Summary
여기에서는 초파리 멜라노가스터 에 약물 및 식물 추출물을 먹이고 초파리의 분변 침전물을 분석하여 위장관에 미치는 영향을 평가하는 방법을 설명합니다. 약물 처리된 파리는 추가 연구를 위한 모델로 사용될 수 있습니다.
Abstract
인간의 위장 생리학을 연구하기 위해 생물 의학 과학자들은 모델 유기체의 사용에 의존해 왔습니다. 많은 연구자들이 장 기능을 연구하기 위해 생쥐를 모델로 사용했지만, 초파리 멜라노가스터(D. melanogaster)에 초점을 맞춘 보고서는 소수에 불과합니다. 쥐에 비해 초파리는 수명주기가 짧고 유지 보수가 비용 효율적이고 간단하며 윤리적 문제가 없다는 등 많은 장점이 있습니다. 또한 포유류의 위장 생리학, 해부학 및 신호 전달 경로는 D. melanogaster에서 매우 잘 보존되어 있습니다. 식물 추출물은 전통적으로 설사와 변비를 치료하는 데 사용되어 왔습니다. 예를 들어, 프시디움 구아자바 (P. guajava)는 열대 지방에서 가장 잘 알려진 지사제 중 하나입니다. 그러나 D. melanogaster에서 지사제와 완하제 및 식물 추출물의 효과를 평가한 연구는 없었으며, 포유류에 비해 초파리에서 유사한 효과(예: 지사제의 경우 더 작고, 더 농축되고, 덜 풍부한 대변 침전물)가 발생할 수 있는지는 아직 알려지지 않았습니다. 이 연구에서는 P. guajava 에 의해 유도된 지사제 효과가 설사 표현형을 나타내는 D. melanogaster 균주에서 입증되었습니다. 파리에 의해 생성된 분변 샘플링은 염료가 보충된 식품을 사용하여 모니터링됩니다. 이 프로토콜은 약물로 음식을 준비하고, 이러한 음식 준비에 먹인 파리의 배설물 침전물을 평가하고, 얻은 데이터를 해석하는 데 사용되는 방법을 간략하게 설명합니다.
Introduction
소화관이라고도 하는 위장관(GI)은 영양소의 소화 및 흡수와 소화되지 않은 제품의 배설을 담당합니다1. 위장관은 불편함, 통증 및 일상 생활에 지장을 줄 수 있는 다양한 장애에 취약합니다. 위장 장애에는 복통과 불편감, 복부 팽만감, 속 쓰림, 소화 불량 또는 소화 불량, 메스꺼움, 구토, 설사, 변비등이 있습니다 2. 설사는 위장장애(GI disorder)3의 가장 흔한 증상이며, 24시간 동안 적어도 3회 이상 묽은 변을 보는 질환으로 정의된다4. 설사는 박테리아, 바이러스, 기생충, 곰팡이 등 다양한 병원균에 의해 발생하며, 약물에 의해서도 발생할 수 있다 5,6. 전 세계적으로 설사는 5세 미만 아동 사망의 두 번째 주요 원인이다7. 설사는 저절로 해결될 수 있지만, 설사가 며칠 이상 지속되면 더 심각한 기저 질환을 나타낼 수도 있습니다.
장관을 연구하기 위해 연구자들은 생쥐, 쥐, 돼지와 같은 동물 모델을 사용합니다 8,9. 그러나 이러한 동물을 사용하는 것은 전문 시설과 윤리적 고려 사항이 필요하기 때문에 비용과 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 D. melanogaster는 위장관을 연구하고 재생 항상성 유지, 면역 노화의 발달, 상피 장벽 기능의 상실 및 대사 항상성 감소와 같은 일부 메커니즘을 조사하는 모델로 사용될 수 있습니다10,11. 초파리로 알려진 D. melanogaster는 인간과 높은 수준의 유전적 상동성을 공유합니다. 인간 질병 유전자의 약 75%는 Fly12에서 기능적 상동체를 가지고 있는 것으로 여겨집니다. 그들은 또한 앞창자, 중창자, 뒷창자로 구성된 간단한 소화 시스템을 가지고 있다13. D. melanogaster는 실험실에서 배양하기 쉽고 다양한 방법으로 유전자 변형이 가능합니다14. 그러므로, 생체 내 테스트를 위해 D. melanogaster를 사용하는 것은 연구원이 통제된 환경에서 복잡한 생물학적 과정을 연구할 수 있도록 하는 강력한 도구입니다.
