Summary
כאן, שיטה מתוארת להאכיל Drosophila melanogaster עם תרופות ותמציות צמחים ולהעריך את השפעתם על מערכת העיכול על ידי ניתוח זבובי פירות צואה פיקדונות. הזבובים שטופלו בתרופות יכולים לשמש כמודל למחקר נוסף.
Abstract
כדי לחקור את הפיזיולוגיה של מערכת העיכול האנושית, מדענים ביו-רפואיים הסתמכו על שימוש באורגניזמים לדוגמה. למרות שחוקרים רבים השתמשו בעכברים כמודל לחקר תפקוד המעי, רק דיווחים מעטים התמקדו בדרוזופילה מלנוגסטר (D. melanogaster). בהשוואה לעכברים, לזבובי הפירות יתרונות רבים, כגון מחזור חיים קצר, תחזוקה חסכונית ופשוטה, וללא בעיות אתיות. יתר על כן, הפיזיולוגיה של מערכת העיכול, האנטומיה ומסלולי האיתות של יונקים שמורים מאוד ב-D. melanogaster. תמציות צמחים שימשו באופן מסורתי לטיפול בשלשולים ועצירות. לדוגמה, Psidium guajava (P. guajava) הוא אחד החומרים נוגדי השלשול הידועים ביותר באזורים הטרופיים. עם זאת, אף מחקר לא העריך את ההשפעה של תרופות נוגדות שלשול ומשלשלות ותמציות צמחים ב- D. melanogaster, ועדיין לא ידוע אם השפעות דומות (למשל, מרבצי צואה קטנים יותר, מרוכזים יותר ושופעים פחות במקרה של תרופות נוגדות שלשול) יכולות להתרחש בזבובי הפירות בהשוואה ליונקים. במחקר זה, השפעה נוגדת שלשולים הנגרמת על ידי P. guajava מודגמת בזן D. melanogaster המציג פנוטיפ שלשול. דגימת צואה המיוצרת על ידי זבובים מנוטרת באמצעות מזון בתוספת צבע. פרוטוקול זה מתאר את השיטה המשמשת להכנת מזון עם תרופות, הערכת מרבצי הצואה של זבובים הניזונים מתכשירי מזון אלה, ופירוש הנתונים המתקבלים.
Introduction
מערכת העיכול (GI), המכונה גם מערכת העיכול, אחראית על העיכול והספיגה של חומרים מזינים והפרשת מוצרים לא מעוכלים1. מערכת העיכול חשופה למגוון הפרעות שעלולות לגרום לאי נוחות, כאב ושיבוש בחיי היומיום. הפרעות במערכת העיכול כוללות כאבי בטן ואי נוחות, נפיחות, צרבת, קלקול קיבה או הפרעות בעיכול, בחילות, הקאות, שלשולים ועצירות2. שלשול הוא התסמין השכיח ביותר של הפרעת GI3, והוא מוגדר כמחלה עם לפחות שלושה צואה רופפת ומימית במהלך תקופה של 24 שעות4. שלשול נגרם על ידי מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים, טפילים, פטריות, והוא יכול להיגרם גם על ידי תרופות 5,6. ברחבי העולם, שלשול ממשיך להיות הגורם השני לתמותה בקרב ילדים מתחת לגיל5 7. למרות שלשול יכול לפתור את עצמו, זה יכול גם להצביע על מצב בסיסי חמור יותר אם זה נמשך יותר מכמה ימים.
כדי לחקור את מערכת העיכול, חוקרים פונים למודלים של בעלי חיים כגון עכברים, חולדות וחזירים 8,9. עם זאת, השימוש בבעלי חיים אלה יכול להיות יקר וגוזל זמן מכיוון שהם דורשים מתקנים מיוחדים ושיקולים אתיים. מחקרים אחרונים הראו כי D. melanogaster יכול לשמש כמודל לחקר מערכת העיכול ולחקור כמה מנגנונים כגון שמירה על הומאוסטזיס רגנרטיבי, התפתחות הזדקנות החיסון, אובדן תפקוד מחסום אפיתל, ואת הירידה בהומאוסטזיס מטבולי10,11. D. melanogaster, המכונה זבוב הפירות, חולק רמה גבוהה של הומולוגיה גנטית עם בני אדם; מאמינים כי לכ-75% מהגנים של מחלות אנושיות יש הומולוג פונקציונלי בזבוב12. יש להם גם מערכת עיכול פשוטה המורכבת ממעי קדמי, מעי בינוני ומעי אחורי13. D. melanogaster קל לתרבית במעבדה וניתן להנדס גנטית בדרכים שונות14. לכן, שימוש ב- D. melanogaster לבדיקת in vivo הוא כלי רב עוצמה המאפשר לחוקרים לחקור תהליכים ביולוגיים מורכבים בסביבה מבוקרת.
