Summary
Bu protokol, EV'nin pıhtılaşma yeteneğinin bir göstergesi olarak hücre dışı vezikülden (EV) zengin plazmanın kullanımını araştırır. EV'den zengin plazma, diferansiyel santrifüjleme ve ardından yeniden kalsifikasyon işlemi ile elde edilir.
Abstract
Hücre dışı veziküllerin (EV) çeşitli hastalıklardaki rolü, özellikle güçlü prokoagülan aktiviteleri nedeniyle artan bir ilgi görmektedir. Bununla birlikte, klinik ortamlarda EV'nin prokoagülan aktivitesini değerlendirmek için acil bir yatak başı testine ihtiyaç vardır. Bu çalışma, EV'nin prokoagülan aktivitesinin bir ölçüsü olarak EV'den zengin plazmanın trombin aktivasyon zamanının kullanılmasını önermektedir. Sodyum sitratlı tam kan elde etmek için standartlaştırılmış prosedürler kullanıldı, ardından EV'den zengin plazma elde etmek için diferansiyel santrifüjleme yapıldı. EV bakımından zengin plazma ve kalsiyum klorür test kabına eklendi ve viskoelastisitedeki değişiklikler bir analizör kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. EV-ACT olarak adlandırılan EV'den zengin plazmanın doğal pıhtılaşma süresi belirlendi. Sonuçlar, sağlıklı gönüllülerden elde edilen plazmadan EV çıkarıldığında EV-ACT'de önemli bir artış olduğunu ortaya koyarken, EV zenginleştirildiğinde önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. Ayrıca, preeklampsi, kalça kırığı ve akciğer kanserinden alınan insan örneklerinde EV-ACT önemli ölçüde kısaldı, bu da plazma EV seviyelerinin yükseldiğini ve kan hiperkoagülasyonunun desteklendiğini gösterdi. Basit ve hızlı prosedürü ile EV-ACT, yüksek plazma EV düzeyleri olan hastalarda pıhtılaşma fonksiyonunu değerlendirmek için bir yatak başı testi olarak umut vaat etmektedir.
Introduction
Hiper pıhtılaşmanın neden olduğu tromboz, beyin travması1, preeklampsi2, tümörler3 ve kırık hastaları4 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynar. Hiper pıhtılaşmanın altında yatan mekanizma karmaşıktır ve son zamanlarda pıhtılaşma bozukluklarında hücre dışı veziküllerin (EV) rolüne vurgu yapılmıştır. EV'ler, çapı 10 nm ila 1000 nm arasında değişen, hücre zarından ayrılan iki katmanlı bir yapıya sahip vezikül benzeri cisimlerdir. Başta pıhtılaşma bozuklukları olmak üzere çeşitli hastalık süreçleriyle ilişkilidirler5. Birkaç çalışma, EV'leri tromboz riskinin umut verici bir belirleyicisi olarak tanımlamıştır 6,7. EV'lerin prokoagülan aktivitesi, başta doku faktörü (TF) ve fosfatidilserin (PS) olmak üzere pıhtılaşma faktörlerinin ekspresyonuna bağlıdır. Güçlü prokoagülan aktiviteye sahip EV'ler, tenaz ve protrombin kompleksinin katalitik etkinliğini önemli ölçüde arttırır, böylece trombin aracılı fibrinojen ve lokal trombozuteşvik eder 8. Çok sayıda hastalıkta yüksek EV seviyeleri ve bunların hiper pıhtılaşma ile nedensel ilişkisi gözlenmiştir9. Sonuç olarak, EV'lerin tespitinin standartlaştırılması ve prokoagülan aktivitelerinin raporlanması önemli bir araştırma alanıdır10.
Bugüne kadar, EV'lerin prokoagülan aktivitesini tespit etmek için sadece birkaç ticari kit mevcuttur. Ticari bir şirket tarafından üretilen MP-Aktivite testi ve MP-TF testi, EV'nin plazma11'deki prokoagülan aktivitesini ölçmek için kullanılan fonksiyonel testlerdir. Bu testler, EV'lerde PS ve TF'yi tespit etmek için enzime bağlı immünosorbent testlerine benzer bir prensip kullanır. Bununla birlikte, bu kitler pahalıdır ve birkaç üst düzey araştırma kurumuyla sınırlıdır. Süreç karmaşık ve zaman alıcıdır, bu da bunları klinik ortamlarda uygulamayı zorlaştırır. Ek olarak, ticari olarak geliştirilmiş bir prokoagülan fosfolipid (PPL) testi, PS pozitif EV'lerin12 seviyelerini kantitatif olarak tespit etmek için pıhtılaşma süresini ölçerek, PS içermeyen plazmayı test plazması ile karıştırır. Bununla birlikte, bu tahliller öncelikle EV'lerde PS ve TF'ye odaklanır ve dolaşımdaki EV'lerin12'de yer alabileceği diğer pıhtılaşma yollarını gözden kaçırır.
