del "cancello" delle vescicole extracellulari.
Studi recenti hanno confermato livelli significativamente elevati di vescicole extracellulari plasmatiche in alcune malattie34,35. Queste vescicole extracellulari promuovono principalmente la coagulazione attraverso la presenza di fosfatidilserina (PS) e fattore tissutale (TF) sulla loro superficie. Pertanto, il tempo di ACT del plasma ricco di EV dipende in gran parte dal livello di EV coagulanti. Un limite di questo test è la necessità di garantire che i livelli di fattori di coagulazione non cambino in modo significativo nella misura in cui influiscono sul tempo di coagulazione durante l'analisi EV-ACT. Tuttavia, gli studi sui cambiamenti nei livelli di fattori della coagulazione dopo l'insorgenza della malattia sono relativamente scarsi e il loro effetto sull'EV-ACT deve essere valutato in ulteriori ricerche. Inoltre, l'uso eccessivo di farmaci anticoagulanti può influenzare significativamente i risultati di EV-ACT, quindi questo metodo non deve essere utilizzato durante tale trattamento.
Esistono diversi metodi per determinare le vescicole extracellulari procoagulanti, ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi. Piwkham et al. hanno valutato l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari mescolando la sospensione delle vescicole extracellulari con il plasma normale e osservando il tempo di formazione del coagulo di sangue in un bagno d'acqua a 37 °C36. Sebbene questo metodo sia semplice, l'osservazione soggettiva del tempo di formazione del coagulo può portare a variazioni di risultato tra i diversi osservatori. Patil et al. hanno utilizzato un test di coagulazione standardizzato interno per l'analisi delle microparticelle di procoagulante utilizzando il veleno di vipera Russell su un coagulometrosemiautomatico 37. Questo metodo di rilevamento utilizza apparecchiature semiautomatiche, offrendo un'elevata efficienza e semplicità. Tuttavia, l'aggiunta del veleno di vipera Russell per attivare il fattore X trascura la presenza di altri anticoagulanti nel plasma, come la proteina lattaderina. Questo metodo valuta i risultati in base all'equilibrio tra le vescicole extracellulari procoagulanti e i componenti anticoagulanti nel plasma, fornendo una riflessione più accurata della funzione di coagulazione del campione di plasma.
I test di funzionalità della coagulazione esistenti si concentrano principalmente sul tempo di attivazione della trombina nel sangue intero o nel sangue ricco di piastrine, o rilevano carenze nei fattori della coagulazione24. Lo sviluppo di un metodo di prova per l'attività procoagulante delle vescicole extracellulari aiuterà a chiarire il ruolo delle vescicole extracellulari nella malattia e nei trattamenti futuri. Il semplice processo di preparazione del campione, che prevede l'aggiunta del solo CaCl2, rende il test conveniente per i medici per determinare rapidamente lo stato della funzione coagulativa dei pazienti. Il test EV-ACT è facile da eseguire, con risultati disponibili entro 10-15 minuti, il che lo rende adatto per lo sviluppo come test al letto del paziente. Studi precedenti hanno identificato provvisoriamente applicazioni di EV-ACT nella preeclampsia, nei tumori e nelle fratture. La ricerca futura continuerà a esplorare le prospettive di applicazione clinica di EV-ACT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tutti gli autori hanno dichiarato che non ci sono potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China, sovvenzione n. 81930031, 81901525. Inoltre, ringraziamo Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. per averci fornito macchine e guida tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
References
- Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
- Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
- Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
- You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
- Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
- Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
- Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
- Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
- Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
- Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
- Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
- Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
- Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
- Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
- Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
- Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
- Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
- Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
- Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
- Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
- Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
- Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
- Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
- Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
- Kubo, H.
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
- Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
- Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
- Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
- Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
- Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
- Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
- Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
- Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).