על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -80% מהאנשים החיים במדינות מתפתחות משתמשים ברפואה מסורתית לצורכי הבריאות העיקריים שלהם15. השימוש הגבוה בצמחי מרפא יכול להיות מוסבר בכך שהם זמינים בקלות, זולים, ויש להם מעט תופעות לוואי16. חלקי הצמח העיקריים המשמשים בטיפול צמחי כוללים עלים, קליפה, שורשים, זרעים17 בעוד שיטות ההכנה העיקריות הן עירוי, מרתח ו maceration18. תרופות צמחיות אלה מכילות חומרים פיטוכימיים כגון אלקלואידים, טרפנואידים, פלבנואידים, סטרואידים, טאנינים ופחמימות19, שיש להם השפעות טיפוליות על גוף האדם. אנשים משתמשים במגוון צמחי מרפא לטיפול בהפרעות במערכת העיכול כגון שלשולים, כאבי בטן ודיזנטריה20. לדוגמה, Psidium guajava הוא אחד הצמחים הנפוצים ביותר לטיפול בשלשולים בעולם. בדיקות פרמקולוגיות וקליניות שונות כבר הראו את בטיחותו, מה שהופך אותו מועמד טוב נגד שלשולים לחקור21,22. עם זאת, המגבלות העיקריות של תרופות צמחיות הן חוסר יעילות והערכת בטיחות, כמו גם חוסר מידע מוגדר ומלא על הרכב תמציות צמחים בשימוש23. כדי לאמת את היעילות והבטיחות של תרופות צמחיות, נדרשת גישה שיטתית הכוללת תיקוף ניסיוני וקליני והגישה צריכה להיות נתמכת על ידי מספיק נתונים ממחקרי in vivo ו- in vitro.
כדי להעריך תרופות מסורתיות על יעילותן בטיפול בשלשולים, השימוש בעכברים וחולדות היה דומיננטי בעשורים האחרונים24,25. בשל היתרונות העיקריים שהוזכרו קודם לכן, כלומר, קלות שימוש, זול, לשכפל, שמורות פונקציות ספיגה ועיכול בין זבובים ויונקים, אנו מציעים להשתמש D. melanogaster כמודל להערכת פעילות נוגדת שלשולים של צמחים. הפנוטיפ השלשול ב- D. melanogaster יכול להיות מאופיין במספר תכונות, כולל שפע מוגבר של משקעי צואה, גדלי פיקדון גדולים יותר, צבע בהיר יותר (פחות מרוכז), וחומר צואה גבוה יותר26. ניתן לכמת פנוטיפ זה באמצעות פרמטרים שונים: מספר משקעי צואה, שטח כולל של פיקדונות, בהירות ממוצעת, וצפיפות אופטית משולבת כוללת (IOD). סה"כ IOD מוגדר כתכולת הצבע הכוללת של המרבץ, כלומר סך כל החומר הצואתי המופרש27. בעבר, בדיקה פותחה כדי לנתח פיקדונות צואה של ד melanogaster27,28. בבדיקה זו, הקורא האולטימטיבי של גללים (T.U.R.D.) שימש ככלי ניתוח צואה, המאפשר לבדוק את מספר, גודל וקלילות של משקעי צואה ובכך לפקח על הפיזיולוגיה של המעי של זבובי הפירות. עם זאת, שיטה זו מעולם לא יושמה כדי להעריך את הפנוטיפ השלשול בזבובים. הגן Ion Transport Peptide (ITP) הוא מווסת אנדוקריני חשוב של צמא והפרשה ומשלב הומאוסטזיס מים עם הזנה ב-D. melanogaster. במחקר שנערך לאחרונה, הוכח כי מהירות מעבר המזון במערכת העיכול ותדירות אירועי עשיית הצרכים הופחתו על ידי ביטוי יתר של ITP ועלו על ידי הפלה של ITP. הפנוטיפ האחרון תואר כשלשול על ידי מחברי מחקר זה29.
בפרוטוקול זה, גרסה שונה של בדיקת הפקדת צואה משמשת להערכת ההשפעה של סוכן נוגד שלשולים (כלומר, תמצית עלי גויאבה) על מערכת העיכול של D. melanogaster באמצעות זן ITPi כמודל שלשול. המטרה הכוללת של שיטה זו היא: 1) לספק שיטה קלה ואמינה להערכת ההשפעה נוגדת השלשולים של תרופות ותמציות צמחים, 2) לאפשר גילוי של תרכובות ביו-אקטיביות האחראיות להשפעה נוגדת השלשולים בתמציות צמחים על ידי יישום גישה מונחית ביואקטיביות.
Protocol
1. הכנת תמצית צמחים
- לאסוף Psidium guajava L. עלים30 מעץ בוגר ולעבד כדלקמן: לייבש את העלים בתנור ב 40 מעלות צלזיוס במשך 6 ימים, ולאחר מכן יבש באוויר במשך 6 ימים, ולאחר מכן יבש שוב בתנור ב 40 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים, ולבסוף להכין אבקת עלים על ידי טחינת העלים היבשים בטחינה טחינה או מטחנת קפה.
