Summary
ここでは、ショウ ジョウバエ に薬剤と植物抽出物を与え、ショウジョウバエの糞便沈着物を分析することにより、消化管への影響を評価する方法について説明する。薬剤で処理されたハエは、さらなる研究のモデルとして使用することができます。
Abstract
ヒトの消化器生理学を研究するために、生物医学者はモデル生物の使用に依存してきました。多くの研究者がマウスをモデルとして腸機能を研究してきましたが、ショウジョウバエ(D. melanogaster)に焦点を当てた報告はごくわずかです。ショウジョウバエはマウスと比較して、ライフサイクルが短く、費用対効果が高く、メンテナンスが簡単で、倫理的な問題がないなど、多くの利点があります。さらに、哺乳類の消化管の生理学、解剖学、およびシグナル伝達経路は、D. melanogasterで高度に保存されています。植物抽出物は、下痢や便秘の治療に伝統的に使用されてきました。例えば、Psidium guajava(P. guajava)は、熱帯地方で最もよく知られている下痢止め剤の1つです。しかし、D. melanogasterにおける下痢止め薬や下剤、植物抽出物の効果を評価した研究はなく、哺乳類と比較してショウジョウバエでも同様の効果(例えば、下痢止め薬の場合は糞便の沈着量が小さく、濃縮度が高く、糞便の堆積量が少ない)が生じ得るかどうかは不明である。この研究では、下痢表現型を示すD.メラノガスター株で、P.グアジャバによって誘発される下痢止め効果が実証されています。ハエが産生する糞便のサンプリングは、色素を添加した食品を使用して監視されます。このプロトコルは薬剤が付いている食糧を準備し、これらの食糧準備で与えられるハエの糞便の沈殿物を評価し、得られたデータを解釈するために使用される方法を概説する。
Introduction
消化管とも呼ばれる消化管は、栄養素の消化吸収と未消化生成物の排泄に関与しています1。消化管は、不快感、痛み、日常生活の混乱を引き起こす可能性のあるさまざまな障害に対して脆弱です。胃腸障害には、腹痛や不快感、腹部膨満感、胸焼け、消化不良または消化不良、吐き気、嘔吐、下痢、便秘などがあります2。下痢は消化管障害3の最も一般的な症状であり、24時間の間に少なくとも3回の軟便と水様便を伴う疾患として定義されています4。下痢は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌など、さまざまな病原体によって引き起こされ、薬物によって引き起こされることもあります5,6。世界的に、下痢は5歳未満の子どもの死亡原因の第2位であり続けています7。下痢は自然に治りますが、数日以上続く場合は、より深刻な基礎疾患を示している可能性もあります。
腸管を研究するために、研究者はマウス、ラット、ブタなどの動物モデルに目を向けます8,9。しかし、これらの動物の使用には、特別な施設と倫理的配慮が必要なため、費用と時間がかかる場合があります。最近の研究では、D. melanogasterをモデルとして使用して消化管を研究し、再生恒常性の維持、免疫老化の進行、上皮バリア機能の喪失、代謝恒常性の低下などのいくつかのメカニズムを調査できることが示されています10,11。ショウジョウバエとして知られるD.メラノガスターは、ヒトと高度な遺伝的相同性を共有しています。ヒト疾患遺伝子の約75%は、ハエ12に機能的な相同体を持っていると考えられている。また、前腸、中腸、後腸からなる単純な消化器系も持っています13。D. melanogasterは実験室での培養が容易であり、さまざまな方法で遺伝子組み換えが可能です14。したがって、in vivo試験にD.melanogasterを使用することは、研究者が制御された環境で複雑な生物学的プロセスを研究できるようにする強力なツールです。
世界保健機関(WHO)によると、発展途上国に住む人々の約80%が、主要な健康ニーズのために伝統医学を使用しています15。薬用植物の使用率が高いのは、薬用植物が入手しやすく、安価で、副作用が少ないという事実によって説明できます16。ハーブ療法で使用される主な植物の部分には、葉、樹皮、根、種子17が含まれますが、主な調製方法は、注入、煎じ薬、および浸軟18です。これらのハーブ療法には、アルカロイド、テルペノイド、フラボノイド、ステロイド、タンニン、炭水化物などの植物化学物質が含まれています19、人体に治療効果があります。人々は、下痢、腹痛、赤痢などの消化管障害を治療するために、さまざまな薬用植物を使用しています20。例えば、Psidium guajavaは、世界で最も一般的に下痢の治療に使用されている植物の1つです。さまざまな薬理学的および臨床的試験ですでにその安全性が示されており、21,22を研究するための優れた下痢止め候補となっています。しかし、漢方薬の主な限界は、効率と安全性の評価の欠如、および使用される植物抽出物の組成に関する明確で完全な情報の欠如です23。漢方薬の有効性と安全性を検証するには、実験的および臨床的検証を含む体系的なアプローチが必要であり、このアプローチはin vivoおよびin vitro研究からの十分なデータによって裏付けられる必要があります。