Plazma pıhtılaşma sistemi karmaşıktır ve pıhtılaştırıcılar, antikoagülanlar, fibrinolitik sistemler ve plazmada asılı EV'ler dahil olmak üzere hem "görünmez" hem de "görünür" bileşenleri içerir. Fizyolojik olarak, bu bileşenler dinamik bir denge sağlar. Patolojik durumlarda, dolaşımdaki önemli ölçüde artmış EV'ler, özellikle beyin travması, preeklampsi, kırık ve çeşitli kanser türleri olan hastalarda hiper pıhtılaşmaya katkıda bulunur13. Günümüzde klinik laboratuvarlarda pıhtılaşma durumunun değerlendirilmesi öncelikle pıhtılaşma sisteminin, antikoagülasyon sisteminin ve fibrinolizin değerlendirilmesini içermektedir 14,15,16,17. Protrombin zamanı, aktive parsiyel tromboplastin zamanı, trombin zamanı ve uluslararası normalleştirilmiş oran, pıhtılaşma sistemindeki pıhtılaşma faktörü düzeylerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır18. Ancak son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu testlerin bazı hastalıkların hiper pıhtılaşabilirliğini tam olarak yansıtmadığını ortaya koymuştur19. Tromboelastometri (TEG), rotasyonel TEG ve Sonoklot analizi gibi diğer tahlil yöntemleri, tam kan viskoelastik değişikliklerini ölçer20,21. Tam kan örnekleri çok sayıda kan hücresi ve trombosit içerdiğinden, bu testlerin bir bütün olarak numunenin pıhtılaşma durumunu gösterme olasılığı daha yüksektir. Bazı araştırmacılar prokoagülan aktivitede kan hücrelerinin ve trombositlerin rolü hakkında rapor vermişlerdir 22,23. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, önceki pıhtılaşma fonksiyon testlerinin mikropartiküllerin prokoagülan aktivitesindeki değişiklikleri tespit etmede zorluklarla karşılaştığını da keşfetti24. Bu nedenle, EV'lerin prokoagülan fonksiyonunun, EV'den zengin plazmada aktive edilmiş pıhtılaşma süresinin (ACT) viskoelastik ölçümleri ile değerlendirilebileceğine dair bir hipotez öne sürülmüştür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan örneklerinin toplanması, Tianjin Tıp Üniversitesi Genel Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylandı. İnsan venöz kanının toplanması, Çin Ulusal Sağlık Komisyonu tarafından yayınlanan kılavuzu, yani WS/T 661-2020 Venöz Kan Örneklerinin Toplanması Kılavuzunu sıkı bir şekilde takip etti. Kısaca, sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam ile anterior brakiyal bölge veninden kan alındı ve örnekler 1:9 oranında %3.2'lik sodyum sitrat antikoagülan kullanılarak karıştırıldı. Sadece sodyum sitrat antikoagülan örnekleri toplandığında, ilk toplama kabı atıldı. İşleme akışı, numune alındıktan sonraki 0,5 saat içinde başlatıldı. Yetişkin sağlıklı denekler, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra numune toplama için işe alındı. Hasta dışlama kriterleri şunlardı: (1) yakın zamanda intravasküler tromboz, (2) karaciğer ve böbrek fonksiyon bozukluğu, (3) hipertansiyon, hiperlipidemi, diyabet ve diğer kronik hastalıklar, (4) aspirin veya antikoagülan tedavi, (5) menstrüasyon ve gebelik.
1. EV'den zengin plazmanın izolasyonu
- Kan hücrelerini çıkarmak için numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, trombositten zengin plazmadır. Ardından, süpernatantın üst 1/2'sini bir pipetle yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Trombositleri çıkarmak için trombositten zengin plazmayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, trombositten fakir plazmadır. Ardından süpernatantın üst 1/2'sini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Hücre kalıntılarını gidermek için trombositten fakir plazmayı oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 13000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, EV açısından zengin plazmadır. Ardından, süpernatantın üst 1/2'sini sonraki testler için yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
2. Analizör tarafından numunenin EV-ACT'sinin tespiti
- Pıhtı analizörünü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve cihazı önceden 37 °C'ye ısıtın. Tek kullanımlık probu ve test kabını takın, ardından makinenin kalite kontrol prosedürünü başlatın.