- מאצרט 100 גרם של אבקה מיובשת ב 1 L של 96% אתנול במשך 24 שעות, עם ערבוב מתמשך באמצעות שייקר. יש להעביר את שאריות הצמח לאותו תהליך פעם נוספת ולאדות את התסנין שנוצר ליובש באמצעות מאייד סיבובי ואקום בלחץ מופחת (175 mbar) ב-40°C.
- ממיסים את תמצית הצמח באתנול כדי להשיג את הריכוז הרצוי. לקבוע את הריכוז האופטימלי (באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן) על ידי בדיקת סדרה של ריכוזים.
- עבור תמציות צמחים, בדקו טווח ריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, 10 מ"ג/מ"ל, 100 מ"ג/מ"ל והשתמשו באלה שאינן משפיעות על שיעור ההישרדות של הזבוב. עבור תרכובות טהורות, בדוק את טווח הריכוזים הבא: 0.05, 0.5, 5 ו- 50 mM12.
2. הכנת מדיום מזון
- מודדים 100 מ"ל מים מזוקקים ויוצקים לתוך הכד עם 4 גרם סוכר ו-0.8 גרם אגר (ראו טבלת חומרים). מחממים ל-100°C (תוך כדי ערבוב) ומחזיקים למשך 10 דקות.
- מנמיכים את הטמפרטורה ל 80 מעלות צלזיוס, מוסיפים 7.4 גרם קמח ו 2.8 גרם שמרים תוך כדי ערבוב. מחממים לפחות 20 דקות, עדיין מערבבים ושולטים בטמפרטורה אשר צריכה להיות סביב 80 מעלות צלזיוס.
- מוסיפים היטב את תמיסת החומצה הפרופיונית של מולדקס (1 מ"ל מולדקס ו-0.3 גרם חומצה פרופיונית). המתינו עד שהטמפרטורה תרד לסביבות 50°C, הוסיפו את תמיסת תמצית הצמח (1 מ"ג/מ"ל) ו-0.5 גרם אבקת ברומופנול כחולה.
הערה: עיין בסעיף 1.3.1 לקבלת פרטים נוספים על הריכוזים האחרים שיש לבדוק. - מזגו את האוכל לצלחות הפטרי ועצרו כאשר צלחת הפטרי מלאה (איור 1A). מניחים לצלחות הפטרי להתקרר לטמפרטורת החדר (כ-3 שעות), סוגרים את המכסה ומאחסנים במקרר בטמפרטורה של 4°C.
הערה: יש לאחסן צלחות פטרי במקרר לא יותר משבועיים כדי למנוע אידוי מים.
איור 1: הדגמה של תהליך הניסוי לבדיקת משקעי צואה. (A) תמונה המציגה צלחות פטרי מלאות במדיום מזון. דאגו שיהיה מספיק אוכל בצלחת הפטרי, כך שלא יהיו רווחים שילכדו את הזבובים וימנעו מהם לזוז. עם זאת, אין להעמיס את צלחת פטרי עם מזון, כך פני השטח יכול להיות מכוסה באופן שווה. (ב) תמונה של המרית כמתואר בפרוטוקול. (ג) תמונה של בדיקת הפקדת הצואה כמתואר בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. הכנת זבובים
- הכינו את מיכלי CO2 , אקדח ניפוח CO2 עם מחטים, משטח זבוב, מברשת צבע ומיקרוסקופ. תחנת הזבוב מספקת CO2 הן למשטח הזבוב והן לאקדח הניפוח. משטח הזבובים משמש למיון זבובים, ואילו אקדח הנשיפה CO2 משמש להרדים זבובים בבקבוקונים, בקבוקים וצלחות פטרי.
- תקננו את גיל הזבובים על ידי בחירת בקבוקונים המכילים גלמים (לפחות 10) והשליכו את הזבובים הבוגרים מהצינור בשיטה הבאה. בזה אחר זה, הופכים את הבקבוקונים ומכניסים את המחט בין פקק הכותנה לדופן הבקבוקון. מרדימים זבובים בוגרים עם אקדח הנשיפה CO2 עד שכל הזבובים ישנים על תקע הכותנה (יש צורך בכמה שניות כדי להרדים אותם, ופעולת ההרדמה תימשך מספר שניות לאחר שחרור אקדח הנשיפה). פתחו את הבקבוקון מעל בקבוק זכוכית המכיל 70% אתנול וזרקו לתוכו את הזבובים. סגור את הבקבוקון עם תקע כותנה ולשמור אותו באינקובטור ב 25 ° C עם 60% לחות. הגדר את מחזור האור של האינקובטור ל- 12 שעות אור / 12 שעות כהות.