세계보건기구(WHO)에 따르면, 개발도상국에 거주하는 사람들의 약 80%가15년 동안 전통 의학을 이용하고 있습니다. 약용 식물의 높은 사용은 쉽게 구할 수 있고, 저렴하며, 부작용이 거의 없다는 사실로 설명할 수 있다16. 허브 요법에 사용되는 주요 식물 부위는 잎, 껍질, 뿌리, 씨앗17 이며, 주요 준비 방법은 주입, 달인 및 침용18입니다. 이러한 약초 요법에는 알칼로이드, 테르페노이드, 플라보노이드, 스테로이드, 탄닌 및 탄수화물19과 같은 식물 화학 물질이 포함되어 있어 인체에 치료 효과가 있습니다. 사람들은 설사, 복통, 이질과 같은 위장 장애를 치료하기 위해 다양한 약용 식물을 사용합니다20. 예를 들어, 프시디움 구아바는 세계에서 설사를 치료하는 데 가장 일반적으로 사용되는 식물 중 하나이다. 다양한 약리학 및 임상 테스트에서 이미 안전성이 입증되어21,22를 연구하기에 좋은 지사제 후보가 되었습니다. 그러나 한약의 가장 큰 한계는 효율성과 안전성 평가가 부족하고 사용되는 식물 추출물의 성분에 대한 명확하고 완전한 정보가 부족하다는 점이다23. 생약의 효율성과 안전성을 검증하기 위해서는 실험 및 임상 검증을 포함하는 체계적인 접근이 필요하며, 이러한 접근법은 in vivo 및 in vitro 연구에서 얻은 충분한 데이터로 뒷받침되어야 합니다.
설사 치료에 대한 효능에 대한 전통적인 치료법을 평가하기 위해 최근 수십 년 동안 쥐와 쥐의 사용이 우세했습니다24,25. 파리와 포유류 사이의 사용 용이성, 저렴함, 복제 가능, 보존된 흡수 및 소화 기능, 앞서 언급한 주요 이점으로 인해 D. melanogaster를 식물의 지사제 활성을 평가하는 모델로 사용할 것을 제안합니다. D. melanogaster의 설사 표현형은 분변 침전물의 증가, 더 큰 침전물 크기, 더 밝은 착색(덜 농축됨) 및 더 높은 분변 물질을 포함한 몇 가지 특징으로 특징지어질 수 있다26. 이 표현형은 분변 침전물 수, 총 침전물 면적, 평균 밝기 및 총 통합 광학 밀도(IOD)와 같은 다양한 매개변수를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 총 IOD는 침전물의 총 염료 함량으로 정의되며, 이는 배설된 총 배설물27을 의미합니다. 이전에, 분석법은 D. melanogaster27,28의 대변 침전물을 분석하기 위하여 개발되었다. 이 분석에서는 배설물의 최종 판독기(T.U.R.D.)를 배설물 분석 도구로 사용하여 배설물 침전물의 수, 크기 및 밝기를 확인하여 초파리의 장 생리를 모니터링할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 파리의 설사 표현형을 평가하는 데 적용되지 않았습니다. 이온 수송 펩타이드(ITP) 유전자는 갈증과 배설의 중요한 내분비 조절자이며 D. melanogaster의 섭식과 수분 항상성을 결합합니다. 최근 연구에서 위장관을 통한 음식물 이동 속도와 배변 사건의 빈도는 ITP 과발현에 의해 감소하고 ITP 녹다운에 의해 증가하는 것으로 나타났습니다. 후자의 표현형은 이 연구의 저자들에 의해 설사로 기술되었다29.