下痢の治療における伝統的な治療法の有効性を評価するために、マウスとラットの使用はここ数十年で優勢でした24,25。前述の主な利点、すなわち、使いやすさ、手頃な価格、複製可能、保存された吸収機能と消化機能のために ハエと哺乳類の間、我々は植物の下痢止め活性を評価するためのモデルとしてD.メラノガスターを使用することを提案します。D. melanogasterの下痢性表現型は、糞便沈着物の豊富さ、堆積物サイズの増加、着色が薄い(濃度が低い)、糞便物質が多いなど、いくつかの特徴によって特徴付けられる26。この表現型は、糞便沈着物の数、沈着物の総面積、平均光度、および総積分光学濃度(IOD)など、さまざまなパラメーターを使用して定量化できます。総IODは、堆積物の総染料含有量として定義され、排泄された糞便物質の総量を意味します27。以前、D. melanogaster27,28の糞便沈着物を分析するためのアッセイが開発されました。このアッセイでは、糞便の究極のリーダー(T.U.R.D.)を糞便分析ツールとして使用し、糞便堆積物の数、サイズ、軽さをチェックし、ショウジョウバエの腸内生理機能をモニターしました。しかし、この方法はハエの下痢性表現型を評価するために適用されたことはありませんでした。イオン輸送ペプチド(ITP)遺伝子は、喉の渇きと排泄の重要な内分泌調節因子であり、D. melanogasterの水の恒常性と摂食を兼ね備えています。最近の研究では、消化管全体の食物輸送の速度と排便イベントの頻度がITPの過剰発現によって減少し、ITPノックダウンによって増加することが示されました。後者の表現型は、この研究の著者によって下痢として説明されました29。
このプロトコルでは、糞便沈殿物の試金の修正版が下痢モデルとしてITPiの緊張の使用によってD.のmelanogasterの胃腸管に対する下痢止めの代理店(すなわち、グアバの葉のエキス)の効果を査定するのに用いられる。この方法の全体的な目標は、1)薬物および植物抽出物の抗下痢効果を評価するための簡単で信頼性の高い方法を提供すること、および2)生物活性誘導アプローチを適用することにより、植物抽出物中の下痢止め効果に関与する生理活性化合物の発見を可能にすることです。
Protocol
1.植物抽出物の調製
- 成木から Psidium guajava L.の葉30 枚を採取し、40°Cのオーブンで6日間乾燥させ、6日間風乾させ、40°Cのオーブンで4日間乾燥させ、最後に粉砕機またはコーヒーグラインダーで乾燥葉を粉砕してリーフパウダーを調製します。
- 乾燥粉末100gを96%エタノール1Lに24時間浸軟し、シェーカーを用いて連続撹拌する。植物残渣をもう一度同じプロセスにかけ、40°Cの減圧(175 mbar)下で真空ロータリーエバポレーターを使用して、得られたろ液を蒸発乾固させます。
- 植物抽出物をエタノールに溶解して、所望の濃度を得る。一連の濃度を試験することにより、(ここで説明するプロトコルを使用して)最適な濃度を決定します。
- 植物抽出物については、100μg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mLの濃度範囲で試験し、ハエの生存率に影響を与えないものを使用してください。純粋な化合物の場合は、0.05、0.5、5、50 mM12 の濃度範囲でテストします。
2.食品培地の調製
- 100 mLの蒸留水を測定し、4 gの砂糖と0.8 gの寒天をビーカーに注ぎます( 材料表を参照)。100°C(撹拌中)に加熱し、10分間保持します。
- 温度を80°Cに下げ、攪拌しながら小麦粉7.4gと酵母2.8gを加えます。少なくとも20分間加熱し、約80°Cの温度を攪拌して制御します。
- モルデックス-プロピオン酸溶液(モルデックス1mLとプロピオン酸0.3gをよく混ぜる)を加えます。温度が約50°Cに下がるのを待ち、植物抽出液(1mg/mL)とブロモフェノールブルーパウダー0.5gを加えます。
注意: テストする他の濃度の詳細については、セクション1.3.1を参照してください。 - 餌をペトリ皿に注ぎ、ペトリ皿がいっぱいになったら停止します(図1A)。ペトリ皿を室温(約3時間)まで冷ましてから蓋を閉め、4°Cの冷蔵庫で保存します。