- לאחר הדגירה (מקסימום 8 שעות), ממיינים אותם לנקבות וזכרים בתולים תחת המיקרוסקופ ומשטח זבובים על ידי סיבובם על גבם והסתכלות על איברי המין שלהם.
- איברי המין הנקביים חיוורים בהשוואה לאיברי המין הגבריים, שהם בצבע אדמדם. ניתן לזהות זכרים גם על ידי נוכחות של זיפים כהים, הנקראים מסרקות מין, על זוג רגליהם הקדמיות. מחלקים את הזבובים לשני צינורות טריים (אחד לזכרים ואחד לנקבות) ודגרים עליהם במשך 6-8 ימים ב 25 מעלות צלזיוס.
הערה: ב 25 °C (75 °F), הנקבות נשארות בתוליות במשך כ 8 שעות לאחר הבקיעה.
- איברי המין הנקביים חיוורים בהשוואה לאיברי המין הגבריים, שהם בצבע אדמדם. ניתן לזהות זכרים גם על ידי נוכחות של זיפים כהים, הנקראים מסרקות מין, על זוג רגליהם הקדמיות. מחלקים את הזבובים לשני צינורות טריים (אחד לזכרים ואחד לנקבות) ודגרים עליהם במשך 6-8 ימים ב 25 מעלות צלזיוס.
4. בדיקת הפקדת צואה
- תייגו את צלחות הפטרי עם הזן, המין והסם המתאימים כדי למנוע בלבול בין צלחות הפטרי. ערמו את צלחות הפטרי זו על גבי זו.
- קבלו את צלחות הפטרי המכילות את המזון הצבוע והפכו אותן על נייר הניקוי כדי לספוג את הנוזלים העודפים. בעזרת מרית (איור 1B), חתכו את המזון ל-12 חלקים שווים ואז השתמשו במרית כדי להכניס פרוסה אחת לתוך צלחת פטרי ריקה.
הערה: בהתאם למספר העותקים המשוכפלים, ניתן להגדיל את מספר הפרוסות שיש לחתוך עד 20 לכל צלחת פטרי. כל פרוסה צריכה להיות באותו גודל. - מרדימים את הזבובים עםCO2 עד שכל הזבובים ישנים על פקק הכותנה. העבירו שישה זבובים בריאים בכל צלחת פטרי (איור 1C), סגרו את המכסה מיד, ואז הניחו אותם באינקובטור (25°C, 60% לחות, 12 שעות בהירות/ 12 שעות כהות).
- כדי להבטיח שהזבובים לא יברחו מצלחת הפטרי במהלך הניסוי, חברו את הכיסוי העליון והתחתון של צלחת הפטרי בעזרת סרט הדבקה. עבור כל קבוצת בדיקה, הכינו שש צלחות פטרי משוכפלות (לפחות).
- לאחר שאפשרו לזבובים לחזור לאחור במשך 24 שעות, השתמשו ב-CO2 כדי להרדים אותם, העבירו את הזבובים למיכל מלא באתנול 70% והשליכו את שאריות המזון.
- שמרו את צלחות הפטרי והמשיכו לשלב 5.
5. כימות צלחות פטרי
- הגדר תיקייה במחשב ושנה את שמה, על-ידי הכללת שם זן הניסוי, מין הזבובים וסוג התרופות שבהן נעשה שימוש. בתוך תיקיה זו, צור תיקיות משנה בשם Original, Cut ו- Analysis.
- סרוק את צלחות Petri באמצעות סורק ברזולוציה גבוהה עם רזולוציה אופטית של 6,400 פיקסלים לאינץ' (ppi). סרוק את המכסה העליון והתחתון של כל צלחת פטרי בנפרד על ידי מיקומם בנפרד במרכז שדה הסורק.
- פתח את היישום המותקן במחשב. חלון פתיחה ייפתח על מסך המחשב עם כל ההגדרות הכלליות (איור 2A).
הערה: אל תשנה את ההגדרות המתקדמות. שלב זה תקף רק עבור משתמשים בעלי אותו סורק כפי שמוצע בטבלת החומרים. עיין בהנחיות אם אתה משתמש בתוכנה אחרת.- תן שם לצלחת הפטרי ביישום, על ידי הכללת מספר רצף, כריכה עליונה או תחתונה, מין וסוג המזון שבו נעשה שימוש. בחר את ערכת תיקיית המשנה המקורית בשלב 5.1.
- תצוגה מקדימה של צלחת הפטרי. לחץ על תצוגה מקדימה בתחתית החלון, המתן מספר שניות עד שהסורק יסרוק מראש, ואז יופיע חלון על מסך המחשב. הזיזו את הריבוע המוצג על המסך כדי להקיף את צלחת הפטרי.
- לחץ על סריקה בפינה השמאלית התחתונה של החלון במסך המחשב, הסריקה נשמרת אוטומטית כתמונה בתיקייה הנבחרת.