이 프로토콜에서는 ITPi 균주를 설사 모델로 사용하여 D. melanogaster의 위장관에 대한 지사제(즉, 구아바 잎 추출물)의 효과를 평가하기 위해 분변 침전물 분석의 수정된 버전을 사용합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 1) 약물 및 식물 추출물의 지사제 효과를 평가하기 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하고 2) 생리활성 유도 접근법을 적용하여 식물 추출물에서 지사제 효과를 담당하는 생리 활성 화합물을 발견할 수 있도록 하는 것입니다.
Protocol
1. 식물 추출물 준비
- 성인 나무에서 Psidium guajava L. 잎30 을 채취하여 40 °C의 오븐에서 6 일 동안 건조시킨 다음 6 일 동안 자연 건조시킨 다음 40 °C의 오븐에서 4 일 동안 다시 건조시킨 다음 마지막으로 마른 잎을 분쇄기 또는 커피 그라인더에서 분쇄하여 잎 분말을 준비합니다.
- 96% 에탄올 1L에 건조된 분말 100g을 24시간 동안 담그고 셰이커를 사용하여 계속 저어줍니다. 식물 잔류물을 동일한 공정에 한 번 더 적용하고 40°C에서 감압(175mbar)에서 진공 회전 증발기를 사용하여 생성된 여과액을 건조로 증발시킵니다.
- 식물 추출물을 에탄올에 녹여 원하는 농도를 얻습니다. 일련의 농도를 테스트하여 최적의 농도를 결정합니다(여기에 설명된 프로토콜 사용).
- 식물 추출물의 경우 100μg/mL, 1mg/mL, 10mg/mL, 100mg/mL의 농도 범위를 테스트하고 파리의 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 사용합니다. 순수 화합물의 경우 0.05, 0.5, 5 및 50mM12의 농도 범위를 테스트합니다.
2. 식품 매체 준비
- 증류수 100mL를 측정하고 설탕 4g과 한천 0.8g을 비커에 붓습니다( 재료 표 참조). 100°C로 가열하고(교반하는 동안) 10분 동안 유지합니다.
- 온도를 80°C로 낮추고 저어주면서 밀가루 7.4g과 효모 2.8g을 넣습니다. 약 20°C가 되어야 하는 온도를 계속 저어주고 제어하면서 최소 80분 동안 가열합니다.
- 몰덱스-프로피온산 용액(몰덱스 1mL와 프로피온산 0.3g을 잘 섞는다)을 넣는다. 온도가 약 50°C로 떨어질 때까지 기다렸다가 식물 추출물 용액(1mg/mL)과 브로모페놀 블루 파우더 0.5g을 추가합니다.
알림: 테스트할 다른 농도에 대한 자세한 내용은 섹션 1.3.1을 참조하십시오. - 페트리 접시에 음식을 붓고 페트리 접시가 가득 차면 멈춥니다(그림 1A). 페트리 접시를 실온(약 3시간)으로 식힌 다음 뚜껑을 닫고 4°C의 냉장고에 보관합니다.
알림: 페트리 접시는 수분 증발을 방지하기 위해 냉장고에 2주 이상 보관해야 합니다.
그림 1: 분변 침전물 테스트를 위한 실험 과정의 시연. (A) 음식 배지로 가득 찬 페트리 접시를 보여주는 이미지. 틈이 파리를 가두어 움직이지 않도록 페트리 접시에 충분한 음식이 있는지 확인하십시오. 그러나 표면이 고르게 덮일 수 있도록 페트리 접시에 음식을 너무 많이 넣지 마십시오. (B) 프로토콜에 설명된 주걱의 이미지. (C) 프로토콜에 설명된 대변 침전물 테스트 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 파리 준비
- CO2 탱크, 바늘이 있는 CO2 블로우 건, 플라이 패드, 붓 및 현미경을 준비합니다. 플라이 스테이션은 플라이 패드와 블로우 건 모두에 CO2 를 공급합니다. 플라이 패드는 파리를 분류하는 데 사용되는 반면 CO2 블로우 건은 바이알, 병 및 페트리 접시에 있는 파리를 마취하는 데 사용됩니다.
