Summary
Detta protokoll undersöker användningen av extracellulär vesikelrik (EV)-rik plasma som en indikator på den koagulativa förmågan hos EV. EV-rik plasma erhålls genom en process med differentiell centrifugering och efterföljande rekalkifiering.
Abstract
Extracellulära vesiklars (EV) roll i olika sjukdomar får ökad uppmärksamhet, särskilt på grund av deras potenta prokoagulerande aktivitet. Det finns dock ett akut behov av ett bedside-test för att bedöma prokoaguleringsaktiviteten hos EV i kliniska miljöer. Denna studie föreslår användning av trombinaktiveringstid för EV-rik plasma som ett mått på EV:s prokoagulerande aktivitet. Standardiserade procedurer användes för att erhålla natriumciterat helblod, följt av differentiell centrifugering för att erhålla EV-rik plasma. Den EV-rika plasman och kalciumkloriden tillsattes i testkoppen, och förändringarna i viskoelasticitet övervakades i realtid med hjälp av en analysator. Den naturliga koagulationstiden för EV-rik plasma, kallad EV-ACT, bestämdes. Resultaten visade en signifikant ökning av EV-ACT när EV avlägsnades från plasma från friska frivilliga, medan den minskade signifikant när EV anrikades. Dessutom var EV-ACT avsevärt förkortat i humana prover från havandeskapsförgiftning, höftfraktur och lungcancer, vilket indikerar förhöjda nivåer av plasma-EV och främjande av hyperkoagulation i blodet. Med sin enkla och snabba procedur är EV-ACT lovande som ett patientnära test för att utvärdera koagulationsfunktionen hos patienter med höga plasma-EV-nivåer.
Introduction
Trombos, som orsakas av hyperkoagulabilitet, spelar en viktig roll i olika sjukdomar, inklusive hjärntrauma1, havandeskapsförgiftning2, tumörer3 och frakturpatienter4. Mekanismen bakom hyperkoagulerbarhet är komplex, och på senare tid har tonvikten lagts på extracellulära vesiklars (EV) roll vid koagulationsrubbningar. EV är vesikelliknande kroppar med en tvåskiktsstruktur som lossnar från cellmembranet, med en diameter på mellan 10 nm och 1000 nm. De är förknippade med en mängd olika sjukdomsprocesser, särskilt koagulationsrubbningar5. Flera studier har identifierat EV som en lovande prediktor för trombosrisk 6,7. Den prokoagulerande aktiviteten hos EV beror på uttrycket av koagulationsfaktorer, främst vävnadsfaktor (TF) och fosfatidylserin (PS). EV med robust prokoaguleringsaktivitet förbättrar signifikant den katalytiska effektiviteten hos tenas och protrombinkomplex, vilket främjar trombinmedierad fibrinogen och lokal trombos8. Förhöjda nivåer av EV och deras orsakssamband med hyperkoagulabilitet har observerats vid många sjukdomar9. Följaktligen är standardisering av detektering av elfordon och rapportering av deras prokoaguleringsaktivitet ett viktigt undersökningsområde10.
Hittills finns endast ett fåtal kommersiella kit tillgängliga för att upptäcka elbilars prokoaguleringsaktivitet. MP-Activity-analysen och MP-TF-analysen, som produceras av ett kommersiellt företag, är funktionella analyser som används för att mäta EV:s prokoaguleringsaktivitet i plasma11. Dessa analyser använder en princip som liknar den för enzymkopplade immunadsorberande analyser för att detektera PS och TF på EV. Dessa kit är dock dyra och begränsade till ett fåtal forskningsinstitutioner på hög nivå. Processen är komplex och tidskrävande, vilket gör det utmanande att implementera dem i kliniska miljöer. Dessutom blandar en kommersiellt utvecklad prokoagulerande fosfolipidanalys (PPL) PS-fri plasma med testplasma och mäter koagulationstiden för att kvantitativt detektera nivåer av PS-positiva EV12. Dessa analyser fokuserar dock främst på PS och TF på elfordon, och förbiser andra koagulationsvägar som cirkulerande elfordon kan varainvolverade i.