- חתוך את התמונה באמצעות יישום (למשל, יישום קוד פתוח פיג'י), כך שאף חפצים ושאריות מזון לא ייחשבו כפיקדונות.
הערה: השלבים הבאים תקפים רק עבור משתמשים בעלי יישום פיג'י. עיין בהנחיות אם אתה משתמש בתוכנה אחרת.- פתח את היישום פיג'י, המתן מספר שניות עד שיופיע סרגל כלים על המסך.
- גררו את התמונה לחיתוך אל סרגל הכלים. בחר את הסמל השלישי בחירות מצולע בסרגל הכלים, חתוך את החלק הלא רצוי של התמונה (תרשים העוגה הצבעוני) על ידי לחיצה על המסך כדי לסמן זווית סביב תרשים העוגה (איורים 2B-1,2).
הערה: בשעת תיחום אזור החיתוך בתמונה, הכרחי שהמסגרות שנבחרו יחוברו בצורה חלקה מקצה לקצה. - לחצו על 'עריכה' בפינה השמאלית העליונה של הסרגל ולאחר מכן על מילוי/ניקוי בחוץ (איור 2B-3).
- כדי לשמור את התמונה, לחץ על קובץ בפינה השמאלית העליונה של הסרגל, לאחר מכן על שמירה בשם ולבסוף על Tiff. בחר את תיקיית המשנה גזור קבוצה בשלב 5.1.
הערה: בשעת שמירת התמונה החתוכה, ודא שאין תווים מיוחדים (לדוגמה, !, &, $, #, _,-,...) או תווים רבים מדי בשם הקובץ .
איור 2: שלבים מרכזיים בתהליך ניתוח הנתונים מבדיקת הפקדת צואה. (A) צילום מסך המציג את פרטי ההגדרה של יישום הסריקה. (B) תמונות שנחתכו באמצעות היישום Fiji. יש לוודא כי אין חפצים ושאריות מזון נחשבים פיקדונות. (C) צילום מסך המראה כיצד הוא נראה בעת פתיחת היישום Excel_merge-v4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
6. זיהוי משקעי צואה באמצעות הקורא האולטימטיבי של תוכנת קוד פתוח גללים
הערה: ניתן למצוא את המבוא והשימוש של הקורא האולטימטיבי של תוכנת גללים בקובץ משלים 1.
- ראשית, פתח את תוכנת T.U.R.D. (איור משלים 1). צור ניסוי חדש ותן שם למסמך, ולאחר מכן שמור אותו בתיקיית המשנה ניתוח שהוגדרה בשלב 5.1.
- לחץ על צלחות ולאחר מכן על הוסף צלחת. בחר את צלחת פטרי לעיבוד. מופיע חלון חדש עם שמות הלוחות שנבחרו ופרמטרים חדשים. הגדר את גודל הגוש, ההסטה, הגודל המינימלי והגודל המרבי (איור משלים 2).
- כדי לוודא שמשקעי הצואה שזוהו הם הנכונים, לחצו על צלחות, לאחר מכן בדקו את הלוחות שנבחרו, לאחר מכן גרפיקה, וצפו בתמונות מבוארות (איור משלים 3). התקרבו והתבוננו בספירות. אם יש רק כמה פיקדונות שלא צריכים להיכלל בניתוח, בטל את הבחירה בפיקדונות שיוחרגו (איור משלים 4).
- כדי שכל תמונה חדשה תעובד, הפעל מחדש משלב 6.3.
- לאחר ניתוח הלוחות באמצעות תוכנת T.U.R.D, שנה את מספר הזבובים על ידי לחיצה על No. זבובים (איור משלים 5).
- שנה את שם הקבוצה על-ידי לחיצה על לוחות > ערוך קבוצות > הוסף ולאחר מכן, בעמודה קבוצה , בחר את שם הקבוצה.
- יצא את הנתונים המשוכפלים השונים בנפרד על ידי לחיצה על נתח סטטיסטיקה תיאורית > > בחר קבוצה (איור משלים 6). שמור את כל קבצי הגליונות האלקטרוניים (.csv) באותה תיקיה.
- כדי לאסוף את כל הקבצים (שהושגו בשלב 6.7) בגיליון אלקטרוני ייחודי, פתח את היישום Excel_merge-v4 (קובץ קידוד משלים 1), המתן עד שיופיע המשפט הבא בחר את נתיב התיקיה (עם קבצי .csv):, ולאחר מכן הדבק את כתובת התיקיה לעיל. לדוגמה, הנתיב יכול להיות C:\Experiment\Fecal deposit test\ ולאחר מכן לחץ על Enter פעמיים במקלדת (איור 2C). לאחר מכן, קובץ גיליון אלקטרוני חדש נוצר באותה תיקייה. קובץ הגיליון האלקטרוני החדש כולל את כל הקבצים המיוצאים בגיליונות שונים.