- 번데기(최소 10마리)가 들어 있는 유리병을 선택하여 파리의 나이를 표준화하고 다음 방법을 사용하여 튜브에서 성충 파리를 버립니다. 바이알을 하나씩 거꾸로 뒤집어 면 플러그와 바이알 측벽 사이에 바늘을 삽입합니다. 모든 파리가 면 플러그에서 잠들 때까지 CO2 블로우 건으로 성체 파리를 마취합니다(마취하려면 몇 초가 필요하며 블로우 건을 놓은 후 마취 작용이 몇 초 동안 지속됨). 70% 에탄올이 들어 있는 유리병 위의 유리병을 열고 파리를 떨어뜨립니다. 면 플러그로 바이알을 닫고 습도 60%의 25°C에서 인큐베이터에 보관합니다. 인큐베이터의 조명 주기를 12시간 밝음/12시간 어둡게 설정합니다.
- 배양 후(최대 8시간) 현미경으로 처녀 암컷과 수컷으로 분류하고 등을 돌리고 생식기를 보면서 플라이패드를 만듭니다.
- 여성 생식기는 붉은 색을 띤 남성 생식기에 비해 창백합니다. 수컷은 또한 앞다리 한 쌍에 섹스 빗이라고 불리는 어두운 강모가 있는 것으로 식별할 수 있습니다. 파리를 두 개의 신선한 튜브(하나는 수컷용, 다른 하나는 암컷용)에 나누고 25°C에서 6-8일 동안 배양합니다.
참고: 25°C에서 암컷은 부화 후 약 8시간 동안 처녀 상태를 유지합니다.
- 여성 생식기는 붉은 색을 띤 남성 생식기에 비해 창백합니다. 수컷은 또한 앞다리 한 쌍에 섹스 빗이라고 불리는 어두운 강모가 있는 것으로 식별할 수 있습니다. 파리를 두 개의 신선한 튜브(하나는 수컷용, 다른 하나는 암컷용)에 나누고 25°C에서 6-8일 동안 배양합니다.
4. 대변 침전물 검사
- 페트리 접시 간의 혼동을 피하기 위해 해당 균주, 성별 및 약물로 페트리 접시에 레이블을 지정합니다. 페트리 접시를 서로 겹쳐 쌓습니다.
- 염색된 음식이 들어 있는 페트리 접시를 가져와 압지에 뒤집어 여분의 액체를 흡수합니다. 주걱(그림 1B)을 사용하여 음식을 12등분으로 자른 다음 주걱을 사용하여 빈 페트리 접시에 한 조각을 넣습니다.
알림: 반복 횟수에 따라 절단할 조각 수를 페트리 접시당 최대 20개까지 늘릴 수 있습니다. 각 조각의 크기는 같아야 합니다. - 모든 파리가 면 플러그에서 잠들 때까지 CO2 로 파리를 마취하십시오. 각 페트리 접시에 6마리의 건강한 파리를 옮기고(그림 1C) 즉시 뚜껑을 닫은 다음 인큐베이터(25°C, 습도 60%, 밝음 12시간/어두움 12시간)에 넣습니다.
- 실험 중에 파리가 페트리 접시에서 탈출하지 않도록 하려면 페트리 접시의 상단 및 하단 덮개를 테이프로 부착하십시오. 각 테스트 그룹에 대해 6개의 복제 페트리 접시(최소한)를 준비합니다.
- 파리를 24시간 동안 뒤로 눕힌 후 CO2 를 사용하여 마취하고 파리를 70% 에탄올로 채워진 용기에 옮기고 남은 음식을 폐기합니다.