注意: ペトリ皿は、水分の蒸発を防ぐために、冷蔵庫に2週間以内保管する必要があります。
図1:糞便沈着試験の実験プロセスのデモンストレーション。 (A)培地を詰めたシャーレの画像。ハエが引っかかって移動できない隙間がないように、ペトリ皿に十分な餌があることを確認してください。ただし、表面を均等に覆うことができるように、ペトリ皿に食べ物を詰めすぎないでください。(B)プロトコルに記載されているヘラの画像。(C)プロトコルに記載されている糞便沈着検査の画像。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
3.ハエの準備
- CO2タンク、針付きCO2ブローガン、フライパッド、絵筆、顕微鏡を準備します。フライステーションは、フライパッドとブローガンの両方にCO2を供給します。フライパッドはハエの選別に使用され、CO2ブローガンはバイアル、ボトル、ペトリ皿のハエの麻酔に使用されます。
- 蛹(少なくとも10個)を含むバイアルを選択してハエの年齢を標準化し、次の方法を使用して成虫のハエをチューブから廃棄します。バイアルを1つずつ逆さまにし、綿プラグとバイアルの側壁の間に針を挿入します。すべてのハエが綿栓で眠るまで、CO2 ブローガンで成虫のハエを麻酔します(麻酔には数秒が必要で、ブローガンを離してから麻酔作用は数秒間持続します)。70%エタノールが入ったガラス瓶の上のバイアルを開き、その中にハエを落とします。綿プラグでバイアルを閉じ、25°C、湿度60%のインキュベーターに保管します。インキュベーターのライトサイクルを12時間のライト/12時間のダークに設定します。
- 孵化後(最大8時間)、顕微鏡下で処女の雌と雄に分類し、仰向けにして生殖器を見てフライパッドします。
- 女性の生殖器は、赤みを帯びた色の男性器に比べて淡いです。男性は、前脚にセックスコームと呼ばれる暗い剛毛があることでも識別できます。ハエを2つの新鮮なチューブ(1つはオス用、もう1つはメス用)に分け、25°Cで6〜8日間インキュベートします。
注:25°Cでは、雌は孵化後約8時間処女のままです。
- 女性の生殖器は、赤みを帯びた色の男性器に比べて淡いです。男性は、前脚にセックスコームと呼ばれる暗い剛毛があることでも識別できます。ハエを2つの新鮮なチューブ(1つはオス用、もう1つはメス用)に分け、25°Cで6〜8日間インキュベートします。
4.糞便沈着試験
- ペトリ皿間の混乱を避けるために、対応する菌株、性別、および薬物をペトリ皿にラベル付けします。ペトリ皿を積み重ねます。
- 染色した食品が入ったペトリ皿を用意し、吸い取り紙の上で逆にして余分な液体を吸収します。へら(図1B)を使用して、食品を12等分に切り、へらを使用して1スライスを空のペトリ皿に入れます。
注:反復数に応じて、カットするスライスの数は、ペトリ皿あたり最大20まで増やすことができます。各スライスは同じサイズにする必要があります。 - すべてのハエが綿プラグで眠るまで、CO2 でハエを麻酔します。健康なハエを各シャーレに6匹移し(図1C)、すぐに蓋を閉め、インキュベーター(25°C、湿度60%、明暗12時間/暗時間12時間)に入れます。
- 実験中にハエがシャーレから逃げないように、シャーレの上部と下部のカバーをテープで貼り付けます。各テストグループについて、(少なくとも)6つの複製ペトリ皿を準備します。
- ハエを24時間飼育した後、CO2 を使用して麻酔をかけ、ハエを70%エタノールで満たされた容器に移し、残りの餌を処分します。
- ペトリ皿を保管し、手順5に進みます。
5. ペトリ皿の定量化
- コンピューター上にフォルダーを設定し、実験株名、ハエの性別、使用した薬の種類を含めて名前を変更します。このフォルダ内に、Original、Cut、Analysisという名前のサブフォルダを作成します。
- 光学解像度 6,400 ppi の高解像度スキャナーを使用して、ペトリ皿をスキャンします。各ペトリ皿の上部カバーと下部カバーをスキャナーフィールドの中央に個別に配置して、個別にスキャンします。
- コンピューターにインストールされているアプリケーションを開きます。コンピュータ画面にウェルカムウィンドウが開き、すべての一般設定が表示されます(図2A)。
メモ: 詳細設定は変更しないでください。この手順は、 材料表で提案されているものと同じスキャナーを使用しているユーザーにのみ有効です。他のソフトウェアを使用する場合は、ガイドラインを参照してください。- アプリケーション内のペトリ皿に、シーケンス番号、上部または下部のカバー、性別、および使用する食品の種類を含めて名前を付けます。手順5.1で設定したサブフォルダのオリジナルを選択します。