- בקובץ הגיליון האלקטרוני הקודם, הוסף גיליון נוסף כדי לאסוף את הממוצע של כל פרמטר של כל העותקים המשוכפלים (השתמש בפונקציה VLOOKUP לעיבוד הנתונים). דוגמה לכך מובאת בטבלה משלימה 1.
- נתח את ערך p.
Representative Results
המחקר המוצג כאן מראה כי מדידת שלשולים ב D. melanogaster ניתן להשיג באמצעות שימוש בבדיקת הפקדת צואה. הבדלים משמעותיים בין הפנוטיפים (שלשוליים או לא) יכולים להיקבע על ידי ניתוח פרמטרים שונים, כולל מספר משקעי הצואה, השטח הכולל של פיקדונות, השטח הממוצע של פיקדונות, הבהירות הממוצעת, ואת הצפיפות האופטית המשולבת הכוללת (IOD), שהיא מדד של כמות הצבע הכוללת הקיימת במרבץ ומייצגת את תכולת החומר הצואה הכוללת המופרשת27.
הפלת הגן ITP בזבובים יכולה לגרום לפנוטיפ שלשול, המאופיין בתדירות מוגברת של עשיית צרכים, מה שהופך אותם למודל מתאים לחקר שלשולים29. בהקשר של ניסוי זה, זן ITPi (w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) הופעל וגודל על מדיום סטנדרטי. תמצית עלי Psidium guajava נבחרה כהתערבות נוגדת שלשולים, בהתחשב בשימוש הנרחב של צמח זה באזורים טרופיים לטיפול בשלשולים. קרופלמר, תרופה נוגדת שלשולים, אושרה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) לספק הקלה סימפטומטית לשלשולים לא זיהומיים בחולים מבוגרים עם HIV / איידס שעברו טיפול אנטי-רטרו-ויראלי31. Crofelemer הוא תמצית מלטקס של Croton lechleri Müll.Arg. קליפת גזע32. לופרמיד היא תרופה סינתטית המשמשת ברחבי העולם לטיפול בשלשולים33. הן קרופלמר והן לופרמיד שימשו כבקרות חיוביות פוטנציאליות.
ההשערה הייתה שהאכלת זבובים בתמצית P. guajava , Crofelemer ו-Loperamide תפחית את הפנוטיפ השלשולי בהשוואה לאלו הניזונים ממזון רגיל. כדי לבחון השערה זו, בוצעה מדידה של משקעי צואה ב- D. melanogaster על ידי השוואת מספר פרמטרים בין זבובים הניזונים ממזון רגיל לבין אלה הניזונים מתמצית P. guajava (1 גרם / 100 מ"ל), קרופלמר (1 גרם / 100 מ"ל) ולופרמיד (10 מ"ל). לצורך מערך הניסוי נעשה שימוש בנקבות או זכרים בתולים בני 6-7 ימים. כל צלחת פטרי הכילה שישה זבובים, ובוצעו שישה העתקים. הזבובים גודלו במשך 24 שעות, ולאחר מכן כל קבוצה נותחה. מבחן t של התלמיד שימש להשוואת ההבדל המשמעותי בין קבוצת המבחן. התוצאות מראות כי מספר משקעי הצואה (איור 3A), השטח הכולל של המרבצים (איור 3B) וה-IOD הכולל (איור 3C) הציגו ערכים גבוהים משמעותית בקבוצת המזון הרגילה בהשוואה לקבוצת תמצית P. guajava (1 גרם / 100 מ"ל), הן בנקבות בתולות והן בזכרים. לרוע המזל, לופרמיד לא הראה כל השפעה בשני המינים (אך כבר הוכח כי הוא פועל כסוכן נוגד עוויתות ב - D. melanogaster)34 בעוד שלקרופלמר הייתה השפעה על נקבות בלבד.