- 페트리 접시를 보관하고 5단계로 진행합니다.
5. 페트리 접시의 정량화
- 컴퓨터에 폴더를 설정하고 실험 균주 이름, 파리의 성별 및 사용된 약물 유형을 포함하여 이름을 바꿉니다. 이 폴더 안에 Original, Cut 및 Analysis라는 하위 폴더를 만듭니다.
- 광학 해상도가 6,400ppi(인치당 픽셀)인 고해상도 스캐너를 사용하여 Petri 접시를 스캔합니다. 각 Petri 접시의 상단 및 하단 덮개를 스캐너 필드 중앙에 개별적으로 배치하여 개별적으로 스캔합니다.
- 컴퓨터에 설치된 응용 프로그램을 엽니다. 컴퓨터 화면에 모든 일반 설정이 포함된 시작 창이 열립니다(그림 2A).
참고: 고급 설정을 수정하지 마십시오. 이 단계는 재료 목차에 제안된 것과 동일한 스캐너를 사용하는 사용자에게만 유효합니다. 다른 소프트웨어를 사용하는 경우 지침을 참조하십시오.- 응용 프로그램에서 일련 번호, 상단 또는 하단 덮개, 성별 및 사용된 음식 유형을 포함하여 페트리 접시의 이름을 지정합니다. 5.1단계에서 설정한 원본 하위 폴더를 선택합니다.
- 페트리 접시를 미리 봅니다. 창 하단의 미리보기 를 클릭하고 스캐너가 사전 스캔될 때까지 몇 초간 기다리면 컴퓨터 화면에 창이 나타납니다. 화면에 표시된 사각형을 움직여 페트리 접시를 둘러쌉니다.
- 컴퓨터 화면의 창 오른쪽 하단에 있는 스캔 을 클릭하면 스캔이 선택한 폴더에 이미지로 자동 저장됩니다.
- 응용 프로그램(예: 오픈 소스 Fiji 응용 프로그램)을 사용하여 이미지를 잘라 인공물과 음식물 찌꺼기가 침전물로 간주되지 않도록 합니다.
참고: 다음 단계는 피지 응용 프로그램이 있는 사용자에게만 유효합니다. 다른 소프트웨어를 사용하는 경우 지침을 참조하십시오.- 피지 응용 프로그램을 열고 툴바가 화면에 나타날 때까지 몇 초간 기다리십시오.
- 잘라낼 이미지를 도구 모음으로 드래그합니다. 도구 모음에서 3번째 아이콘 다각형 선택을 선택하고 화면을 클릭하여 원형 차트 주위의 각도를 표시하여 사진의 원하지 않는 부분(컬러 원형 차트)을 자릅니다(그림 2B-1,2).
참고: 이미지 내에서 자르기 영역을 묘사할 때 선택한 프레임이 종단 간 매끄럽게 연결되어 있어야 합니다. - 막대의 왼쪽 상단에서 Edit를 클릭한 다음 Fill/Clear outside를 클릭합니다(그림 2B-3).
- 사진을 저장하려면 막대의 왼쪽 상단에 있는 파일을 클릭한 다음 다른 이름으로 저장을 클릭하고 마지막으로 Tiff를 클릭합니다. 5.1단계에서 Cut set 하위 폴더를 선택합니다.
참고: 자른 이미지를 저장할 때 파일 이름에 특수 문자(예: !, &, $, #, _,-,...) 또는 너무 많은 문자가 없는지 확인하십시오.
그림 2: 분변 침전물 검사의 데이터를 분석하는 과정의 주요 단계. (A) 스캔 응용 프로그램의 설정 정보를 보여주는 스크린샷. (B) 피지 응용 프로그램을 사용하여 자른 이미지. 인공물과 음식물 찌꺼기가 침전물로 간주되지 않도록 하십시오. (C) Excel_merge-v4 응용 프로그램을 열 때의 모습을 보여주는 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 배설물 오픈 소스 소프트웨어의 궁극적 인 리더를 사용하여 대변 침전물 식별
알림: 배설물 소프트웨어의 궁극적인 리더에 대한 소개 및 사용법은 보충 파일 1에서 찾을 수 있습니다.