Plasmakoagulationssystemet är invecklat och består av både "osynliga" och "synliga" komponenter, inklusive koagulantia, antikoagulantia, fibrinolytiska system och EV suspenderade i plasma. Fysiologiskt upprätthåller dessa komponenter en dynamisk balans. Vid patologiska tillstånd bidrar signifikant ökade EV i cirkulationen till hyperkoagulabilitet, särskilt hos patienter med hjärntrauma, havandeskapsförgiftning, frakturer och olika typer av cancer13. För närvarande innebär utvärderingen av koagulationsstatus i kliniska laboratorier främst att bedöma koagulationssystemet, antikoagulationssystemet och fibrinolysen 14,15,16,17. Protrombintid, aktiverad partiell tromboplastintid, trombintid och internationellt normaliserat förhållande används ofta för att utvärdera koagulationsfaktornivåer i koagulationssystemet18. Nyligen genomförda studier har dock visat att dessa tester inte fullt ut återspeglar hyperkoagulerbarheten hos vissa sjukdomar19. Andra analysmetoder, såsom tromboelastometri (TEG), rotations-TEG och Sonoklot-analys, mäter viskoelastiska förändringar i helblod20,21. Eftersom helblodsprover innehåller många blodkroppar och blodplättar, är det mer sannolikt att dessa tester indikerar koagulationsstatusen för provet som helhet. Vissa forskare har rapporterat om blodkropparnas och blodplättarnas roll i prokoaguleringsaktiviteten22,23. En nyligen genomförd studie upptäckte också att tidigare koagulationsfunktionstester har svårt att upptäcka förändringar i mikropartiklarnas prokoaguleringsaktivitet24. Därför har en hypotes föreslagits att den prokoagulerande funktionen hos EV kan utvärderas genom viskoelastiska mätningar av den aktiverade koagulationstiden (ACT) i EV-rik plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Insamlingen av mänskliga prover godkändes av den medicinska etikkommittén vid Tianjin Medical University General Hospital. Insamlingen av humant venöst blod följde strikt de riktlinjer som utfärdats av Kinas nationella hälsokommission, nämligen WS/T 661-2020 Riktlinje för insamling av venösa blodprover. Kortfattat samlades blod in från friska individer med informerat samtycke från den främre brachialvenen, och proverna blandades med 3,2 % natriumcitratantikoagulantia i förhållandet 1:9. När endast prover av antikoagulantia av natriumcitrat samlades in, kasserades det första uppsamlingskärlet. Bearbetningsflödet initierades inom 0,5 timmar efter provtagningen. Vuxna friska försökspersoner rekryterades för provtagning efter att ha inhämtat informerat samtycke. Exklusionskriterier för patienter var: (1) nyligen inträffad intravaskulär trombos, (2) nedsatt lever- och njurfunktion, (3) hypertoni, hyperlipidemi, diabetes och andra kroniska sjukdomar, (4) acetylsalicylsyra eller antikoagulantia, (5) menstruation och graviditet.
1. Isolering av EV-rik plasma
- Centrifugera proverna vid 120 x g i 20 minuter i rumstemperatur för att avlägsna blodkropparna. Supernatanten är blodplättsrik plasma. Överför sedan den övre 1/2 av supernatanten till ett nytt centrifugrör med en pipett.
- Centrifugera den trombocytrika plasman vid 1500 x g i 20 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna blodplättarna. Supernatanten är blodplättsfattig plasma. Överför sedan den övre 1/2 av supernatanten till ett nytt centrifugrör.
- Centrifugera den trombocytfattiga plasman vid 13000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna cellrester. Supernatanten är EV-rik plasma. Överför sedan den övre 1/2 av supernatanten till ett nytt centrifugrör för efterföljande testning.