- ペトリ皿をプレビューします。ウィンドウの下部にある [プレビュー ]をクリックし、スキャナーが事前スキャンされるまで数秒待つと、コンピューター画面にウィンドウが表示されます。画面に表示されている正方形を動かして、ペトリ皿を囲みます。
- コンピュータ画面のウィンドウの右下にある[ スキャン ]をクリックすると、スキャンは選択したフォルダに画像として自動的に保存されます。
- アプリケーション(オープンソースのフィジーアプリケーションなど)を使用して画像を切り抜き、アーティファクトや食品の残留物が堆積物と見なされないようにします。
注: 次の手順は、フィジー アプリケーションを持っているユーザーにのみ有効です。他のソフトウェアを使用する場合は、ガイドラインを参照してください。- フィジーアプリケーションを開き、ツールバーが画面に表示されるまで数秒待ちます。
- 切り抜く画像をツールバーにドラッグします。ツールバーの3番目のアイコン[多角形の選択]を選択し、画面をクリックして写真の不要な部分(色付きの円グラフ)を切り取り、円グラフの周りの角度をマークします(図2B-1,2)。
注:画像内のトリミング領域を描写する場合、選択したフレームがシームレスに端から端まで接続されていることが不可欠です。 - バーの左上にある「編集」をクリックし、外側の「塗りつぶし/クリア」をクリックします(図2B-3)。
- 写真を保存するには、バーの左上にある[ ファイル ]をクリックし、[ 名前を付けて保存]、[最後に Tiff]の順にクリックします。手順5.1でサブフォルダ Cut setを選択します。
注:トリミングした画像を保存するときは、ファイル名に特殊文字(!、&、$、#、_,-,...など)が含まれていないか、文字が多すぎることを確認してください。
図2:糞便沈着検査のデータを分析するプロセスにおける重要なステップ。 (A)スキャンアプリケーションの設定情報を示すスクリーンショット。(B)フィジーアプリケーションを使用してトリミングされた画像。遺物や食品の残留物が堆積物と見なされないことを確認してください。(C) Excel_merge-v4 アプリケーションを開いたときのスクリーンショット。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
6. 糞尿のオープンソースソフトウェアの究極のリーダーを使用した糞便堆積物の識別
注:糞ソフトウェアの究極のリーダーの紹介と使用法は、 補足ファイル1にあります。
- まず、T.U.R.D.ソフトウェアを開きます(補足図1)。新しい実験を作成し、ドキュメントに名前を付けて、手順 5.1 で設定したサブフォルダー Analysis に保存します。
- [プレート]をクリックし、[プレートの追加]をクリックします。処理するペトリ皿を選択します。新しいウィンドウが開き、選択したプレートの名前と新しいパラメータが表示されます。ブロックサイズ、オフセット、最小サイズ、および最大サイズを設定します(補足図2)。
- 検出された糞便堆積物が正しいものであることを確認するには、 Plates(プレート)をクリックし、 Inspect Selected Plates(選択したプレートを検査)、 Graphics(グラフィックス)、View annotated images(注釈付き画像を表示 )の順にクリックします(補足図3)。ズームインして、カウントを確認します。分析に含めない鉱床が少ない場合は、除外する鉱床の選択を解除します(補足図4)。
- 処理する新しいイメージごとに、手順 6.3 からやり直します。
- T.U.R.D.ソフトウェアでプレートを分析した後、Noをクリックしてハエの数を変更します。ハエ(補足図5)。
- [ プレート]>[グループの編集]>[追加]をクリックしてグループ名を変更し、[ グループ 列]でグループ名を選択します。
- 「 >記述統計量の分析」>「グループの選択 」をクリックして、異なるレプリケート・データを個別にエクスポートします(補足図6)。すべてのスプレッドシートファイル(.csv)を同じフォルダに保管します。
- すべてのファイル(手順6.7で取得)を一意のスプレッドシートに収集するには、アプリケーションExcel_merge-v4(補足コーディングファイル1)を開き、次の文が表示されるまで待ちます(.csvファイルを含む)フォルダーのパスを選択し、上記のフォルダーアドレスを貼り付けます。たとえば、パスを C:\Experiment\Fecal deposit test\ とし、キーボードで Enter キーを 2 回クリックします (図 2C)。その後、同じフォルダに新しいスプレッドシートファイルが作成されます。新しいスプレッドシート ファイルには、エクスポートされたすべてのファイルが別のシートに含まれます。