NOT: Ekrandaki viskoz direnç sinyal değeri düz bir çizgi olarak görüntülendiğinde, algılamaya müdahale edilmediği ve analizör durumunun kalite kontrolünün kalifiye olduğu anlamına gelir. Test prosedürü, kendi kendine test onaylandıktan sonra başlatılabilir. - Örnek bilgileri sisteme girin. Ardından, 200 μL EV açısından zengin plazmayı test kabına aktarın, ardından 20 mM 170 μL kalsiyum klorür ekleyin. Başlat düğmesine tıklayın. Test kabındaki manyetik karıştırma çubuğu, numuneyi ve kalsiyum klorürü tamamen karıştıracaktır. Kapağı kapatın ve prob numune direncindeki değişikliği algılamaya başlayacaktır.
NOT: Test bittikten sonra, analizör otomatik olarak "test tamamlandı" uyarısı verecektir. EV-ACT'nin zamanı sistem tarafından görüntülenir ve kaydedilir. Sonuç, "saniye" zaman birimi cinsinden ifade edilir. Probu atın ve kabı test edin.
3. EV'den zengin plazma numunesinin akış sitometrisine dayalı kalite kontrolü
- EV'ler ilk olarak boyutlarına göre tanımlandı (0.1-1 μm). Akış sitometresinin parametrelerini önceden ayarlayın ve piyasada bulunan polistiren boncukları (0.5, 0.9 ve 3.0 μm) kullanarak EV'nin " kapısını" ayarlayın (bkz.
NOT: Boncuk karışımı, mikro-parçacıkların (0,5 ve 0,9 μm) ve trombositlerin (0,9 μm ve 3 μm) boyut aralığını kapsayan farklı çaplarda floresan kürelerden oluşur. - İleri Saçılma ve Yan Saçılma voltajını ayarlayın ve 0,9 μm mikro küreciklerin uygun bölgeye düştüğünden emin olun. EV bölgesi, mikrokürenin çapına göre çizilebilir.
- 50 μL EV bakımından zengin plazmayı akış tüpüne aktarın, ardından 450 μL filtrelenmiş fosfat tampon salin ekleyin. Sıvıyı akış borusunda iyice karıştırın. Son olarak, akış sitometrisi25 kullanarak örnekleri tespit edin.
- Kısa EVs.In sayısını ölçmek için Ultra Gökkuşağı Floresan Parçacıklarını ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın, akış algılamadan önce numuneye 10 μL partikül ekleyin ve numune tespiti tamamlandıktan sonra aşağıdaki formülü kullanarak EV konsantrasyonunu hesaplayın: 10,120 * EV (#) / (mikro boncuklar * hacim) * seyreltme faktörü26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EV'den zengin plazmanın trombin aktivasyon süresi, plazma pıhtılaşma süresi ölçümü için viskoelastik yöntem analizörü kullanılarak ölçüldü. Makine dört ana bileşenden oluşur: bir elektronik sinyal dönüştürücü, bir prob, bir algılama tankı ve bir ısıtma elemanı (Şekil 1A,B). Prob, plazma viskozitesindeki değişiklikleri tespit etmek için yüksek frekanslı ve düşük genlikli salınımlar kullanır. Günlük kalite kontrolü, öncelikle test platformunun stabilitesini değerlendirmek ve probdaki herhangi bir fiziksel rahatsızlığı belirlemek için hava kalitesi kontrolünü içerir. Performans kalite kontrolü, prob tarafından tespit edilen direnç değerinin ayarlanan aralıkta olduğundan emin olmak için standart viskoziteli yağ ile test edilmesini içerir.
EV'den zengin plazma elde edildikten sonra, numune kalite kontrolü için akış sitometrisi kullanılarak EV'ler ölçüldü. Niteliksiz numuneler, EV'nin "kapısının" yakınında biraz daha büyük parçacık boyutuna sahip ayrı bir küme sergiler (Şekil 2A). Buna karşılık, nitelikli EV açısından zengin örnekler, çoğu sinyalin tek bir grup olarak EV'nin "kapısına" düştüğünü göstermektedir (Şekil 2B).
Sağlıklı gönüllülerden alınan EV açısından zengin plazma örneklerinde EV konsantrasyonunu değerlendirmek için süper hızlı santrifüjleme (1,00,000 x g, 70 dk) gerçekleştirildi. Sonuçlar, EV konsantrasyonundaki bir artışın EV-ACT'yi kısalttığını, EV konsantrasyonundaki bir azalmanın ise EV-ACT'yi uzattığını ortaya koydu (Şekil 3A). EV-ACT süresi, EV seviyeleri ile negatif bir korelasyon gösterebilir. Klinik hastalardan alınan birkaç örnek incelendi ve bulgular, preeklampsi, kalça kırığı ve akciğer kanseri (soldan sağa) hastalarından alınan EV'den zengin plazma örneklerinin sağlıklı gönüllülere kıyasla önemli ölçüde daha kısa EV-ACT sürelerine sahip olduğunu gösterdi (Şekil 3B).