- 먼저 T.U.R.D. 소프트웨어를 엽니다(보충 그림 1). 새 실험을 만들고 문서에 이름을 지정한 다음 5.1단계에서 설정한 Analysis 하위 폴더에 저장합니다.
- 플레이트(Plates)를 클릭한 다음 플레이트 추가(Add plate)를 클릭합니다. 처리할 페트리 접시를 선택합니다. 선택한 플레이트의 이름과 새 매개변수가 있는 새 창이 나타납니다. 블록 크기, 오프셋, 최소 크기 및 최대 크기를 설정합니다(보충 그림 2).
- 검출된 분변 침전물이 올바른 것인지 확인하려면 Plates(플레이트)를 클릭한 다음 Inspect Selected Plates(선택한 플레이트 검사), Graphics(그래픽), View annotated images(주석이 달린 이미지 보기 )를 클릭합니다(보충 그림 3). 확대하여 개수를 확인합니다. 분석에 포함되어서는 안 되는 예금이 몇 개만 있는 경우 제외할 예금을 선택 취소합니다(보충 그림 4).
- 처리할 각 새 이미지에 대해 6.3단계부터 다시 시작합니다.
- T.U.R.D. 소프트웨어로 플레이트를 분석한 후 No(아니오)를 클릭하여 파리 수를 수정합니다 . 파리 (보충 그림 5).
- 플레이트(Plates) > 그룹 편집(Edit groups) > 추가(Add)를 클릭하여 그룹 이름을 수정한 다음 그룹(Group) 열에서 그룹 이름을 선택합니다.
- Analyze > Descriptive Statistics > Select Group(그룹 선택)을 클릭하여 서로 다른 반복실험 데이터를 개별적으로 내보냅니다(보충 그림 6). 모든 스프레드시트 파일(.csv)을 같은 폴더에 보관합니다.
- 고유한 스프레드시트에 모든 파일(6.7단계에서 얻음)을 수집하려면 응용 프로그램 Excel_merge-v4(보조 코딩 파일 1)를 열고 다음 문장이 나타날 때까지 기다립니다. 폴더 경로 선택(.csv 파일 포함): 그런 다음 위의 폴더 주소를 붙여넣습니다. 예를 들어 경로는 C:\Experiment\Fecal deposit test\일 수 있으며 키보드에서 Enter 를 두 번 클릭합니다(그림 2C). 그런 다음 동일한 폴더에 새 스프레드시트 파일이 생성됩니다. 새 스프레드시트 파일에는 내보낸 모든 파일이 서로 다른 시트에 포함됩니다.
- 이전 스프레드시트 파일에서 다른 시트를 추가하여 모든 반복실험의 각 모수의 평균을 수집합니다(데이터 처리를 위해 VLOOKUP 함수 사용). 그 예는 보충 표 1에 나와 있습니다.
- p-값을 분석합니다.
Representative Results
여기에 제시된 연구는 D. melanogaster 의 설사 측정이 분변 침전물 분석을 사용하여 달성될 수 있음을 보여줍니다. 표현형(설사 여부) 간의 유의미한 차이는 분변 침전물의 수, 침전물의 총 면적, 침전물의 평균 면적, 평균 가벼움 및 침전물에 존재하는 염료의 총량을 측정하고 배설된 총 분변 물질 함량을 나타내는 총 통합 광학 밀도(IOD)를 포함한 다양한 매개변수를 분석하여 결정할 수 있습니다27.