2. Detektion av EV-ACT av provet med analysatorn
- Slå på koagelanalysatorn (se materialtabell) och förvärm instrumentet till 37 °C. Installera engångssonden och testkoppen och starta sedan maskinens kvalitetskontrollprocedur.
OBS: När signalvärdet för viskös resistans på skärmen visas som en rak linje betyder det att detekteringen inte störs och kvalitetskontrollen av analysatorns status är kvalificerad. Testproceduren kan startas efter att självtestet har kvalificerats. - Mata in exempelinformation i systemet. Överför sedan 200 μl EV-rik plasma till testkoppen, följt av 20 mM 170 μL kalciumklorid. Klicka på startknappen. Den magnetiska omrörarstaven i testkoppen kommer att blanda provet och kalciumklorid helt. Stäng locket och sonden kommer att börja upptäcka förändringen i sample motstånd.
OBS: När testet är klart kommer analysatorn automatiskt att fråga "testet slutfört". Tiden för EV-ACT visas och registreras av systemet. Resultatet uttrycks i tidsenheten "sekund". Kassera sonden och testa koppen.
3. Flödescytometribaserad kvalitetskontroll av det EV-rika plasmaprovet
- Elbilar identifierades först genom sin storlek (0,1-1 μm). Justera parametrarna för flödescytometern i förväg och ställ in "grinden" för EV med hjälp av kommersiellt tillgängliga polystyrenpärlor (0.5, 0.9 och 3.0 μm) (se materialtabell).
OBS: Pärlblandningen består av fluorescerande sfärer med olika diametrar som täcker storleksintervallet mikrovesiklar (0,5 och 0,9 μm) och trombocyter (0,9 μm och 3 μm). - Justera spänningen för Forward Scatter och Side Scatter och se till att 0,9 μm mikrosfärerna hamnar i rätt område. EV-regionen kan ritas enligt mikrosfärens diameter.
- Överför 50 μl EV-rik plasma till flödesröret, följt av 450 μL filtrerad fosfatbuffertsaltlösning. Blanda vätskan ordentligt i flödesröret. Detektera slutligen proverna med hjälp av flödescytometri25.
- Använd Ultra Rainbow fluorescerande partiklar (se materialtabell) för att kvantifiera antalet EVs.In kort, tillsätt 10 μL av partiklarna till provet före flödesdetekteringen och beräkna EV-koncentrationen med hjälp av följande formel efter att provdetektionen är klar: 10,120 * EV (#) / (mikropärlor * volym) * utspädningsfaktor26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trombinaktiveringstiden för EV-rik plasma mättes med hjälp av en viskoelastisk metodanalysator för mätning av plasmakoagulationstid. Maskinen består av fyra huvudkomponenter: en elektronisk signalomvandlare, en sond, en detekteringstank och ett värmeelement (Figur 1A,B). Sonden använder högfrekventa svängningar med låg amplitud för att detektera förändringar i plasmaviskositeten. Daglig kvalitetskontroll omfattar i första hand luftkvalitetskontroll för att bedöma testplattformens stabilitet och identifiera eventuella fysiska störningar på sonden. Prestandakvalitetskontroll innebär testning med standardviskositetsolja för att säkerställa att motståndsvärdet som detekteras av sonden faller inom det inställda intervallet.
Efter att ha erhållit EV-rik plasma mättes EV med hjälp av flödescytometri för provkvalitetskontroll. Okvalificerade prover uppvisar ett distinkt kluster med något större partikelstorlek nära "grinden" för EV (figur 2A). Däremot visar kvalificerade EV-rika urval att de flesta signaler faller inom "grinden" för EV som en enda grupp (figur 2B).