איור 3: ניתוח זני ITPi . זן ITPi נותח תחת ארבעה תנאים: הזנה ממזון רגיל, מזון בתוספת 1 גרם / 100 מ"ל P . guajava לחלץ, 1 גרם / 100 מ"ל Crofelemer, ו 10 mM Loperamide. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD של כל מצב הן בנקבות והן בזכרים (עבור שישה העתקים של שני צדדים של צלחת פטרי). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t של סטודנט שהשווה בין שתי קבוצות. ערכי p מוצגים באופן הבא: *: p < 0.05; **: עמ' < 0.01; p < 0.001, ****: p < 0.0001.: (A) מספר מרבצי הצואה של זן ITPi הושווה בזבובים שניזונו ממזון בתוספת 1 גרם/100 מ"ל קרופלמר, 10 מ"מ לופרמיד, 1 גרם/100 מ"ל תמצית P. guajava ובזבובים שניזונו ממזון רגיל. בנוסף, נותח גם ההבדל במספר משקעי הצואה בין נקבות בתולות לזכרים. בשתי הקבוצות, מספר משקעי הצואה היה גבוה משמעותית בזבובים שניזונו ממזון רגיל מאשר אלה שניזונו מתמצית P. guajava במינון 1 גרם/100 מ"ל. (B) השטח הכולל של מרבצי צואה של זן ITPi הושווה בזבובים שניזונו ממזון רגיל ובזבובים שניזונו ממזון בתוספת 1 גרם/100 מ"ל תמצית P. guajava , 1 גרם/100 מ"ל קרופלמר ו-10 מ"מ לופרמיד. אצל זכרים ונקבות, השטח הכולל של מרבצי הצואה היה גבוה משמעותית בזבובים שניזונו ממזון רגיל מאשר אלה שניזונו מתמצית P. guajava במינון 1 גרם/100 מ"ל. (C) ההבדל ב-IOD הכולל של זן ITPi נותח בין זבובים שניזונו ממזון רגיל לבין זבובים שניזונו ממזון בתוספת 1 גרם/100 מ"ל תמצית P. guajava , 1 גרם/100 מ"ל קרופלמר ו-10 מ"ל לופרמיד. אצל זכרים ונקבות, סך IOD היה גבוה משמעותית בזבובים שניזונו ממזון רגיל מאשר אלה שניזונו מתמצית P. guajava במינון 1 גרם / 100 מ"ל. קיצורים: F = נקבה; M = זכר; קרופה = קרופלמר; לופה = לופרמיד; גם לא מזון = מזון רגיל; P. gua ext = תמצית Psidium guajava . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כדי להוכיח שההפרשה המופחתת שנצפתה בקבוצת תמצית P. guajava נובעת מההשפעה המעכבת של התמצית ולא מצריכת מזון מופחתת, ביצענו את שיטת35 להערכת צריכה ישירה ומעקב אחר צריכת מזון מוצק (DIETS). התוצאות הראו שלא היו הבדלים משמעותיים בצריכת המזון בין הקבוצות שסופקו על ידי תרופות לבין אלה ללא תרופות, למעט לופרמיד אצל גברים, שגרם לזבובים לצרוך פחות מזון מהרגיל (איור 4).
איור 4: בדיקת האכלה. בדיקת ההאכלה מדדה צריכת מזון מוצק בזבובים. הזבובים הוזנו בארבעה מדיומים שונים: 1 גרם / 100 מ"ל תמצית P. guajava , 1 גרם / 100 מ"ל Crofelemer, 10 מ"מ Loperamide ומזון רגיל. כל קבוצה כללה 20 זבובים עם חמישה העתקים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD של כל מצב הן בנקבות והן בזכרים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t של סטודנט שהשווה בין שתי קבוצות. ערכי p מוצגים באופן הבא: *: p < 0.05; **: עמ' < 0.01; p < 0.001, ****: p < 0.0001.: אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
משקעי הצואה ותוצאות בדיקת ההזנה הראו כי תמצית P. guajava היא צמח מרפא אמין לטיפול בשלשולים בזבובי פירות.
איור משלים 1: חלון הפתיחה של T.U.R.D. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: חלון T.UR.D. עם הגדרות שיש לכוונן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 3: חלון T.U.R.D. עם תמונה מבוארת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 4: חלון T.U.R.D. המציג כל נקודה שזוהתה מתמונה שכבר עובדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 5: חלון T.U.R.D. המציג כל תמונה מעובדת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 6: חלון T.U.R.D. המציג את תהליך ייצוא הנתונים עבור כל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: הנחיה מהירה לשימוש בתוכנת T.U.R.D. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: דוגמה לגיליונות האלקטרוניים הסופיים המוכנים לניתוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 1: בקשה למיזוג גיליונות אלקטרוניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
D. melanogaster מקובל כמודל לתהליכים ביולוגיים שונים בשל הדמיון בגנים בין D. melanogaster לבני אדם36. השימוש ב- D. melanogaster כמודל לחקר מערכת העיכול נפוץ והיישום של T.U.R.D. שימש להערכת מספר, שטח וכמות משקעי צואה. עם זאת, שיטת הזיהוי הפנוטיפית לא שימשה להערכת השלשולים בזבובי פירות. לכן, פרוטוקול זה מציג שיטה חדשה להעריך בערך את נוכחותם של שלשולים על ידי גילוי פיקדונות צואה.
פיקדונות צואה הם אינדיקטור חיוני לתפקוד מערכת העיכול ובריאות37. בהקשר זה, מוצעת שיטה לגידול D. melanogaster על מדיום המכיל תרופות כדי לחקור פרמטרים שונים של משקעי צואה. על ידי מעקב אחר מספר הפיקדונות, ניתן לקבוע את תדירות הצואה ולהעריך אם לתרופה יש השפעה כלשהי על מעבר המעיים. ניתן למדוד את השטח הכולל של הפיקדונות כדי להעריך את הריכוז והדילול של חומר צואתי, שהוא גורם חשוב בקביעת הבריאות הכללית של מערכת העיכול. בנוסף, ניתן להשתמש בצפיפות האופטית המשולבת הכוללת (IOD) כדי לזהות את הכמות הכוללת של חומר צואה הקיים בפיקדונות. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לסינון והערכה של תרופות, כמו גם תמציות צמחים המשפיעות על מערכת העיכול. כאשר D. melanogaster משמש כאורגניזם מודל, ניתן להעריך את היעילות של תרופות פוטנציאליות, אשר יכול לעזור להאיץ את תהליך גילוי התרופה. על ידי יישום שיטה זו על תמציות צמחים, חוקרים יכולים לעזור לאמת את השימוש בהם כחומרים נוגדי שלשול.