파리의 ITP 유전자 녹다운은 배변 빈도 증가를 특징으로 하는 설사 표현형을 유도할 수 있어 설사 연구에 적합한 모델이다29. 이 실험의 맥락에서, ITPi 균주(w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi/(CyO))를 표준 배지에서 사용하고 사육하였다. Psidium guajava 잎 추출물은 설사를 관리하기 위해 열대 지역에서 이 식물이 널리 사용되는 것을 감안할 때 지사제 중재로 선택되었습니다. 지사제인 크로펠레머는 미국 식품의약국(FDA)으로부터 항레트로바이러스 요법을 받고 있는 HIV/AIDS 성인 환자의 비감염성 설사에 대한 증상 완화를 제공하도록 승인받았다31. Crofelemer는 Croton lechleri Müll.Arg의 라텍스에서 추출한 추출물입니다. 줄기 껍질32. 로페라마이드(Loperamide)는 전 세계적으로 설사를 치료하는 데 사용되는 합성 약물이다33. 크로펠레머(Crofelemer)와 로페라마이드(Loperamide)는 모두 잠재적인 양성 대조군으로 사용되었다.
가설은 파리에게 P. guajava 추출물, Crofelemer 및 Loperamide를 먹이면 일반 음식을 먹인 파리에 비해 설사 표현형을 줄일 수 있다는 것이었습니다. 이 가설을 조사하기 위해 D. melanogaster 에서 일반 사료를 먹인 파리와 P. guajava 추출물(1g/100mL), Crofelemer(1g/100mL) 및 Loperamide(10mM)를 먹인 파리 사이의 여러 매개변수를 비교하여 분변 침전물을 측정했습니다. 실험 설정을 위해 6-7일 된 처녀 암컷 또는 수컷을 사용했습니다. 각 페트리 접시에는 6 마리의 파리가 들어 있었고 6 개의 복제가 수행되었습니다. 파리를 24시간 동안 사육한 다음 각 그룹을 분석했습니다. 학생의 t-검정을 사용하여 테스트 그룹 간의 유의한 차이를 비교했습니다. 그 결과, 분변 침전물 수(그림 3A), 침전물의 총 면적(그림 3B) 및 총 IOD(그림 3C)가 처녀 여성과 남성 모두에서 P. 구아자바 추출물(1g/100mL) 그룹에 비해 일반 식품군에서 유의하게 더 높은 값을 나타냈다는 것을 보여줍니다. 불행하게도, 로페라마이드는 남녀 모두에게 어떤 효과도 나타내지 않았다 (그러나 D. melanogaster에서 진경제로 작용한다는 것은 이미 입증되었다)34 반면 크로펠레머는 여성에게만 효과가 있었다.
그림 3: ITPi 변형률 분석. ITPi 균주는 일반 식품, 1g/100mL P. 구아바 추출물, 1g/100mL 크로펠레머 및 10mM 로페라미드가 보충된 식품의 네 가지 조건에서 분석되었습니다. 데이터는 암컷과 수컷 모두에서 각 조건의 평균 ± SD로 표시됩니다(페트리 접시의 양면에 대한 6회 반복의 경우). 통계 분석은 두 그룹을 비교하는 학생의 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. p-값은 다음과 같이 표시됩니다: *: p < 0.05; **: p < 0.01; : p < 0.001, ****: p < 0.0001. (A) 1g/100mL Crofelemer, 10mM Loperamide, 1g/100mL P. guajava 추출물이 보충된 음식을 먹인 파리와 일반 음식을 먹인 파리에서 ITPi 균주의 분변 침전물 수를 비교했습니다. 또한 처녀 여성과 남성 사이의 분변 침전물 수의 차이도 분석되었습니다. 두 그룹 모두에서, 1 g/100 mL P. guajava 추출물을 먹인 파리보다 일반 음식을 먹인 파리에서 분변 침전물의 수가 훨씬 더 높았습니다. (B) ITPi 균주의 분변 침전물의 총 면적을 일반 사료를 먹인 파리와 1g/100mL P. 구아바 추출물, 1g/100mL 크로펠레머 및 10mM 로페라미드가 보충된 사료를 먹인 파리에서 비교했습니다. 수컷과 암컷의 경우, 1g/100mL P. 구아바 추출물을 먹인 파리보다 일반 음식을 먹인 파리의 분변 침전물의 총 면적이 훨씬 더 높았습니다. (C) 일반 사료를 먹은 파리와 1g/100mL P. 