För att utvärdera EV-koncentrationen i EV-rika plasmaprover från friska frivilliga utfördes superspeed-centrifugering (1 00 000 x g, 70 min). Resultaten visade att en ökning av EV-koncentrationen förkortade EV-ACT, medan en minskning av EV-koncentrationen förlängde EV-ACT (Figur 3A). EV-ACT-tid kan uppvisa en negativ korrelation med EV-nivåer. Flera prover från kliniska patienter undersöktes, och resultaten visade att EV-rika plasmaprover från patienter med havandeskapsförgiftning, höftfrakturer och lungcancer (från vänster till höger) hade signifikant kortare EV-ACT-tider jämfört med friska frivilliga (Figur 3B).
Sammanfattningsvis etablerades preliminärt en snabb och kostnadseffektiv experimentell metod för att detektera EV-prokoaguleringsaktivitet, lovande för kliniska tillämpningar vid patientnära undersökningar.
Figur 1: Det schematiska diagrammet och den fysiska bilden av koagelanalysatorn. (A) och (B) representerar analysatorns huvudkomponenter respektive driftsinställningarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ flödescytometri för EV i EV-rik plasma. (A) Okvalificerade EV-rika plasmaprover. (B) Kvalificerade EV-rika plasmaprover. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultat av EV-ACT för provet. (A) EV-ACT-resultat efter EV-avlägsnande och EV-koncentration i EV-rika prover från friska frivilliga (från vänster till höger, sedimentsuspension efter supercentrifugering, EV-rik plasma och supernatant efter ultracentrifugering). (B) EV-ACT-resultat av EV-rika prover från friska frivilliga och patienter (från vänster till höger, preeklampsi, höftfraktur, lungcancer och frisk volontär). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskrevs framställningen av EV-rik plasma, och metodens rationalitet verifierades med hjälp av flödescytometri. Därefter analyserades de rekalkifierade plasmaproverna med avseende på ACT-tid med hjälp av en koagelanalysator baserad på viskoelasticitetsprinciper24. Som visas i figur 3A visade sig koncentrationen av EV som erhölls genom ultracentrifugering förkorta EV-ACT-tiden, medan supernatanten efter ultracentrifugering, som hade reducerade EV-nivåer, uppvisade förlängda EV-ACT-tider. Dessa resultat tyder på ett nära samband mellan EV-ACT-resultat och EV-nivåer. I figur 3B jämfördes EV-ACT för plasmaprover från patienter med havandeskapsförgiftning, höftfrakturer och lungcancer med friska frivilliga, vilket avslöjade signifikant kortare EV-ACT-tider i sjukdomsgrupperna. Tidigare rapporter har indikerat förhöjda nivåer av koagulationsfrämjande EV i plasma för dessa sjukdomar 27,28,29. Det bör dock noteras att andra faktorer som finns i plasma kan påverka EV-ACT-resultaten, och ytterligare utforskning av dessa påverkande faktorer är motiverad. Denna analys syftar till att erkänna den avgörande roll som EV spelar i det hyperkoagulerbara tillståndet hos vissa sjukdomar och tar itu med bristen på en billig och snabb detektionsmetod för EV-prokoaguleringsaktivitet.
Inom det isolerade blodprovssystemet kan koagulationsrelaterade ämnen delas in i blodkroppar, blodplättar, cellmetaboliter (främst EV) och andra "osynliga" komponenter (såsom koagulationsfaktorer och antikoagulerande faktorer)30,31,32. Med tanke på komplexiteten i koagulationsmekanismen förenklades detektionssystemet till EV-rik plasma för att minimera störningar från andra faktorer. Viktiga steg i denna process inkluderar att förhindra generering av artificiella EV under provbearbetning och minimera trombocytkontaminering. Därför är det nödvändigt att initiera differentialcentrifugeringsproceduren inom 0.5 timmar och slutföra detektionen inom 2 timmar efter provtagningen. Tidigare studier har visat att användning av tillräckligt hög centrifugalkraft och bibehållande av den övre halvan av supernatanten effektivt kan minska trombocytkontaminering33. Flödescytometri användes för att detektera kvarvarande blodplättar i EV-rik plasma, vilket bekräftade deras mycket låga närvaro. Okvalificerade prover beror främst på trombocytkontamination och cellfragmentering orsakad av hanteringsprocessen. Trombocytkontaminering kännetecknas av närvaron av partiklar utanför "grinden" för EVs, medan cellfragmentering uppträder som ett distinkt kluster inom "grinden" för EVs.