Sonuç olarak, EV prokoagülan aktivitesini saptamak için hızlı ve uygun maliyetli bir deneysel yöntem önceden oluşturulmuştur ve yatak başı muayenelerde klinik uygulamalar için umut vaat etmektedir.
Şekil 1: Pıhtı analizörünün şematik diyagramı ve fiziksel görüntüsü. (A) ve (B) sırasıyla analizörün ana bileşenlerini ve çalışma ayarlarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EV'den zengin plazmada EV'nin temsili akış sitometrisi. (A) Niteliksiz EV'den zengin plazma örnekleri. (B) Nitelikli EV açısından zengin plazma örnekleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Numunenin EV-ACT'sinin temsili sonuçları. (A) Sağlıklı gönüllülerden alınan EV açısından zengin örneklerde EV çıkarılması ve EV konsantrasyonundan sonra EV-ACT sonuçları (soldan sağa, süpersantrifüjden sonra tortunun süspansiyonu, EV açısından zengin plazma ve ultrasantrifüjden sonra süpernatant). (B) Sağlıklı gönüllülerden ve hastalardan alınan EV'den zengin örneklerin EV-ACT sonuçları (Soldan sağa, preeklampsi, kalça kırığı, akciğer kanseri ve sağlıklı gönüllü). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, EV'den zengin plazmanın hazırlanması tarif edildi ve yöntemin rasyonalitesi akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Daha sonra, rekalsifiye plazma örnekleri, viskoelastisite ilkelerine dayalı bir pıhtı analizörü kullanılarak ACT süresi için analiz edildi24. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, ultrasantrifüjleme yoluyla elde edilen EV'lerin konsantrasyonunun EV-ACT süresini kısalttığı, ultrasantrifüjlemeden sonra EV seviyelerini düşüren süpernatantın ise uzun EV-ACT süreleri sergilediği bulundu. Bu bulgular EV-ACT sonuçları ile EV düzeyleri arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Şekil 3B'de, preeklampsi, kalça kırığı ve akciğer kanseri olan hastalardan alınan plazma örneklerinin EV-ACT'si sağlıklı gönüllülerle karşılaştırıldı ve hastalık gruplarında önemli ölçüde daha kısa EV-ACT süreleri ortaya çıktı. Önceki raporlar, bu hastalıklar için plazmada pıhtılaşmayı teşvik eden EV'lerin yüksek seviyelerini göstermiştir 27,28,29. Bununla birlikte, plazmada bulunan diğer faktörlerin EV-ACT sonuçlarını etkileyebileceği ve bu etkileyen faktörlerin daha fazla araştırılması gerektiği belirtilmelidir. Bu test, EV'lerin belirli hastalıkların hiper pıhtılaşabilir durumundaki önemli rolünü tanımayı önermekte ve EV prokoagülan aktivitesi için düşük maliyetli ve hızlı bir tespit yönteminin eksikliğini ele almaktadır.
İzole kan örneği sistemi içinde, pıhtılaşma ile ilgili maddeler kan hücrelerine, trombositlere, hücre metabolitlerine (esas olarak EV'ler) ve diğer "görünmez" bileşenlere (pıhtılaşma faktörleri ve antikoagülan faktörler gibi) ayrılabilir30,31,32. Pıhtılaşma mekanizmasının karmaşıklığı göz önüne alındığında, diğer faktörlerden kaynaklanan paraziti en aza indirmek için algılama sistemi EV açısından zengin plazmaya basitleştirildi. Bu süreçteki temel adımlar, numune işleme sırasında yapay EV'lerin üretilmesini önlemeyi ve trombosit kontaminasyonunu en aza indirmeyi içerir. Bu nedenle, diferansiyel santrifüj prosedürünü 0,5 saat içinde başlatmak ve numune alındıktan sonra 2 saat içinde tespiti tamamlamak gerekir. Önceki çalışmalar, yeterince yüksek merkezkaç kuvveti kullanmanın ve süpernatantın üst yarısını tutmanın trombosit kontaminasyonunu etkili bir şekilde azaltabileceğini göstermiştir33. Akış sitometrisi, EV'den zengin plazmada rezidüel trombositleri tespit etmek için kullanıldı ve çok düşük varlıklarını doğruladı. Niteliksiz numuneler öncelikle trombosit kontaminasyonundan ve işleme prosesinin neden olduğu hücre parçalanmasından kaynaklanır. Trombosit kontaminasyonu, EV'lerin "kapısı" dışındaki partiküllerin varlığı ile karakterize edilirken, hücre parçalanması EV'lerin "kapısı" içinde ayrı bir küme olarak görünür.