- 前のスプレッドシート ファイルで、別のシートを追加して、すべての反復の各パラメーターの平均を収集します (データの処理には VLOOKUP 関数を使用します)。一例を 付表1に示す。
- p値を分析します。
Representative Results
ここで紹介する研究は、 D. melanogaster の下痢の測定が糞便沈着アッセイの使用によって達成できることを示しています。表現型(下痢の有無)間の有意差は、糞便沈着物の数、堆積物の総面積、堆積物の平均面積、平均明度、および堆積物に存在する染料の総量の尺度であり、排泄された糞便物質の総含有量を表す総積分光学濃度(IOD)を含むさまざまなパラメータを分析することによって決定できます27。
ハエの ITP 遺伝子ノックダウンは、排便頻度の増加を特徴とする下痢表現型を誘発する可能性があり、下痢の研究に適したモデルとなっています29。この実験では、 ITPi 株(w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO))を採用し、標準的な培地で飼育しました。下痢を管理するために熱帯地域でこの植物が広く使用されていることを考えると、下痢止めの介入として Psidium guajava 葉抽出物が選択されました。下痢止め剤であるクロフェレマーは、抗レトロウイルス療法を受けているHIV/AIDSの成人患者に非感染性下痢の症状緩和を提供するために、米国食品医薬品局(FDA)によって承認されました31。Crofelemerは、 Croton lechleri Müll.Argのラテックスからの抽出物です。茎の樹皮32.ロペラミドは、下痢の治療に世界中で使用されている合成薬です33。クロフェレマーとロペラミドの両方を潜在的なポジティブコントロールとして使用しました。
仮説は、ハエに P.グアジャバ 抽出物、クロフェレマー、およびロペラミドを与えると、通常の餌を与えられたハエと比較して下痢の表現型が減少するというものでした。この仮説を検証するために、 D. melanogaster の糞便沈着物の測定は、通常の餌を与えたハエと P. guajava 抽出物(1 g / 100 mL)、クロフェレマー(1 g / 100 mL)、およびロペラミド(10 mM)を与えられたハエの間のいくつかのパラメータを比較して行われました。実験の設定には、生後6〜7日の処女の雌または雄を使用しました。各ペトリ皿には6匹のハエが入っており、6回の複製が行われました。ハエを24時間飼育し、その後、各グループを分析しました。学生の t検定を使用して、テストグループ間の有意差を比較しました。その結果、糞便沈着物数(図3A)、沈着物の総面積(図3B)、および総IOD(図3C)は、バージン雌雄ともに、 P. guajava 抽出物(1 g / 100 mL)群と比較して、通常の食品群で有意に高い値を示したことが示されました。残念なことに、ロペラミドは男女ともに何の効果も示さなかった(しかし、 D. melanogasterでは鎮痙剤として作用することがすでに実証されている)34 が、クロフェレマーは女性にのみ効果があった。
図3:ITPiひずみ解析。ITPi株は、通常の食品、1 g/100 mLのP. guajava抽出物、1 g/100 mLのクロフェレマー、および10 mMのロペラミドを添加した食品の4つの条件で分析されました。データは、雌雄両方の各条件の平均±SDとして表されます(ペトリ皿の両面を6回繰り返した場合)。統計解析は、2つのグループを比較する学生のt検定を使用して実行されました。p値は次のように表示されます:*:p<0.05;**:p < 0.01;: p < 0.001, ****: p < 0.0001.(A)1 g/100 mLのクロフェレマー、10 mMのロペラミド、1 g/100 mLのP.グアジャバ抽出物を添加した餌を与えたハエと、通常の餌を与えたハエのITPi株の糞便沈着数を比較しました。さらに、処女の雌と雄の糞便沈着数の違いも分析されました。両群とも、通常の餌を与えられたハエでは、1 g/100 mLのP. guajava抽出物を与えられたハエよりも、糞便の沈着数が有意に多かった。(B)ITPi株の糞便沈着物の総面積を、通常の餌を与えたハエと、1 g/100 mLのP.