Nyligen genomförda studier har bekräftat signifikant förhöjda nivåer av plasma-EV vid vissa sjukdomar34,35. Dessa EV främjar främst koagulation genom närvaron av fosfatidylserin (PS) och vävnadsfaktor (TF) på deras yta. Därför är ACT-tiden för EV-rik plasma till stor del beroende av nivån av koagulerande EV. En begränsning med detta test är behovet av att säkerställa att nivåerna av koagulationsfaktorer inte ändras avsevärt i den utsträckning att de påverkar koagulationstiden under EV-ACT-analysen. Studier av förändringar i koagulationsfaktornivåer efter sjukdomsdebut är dock relativt få, och deras effekt på EV-ACT behöver utvärderas i ytterligare forskning. Dessutom kan överdriven användning av antikoagulantia avsevärt påverka EV-ACT-resultaten, så denna metod bör inte användas under sådan behandling.
Det finns flera metoder för att bestämma prokoagulerande elfordon, var och en med sina fördelar och nackdelar. Piwkham et al. utvärderade EV-prokoaguleringsaktiviteten genom att blanda EV-suspension med normal plasma och observera tiden för blodproppsbildning i ett vattenbad vid 37 °C36. Även om denna metod är enkel, kan den subjektiva observationen av koagelbildningstiden leda till resultatvariationer mellan olika observatörer. Patil et al. använde en intern standardiserad koagulationsanalys för prokoaguleringsmikropartikeltestning med Russell-huggormsgift på en halvautomatisk koagulometer37. Denna detekteringsmetod använder halvautomatisk utrustning som erbjuder hög effektivitet och enkelhet. Tillsatsen av russelhuggormsgift för att aktivera faktor X förbiser dock förekomsten av andra antikoagulantia i plasma, såsom laktadherinprotein. Denna metod bedömer resultat baserat på balansen mellan prokoagulerande EV och antikoagulantiakomponenter i plasma, vilket ger en mer exakt återspegling av plasmaprovets koagulationsfunktion.
Befintliga koagulationsfunktionstester fokuserar främst på trombinaktiveringstiden i helblod eller blodplättsrikt blod, eller upptäcker brister i koagulationsfaktorer24. Att utveckla en testmetod för EV-prokoaguleringsaktivitet kommer att hjälpa till att belysa EV:s roll vid sjukdom och framtida behandlingar. Den enkla provberedningsprocessen, som innebär tillsats av endast CaCl2, gör analysen bekväm för kliniker att snabbt bestämma patienternas koagulationsfunktionsstatus. EV-ACT-testet är lätt att utföra, med resultat tillgängliga inom 10-15 minuter, vilket gör det väl lämpat för utveckling som ett bedside-test. Tidigare studier har preliminärt identifierat tillämpningar av EV-ACT vid havandeskapsförgiftning, tumörer och frakturer. Framtida forskning kommer att fortsätta att utforska de kliniska tillämpningsmöjligheterna för EV-ACT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Samtliga författare förklarade att det inte finns några potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av anslag från National Natural Science Foundation of China, anslag nr 81930031, 81901525. Dessutom tackar vi Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. för att ha försett oss med maskiner och teknisk vägledning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
References
- Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
- Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
- Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
- You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
- Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
- Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
- Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
- Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
- Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
- Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
- Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
- Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
- Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
- Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
- Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
- Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
- Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
- Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
- Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
- Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
- Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
- Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
- Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
- Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
- Kubo, H.
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
- Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
- Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
- Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
- Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
- Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
- Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
- Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
- Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).