ישנם מספר צעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בפרוטוקול זה כדי לחקור משקעי צואה ב- D. melanogaster. ראשית, חיוני לחשב את המסה הנדרשת כדי להשיג את הריכוז הרצוי של התרופה בתווך. יתר על כן, חשוב להבטיח מצב הכנה טוב בעת הוספת התרופה למדיום, שכן טמפרטורות גבוהות יכולות לפגוע בתרופה ולהשפיע על עוצמתה. שנית, בחירת נקבות הזבובים חשובה בפרוטוקול זה. חשוב להשתמש בזבובים נקבות בתולות כדי למנוע את ההבדלים בתפוקת הצואה בין נקבות בתולות לנקבות מזווגות. לדוגמה, הכתמים המיוצרים על ידי נקבות בתולות הם עגולים יותר מאשר נקבות מזווגות, ונקבות מזווגות נוטות להפריש יותר חומר צואתי מאשר נקבות בתולות27,28. לכן, מומלץ לאסוף זבובים לפני 8 שעות של eclosion כדי להבטיח כי כל הנקבות שנאספו הן בתולות. בנוסף, הזבובים שנבדקו צריכים להיות חזקים ובריאים, שכן בריאותם יכולה להשפיע על צריכת המזון ותפוקת הצואה. לדוגמה, זבובים בעלי צורה לא תקינה של כנפיים עשויים להתקשות להשיג את המזון. לבסוף, כדי להשתמש ב- T.U.R.D. בהצלחה, גודל הבלוק (פיקסלים) והגדרות ההסטה הם קריטיים. בשל ההבדל בניגודיות האור של התמונות, ייתכן שיהיה צורך לנסות הגדרות שונות כדי להשיג את הזיהוי הטוב ביותר האפשרי של פיקדונות צואה.
למרות שהשיטה המוצגת יעילה, ישנן מספר מגבלות. האחד הוא דיוק ריכוז התרופה בתווך. כמו המדיום מחומם במהלך ההכנה, כמה מים עשויים להתאדות, אשר יכול להשפיע על ריכוז התרופה. מגבלה נוספת היא סריקת צלחות הפטרי. חלקים מסוימים של צלחות פטרי (כלומר, קצוות) אינם נסרקים, וזה עלול לגרום לחישוב שגוי של סך משקעי הצואה. בנוסף, הזבובים אינם מייצרים את אותה כמות של משקעי צואה על הכיסויים העליונים והתחתונים של צלחות הפטרי. מכיוון שהם נוטים לייצר יותר פיקדונות על הכריכה התחתונה, סטיית התקן של הניתוח בין הכריכה העליונה והתחתונה עשויה להיות גבוהה, מה שעשוי להשפיע על דיוק התוצאות.
באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לחקור שלשולים ב - D. melanogaster. על ידי שינוי המדיום המכיל תרופה, שיטה זו יכולה לשמש לסינון צמחים נוגדי שלשול, אשר מספק גישה חדשנית לגילוי תרופות. רפואה מסורתית ומוצרים טבעיים שימשו במשך מאות שנים לטיפול במחלות שונות, כולל הפרעות במערכת העיכול. על ידי שימוש בפרוטוקול זה כדי להעריך את היעילות של תמציות צמחים על משקעי צואה, ניתן לזהות טיפולים חדשים פוטנציאליים להפרעות בדרכי העיכול ולספק רציונל מדעי לשימוש בהם כתרופות נוגדות שלשול. גישה זו יכולה לספק תרומה רבת ערך לתחום גילוי תרופות ואתנופרמקולוגיה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר מרטינה גליקובה על שסיפקה לנו את זני הדרוזופילה . אנו אסירי תודה לצוות של מישל קרוזטייה-בורדה ומארק האנלין שנתנו משוב על המחקר שלנו ועזרו לנו לשפר את המודל שלנו. ברצוננו להודות לחברת התרופות Napo על שסיפקה לנו את התרופה Crofelemer. המחברים מודים גם לעורך האורח ד"ר Hugues Petitjean על שנתן לנו את ההזדמנות לפרסם פרוטוקול זה. מחקר זה מומן על ידי Agence Nationale de la Recherche (ANR) במסגרת הפרויקט ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
- Cheng, L. K., et al.
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D.
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H.
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A.
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