グアジャバ抽出物、1 g/100 mLのクロフェレマー、および10 mMのロペラミドを添加した餌を与えたハエで比較しました。雌雄では、通常の餌を与えられたハエでは、1 g/100 mLのP. guajava抽出物を与えられたハエよりも、糞便沈着物の総面積が有意に高かった。(C)ITPi株の総IODの差を、通常の餌を与えたハエと、1 g/100 mLのP. guajava抽出物、1 g/100 mLのクロフェレマー、および10 mMのロペラミドを添加した餌を与えたハエとの間で分析しました。雌雄では、通常の餌を与えられたハエでは、1 g/100 mLのP. guajava抽出物を与えられたハエよりも総IODが有意に高かった。略語:F =女性;M =男性;Crofe = Crofelemer;ロペ=ロペラミド;食べ物=普通の食べ物。P. gua ext = Psidium guajava 抽出物。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
P. guajava抽出物群で観察された排泄の減少は、抽出物の抑制効果によるものであり、食物消費量の減少によるものではないことを実証するために、固形食品消費量の直接摂取推定と追跡(DIETS)方法35を実施しました。その結果、ハエの餌の消費量が通常よりも少ないオスのロペラミドを除いて、薬を投与されたグループとそうでないグループの間で食物消費量に有意差は見られませんでした(図4)。
図4:給餌アッセイ。 給餌アッセイでは、ハエの固形食物消費量を測定しました。ハエに4種類の培地(1 g/100 mL P. guajava 抽出物、1 g/100 mLクロフェレマー、10 mMロペラミド、および通常の餌)を与えました。各グループは、5回の反復を持つ20匹のハエで構成されていました。データは、女性と男性の両方における各状態の平均±SDとして表示されます。統計解析は、2つのグループを比較する学生の t検定を使用して実行されました。 p値は次のように表示されます:*: p <0.05;**: p < 0.01;: p < 0.001, ****: p < 0.0001. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
糞便沈着物と摂食アッセイの結果から、 P. guajava 抽出物はショウジョウバエの下痢を治療するための信頼できる薬用植物であることが示されました。
補足図1:T.U.R.D.のウィンドウを開く。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:T.UR.D.ウィンドウ(設定調整あり)このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:注釈付き画像を含むT.U.R.D.ウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:すでに処理された画像から検出された各スポットを表示するT.U.R.D.ウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:処理された各画像を表示するT.U.R.D.ウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:各グループのデータをエクスポートするプロセスを示すT.U.R.D.ウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:T.U.R.D.ソフトウェアを使用するためのクイックガイドライン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:分析の準備が整った最終的なスプレッドシートの例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:スプレッドシートをマージするためのアプリケーション。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
D. melanogaster は、 D. melanogaster とヒトの遺伝子の類似性により、さまざまな生物学的プロセスのモデルとして広く受け入れられている36。腸管を研究するためのモデルとしての D.メラノガスター の使用が一般的であり、T.U.R.D.の適用は、糞便沈着物の数、面積、および量を推定するために使用されています。しかし、表現型検出法は、ショウジョウバエの下痢の評価には使用されていません。そこで、このプロトコルでは、糞便の沈着物を検出することで、下痢の存在を大まかに評価する新しい方法を導入しています。