Son çalışmalar, bazı hastalıklarda önemli ölçüde yüksek plazma EV seviyelerini doğrulamıştır34,35. Bu EV'ler öncelikle yüzeylerinde fosfatidilserin (PS) ve doku faktörü (TF) varlığı yoluyla pıhtılaşmayı teşvik eder. Bu nedenle, EV açısından zengin plazmanın ACT süresi büyük ölçüde pıhtılaştırıcı EV'lerin seviyesine bağlıdır. Bu testin bir sınırlaması, pıhtılaşma faktörlerinin seviyelerinin, EV-ACT analizi sırasında pıhtılaşma süresini etkileyecek ölçüde önemli ölçüde değişmemesini sağlama ihtiyacıdır. Bununla birlikte, hastalık başlangıcından sonra pıhtılaşma faktörü seviyelerindeki değişiklikler üzerine yapılan çalışmalar nispeten azdır ve bunların EV-ACT üzerindeki etkilerinin daha ileri araştırmalarda değerlendirilmesi gerekmektedir. Ayrıca, antikoagülan ilaçların aşırı kullanımı EV-ACT sonuçlarını önemli ölçüde etkileyebilir, bu nedenle bu tedavi sırasında bu yöntem kullanılmamalıdır.
Prokoagülan EV'leri belirlemek için her birinin avantajları ve dezavantajları olan çeşitli yöntemler mevcuttur. Piwkham ve ark. EV süspansiyonunu normal plazma ile karıştırarak ve 37 ° C'de bir su banyosunda kan pıhtısı oluşum zamanını gözlemleyerek EV prokoagülan aktivitesini değerlendirdi36. Bu yöntem basit olmasına rağmen, pıhtı oluşum zamanının öznel gözlemi, farklı gözlemciler arasında sonuç farklılıklarına yol açabilir. Patil ve ark. yarı otomatik bir koagülometre37 üzerinde Russell engerek zehiri kullanarak prokoagülan mikropartikül testi için kurum içi standartlaştırılmış bir pıhtılaşma testi kullandılar. Bu algılama yöntemi, yüksek verimlilik ve basitlik sunan yarı otomatik ekipman kullanır. Bununla birlikte, faktör X'i aktive etmek için Russell engerek zehirinin eklenmesi, plazmada laktadherin proteini gibi diğer antikoagülanların varlığını gözden kaçırır. Bu yöntem, plazmadaki prokoagülan EV'ler ve antikoagülan bileşenler arasındaki dengeye dayalı olarak sonuçları değerlendirir ve plazma örneğinin pıhtılaşma işlevinin daha doğru bir şekilde yansıtılmasını sağlar.
Mevcut pıhtılaşma fonksiyon testleri öncelikle tam kanda veya trombositten zengin kanda trombin aktivasyon süresine odaklanır veya pıhtılaşma faktörlerindeki eksiklikleri tespit eder24. EV prokoagülan aktivitesi için bir test yöntemi geliştirmek, EV'lerin hastalıktaki ve gelecekteki tedavilerdeki rolünün aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. Sadece CaCl2 ilavesini içeren basit numune hazırlama işlemi, klinisyenlerin hastaların pıhtılaşma fonksiyon durumunu hızlı bir şekilde belirlemesi için testi kolaylaştırır. EV-ACT testinin gerçekleştirilmesi kolaydır ve sonuçlar 10-15 dakika içinde elde edilir, bu da onu bir başucu testi olarak geliştirme için çok uygun hale getirir. Önceki çalışmalar, preeklampsi, tümörler ve kırıklarda EV-ACT uygulamalarını geçici olarak tanımlamıştır. Gelecekteki araştırmalar, EV-ACT'nin klinik uygulama beklentilerini keşfetmeye devam edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, hibe no. 81930031, 81901525. Ayrıca, bize makine ve teknik rehberlik sağladığı için Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.'ye teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
References
- Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
- Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
- Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
- You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
- Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
- Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
- Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
- Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
- Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
- Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
- Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
- Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
- Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
- Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
- Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
- Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
- Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
- Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
- Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
- Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
- Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
- Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
- Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
- Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
- Kubo, H.
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
- Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
- Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
- Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
- Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
- Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
- Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
- Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
- Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).