糞便沈着物は、腸管の機能と健康の重要な指標です37。これに関連して、糞便沈着物のさまざまなパラメータを調査するために、薬物含有培地で D.melanogaster を飼育する方法が提案されています。沈着物の数を監視することにより、排便の頻度を決定し、薬物が腸内輸送に影響を与えるかどうかを評価することができます。堆積物の総面積を測定して、腸管の全体的な健康状態を決定する重要な要素である糞便の濃度と希釈を評価することができます。さらに、総積分光学密度(IOD)を使用して、堆積物に存在する糞便物質の総量を検出できます。このプロトコルは腸管に影響を与える薬剤、また植物のエキスを選別し、評価する有効な方法を提供する。 D. melanogaster をモデル生物として用いることで、候補となる薬剤の有効性を評価することができ、創薬プロセスの加速に貢献します。この方法を植物抽出物に適用することで、研究者は下痢止め剤としての使用を検証するのに役立ちます。
このプロトコルを使用してD.melanogasterの糞便沈着物を研究する際に考慮すべきいくつかの重要なステップがあります。まず、培地中の薬物の所望の濃度を達成するために必要な質量を計算することが不可欠です。さらに、高温は薬物を劣化させ、その効力に影響を与える可能性があるため、培地に薬物を添加するときは良好な調製条件を確保することが重要です。第二に、このプロトコルでは雌のハエの選択が重要です。処女の雌と交尾した雌の糞便量の違いを避けるために、処女の雌のハエを使用することが重要です。例えば、処女の雌が産む斑点は、交尾した雌よりも円形であり、交尾した雌は処女の雌よりも多くの糞便を排泄する傾向がある27,28。したがって、収集されたすべての女性が処女であることを確認するために、閉鎖の8時間前にハエを収集することをお勧めします。さらに、テストされたハエは、その健康が食物摂取量と糞便量に影響を与える可能性があるため、強くて健康でなければなりません。たとえば、翼の形が異常なハエは、餌を得るのが難しい場合があります。最後に、T.U.R.D.をうまく使用するには、ブロックサイズ(ピクセル)とオフセットの設定が重要です。画像の光のコントラストの違いにより、糞便沈着物を可能な限り適切に識別するために、さまざまな設定を試す必要がある場合があります。
提示された方法は効果的ですが、いくつかの制限があります。1つは、培地中の薬物濃度の精度です。調製中に培地を加熱すると、一部の水分が蒸発することがあり、薬物の濃度に影響を与える可能性があります。もう一つの制限は、ペトリ皿のスキャンです。ペトリ皿の一部(端など)がスキャンされないため、糞便堆積物の総量が誤って計算される可能性があります。さらに、ハエはペトリ皿の上部カバーと下部カバーに同じ量の糞便堆積物を生成しません。底面カバーに堆積物が多くなる傾向があるため、上部カバーと下部カバーの間の解析の標準偏差が高くなり、結果の精度に影響を与える可能性があります。
このプロトコルを使用して、研究者は D.メラノガスターの下痢を研究することができます。薬物含有培地を改変することにより、この方法は下痢止め植物のスクリーニングに使用でき、創薬への新しいアプローチを提供します。伝統医学と天然物は、胃腸障害を含むさまざまな病気の治療に何世紀にもわたって使用されてきました。このプロトコルを使用して、糞便沈着物に対する植物抽出物の有効性を評価することにより、腸管障害の潜在的な新しい治療法を特定し、下痢止め剤として使用するための科学的根拠を提供できます。このアプローチは、創薬や民族薬理学の分野に貴重な貢献をすることができます。
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
ショウ ジョウバエ 株を提供してくださったMartina Gáliková博士に感謝します。Michelle Crozatier-Borde氏とMarc Haenlin氏のチームには、私たちの研究に関するフィードバックを提供し、モデルの改善に協力していただいたことに感謝しています。クロフェレマーという薬を提供してくださったナポ・ファーマシューティカルズ社に感謝します。著者らは、このプロトコルを出版する機会を与えてくれたゲストエディターのユーグ・プティジャン博士にも感謝しています。この研究は、プロジェクトANR-22-CE03-0001-01の下で国立政府(ANR)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
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