구아바 추출물, 1g/100mL 크로펠레머 및 10mM 로페라미드가 보충된 사료를 먹인 파리 간에 ITPi 균주의 총 IOD 차이를 분석했습니다. 수컷과 암컷의 총 IOD는 1g/100mL P. 구아바 추출물을 먹인 파리보다 일반 음식을 먹인 파리에서 훨씬 더 높았습니다. 약어: F = 여성; M = 남성; 크로페 = 크로펠레머; 로페 = 로페라미드; 음식도 아니고 = 일반 음식; P. gua ext = Psidium guajava 추출물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
P. 구아바 추출물 그룹에서 관찰된 배설 감소가 식품 소비 감소가 아니라 추출물의 억제 효과에 의한 것임을 입증하기 위해 직접 섭취 추정 및 고형 식품 소비량 추적(DIETS) 방법35을 수행했습니다. 그 결과, 파리가 정상보다 적은 양의 음식을 섭취하게 하는 수컷의 로페라마이드를 제외하고는 약물을 투여받은 그룹과 약물을 투여하지 않은 그룹 간에 음식 섭취에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(그림 4).
그림 4: 공급 분석. 먹이 분석은 파리의 고형 음식 섭취를 측정했습니다. 파리는 1g/100mL P. 구아바 추출물, 1g/100mL 크로펠레머, 10mM 로페라마이드 및 일반 사료의 4가지 배지를 먹였습니다. 각 그룹은 20마리의 파리와 5개의 복제물로 구성되었습니다. 데이터는 여성과 남성 모두에서 각 조건의 평균 ± SD로 표시됩니다. 통계 분석은 두 그룹을 비교하는 학생의 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. p-값은 다음과 같이 표시됩니다: *: p < 0.05; **: p < 0.01; : p < 0.001, ****: p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
분변 침전물과 먹이 분석 결과는 P. guajava 추출물이 초파리의 설사를 치료하는 신뢰할 수 있는 약용 식물임을 보여주었습니다.
보충 그림 1: T.U.R.D. 오프닝 창. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 조정할 설정이 있는 T.UR.D. 창. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
D. melanogaster 는 D. melanogaster 와 인간 사이 유전자에 있는 유사성 때문에 각종 생물학 과정을 위한 모형으로 넓게 받아들여졌다36. D . melanogaster 를 장관을 연구하기 위한 모델로 사용하는 것이 일반적이며 T.U.R.D.의 적용은 대변 침전물의 수, 면적 및 양을 추정하는 데 사용되었습니다. 그러나 표현형 검출 방법은 초파리의 설사를 평가하는 데 사용되지 않았습니다. 따라서 이 프로토콜은 대변 침전물을 감지하여 설사의 존재를 대략적으로 평가하는 새로운 방법을 도입합니다.
대변 침전물은 장관 기능과 건강의 필수 지표이다37. 이러한 맥락에서, 대변 침전물의 다양한 매개 변수를 조사하기 위해 약물 함유 배지에서 D. melanogaster 를 사육하는 방법이 제안됩니다. 침전물 수를 모니터링하여 배변 빈도를 결정하고 약물이 장 통과에 영향을 미치는지 여부를 평가할 수 있습니다. 침전물의 전체 면적을 측정하여 대변의 농도와 희석을 평가할 수 있으며, 이는 장관의 전반적인 건강을 결정하는 데 중요한 요소입니다. 또한 총 통합 광학 밀도(IOD)를 사용하여 침전물에 존재하는 배설물 물질의 총량을 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장에 영향을 미치는 식물 추출물뿐만 아니라 약물을 선별하고 평가하는 효율적인 방법을 제공합니다. D. melanogaster 를 모델 유기체로 사용하면 잠재적인 약물의 효능을 평가할 수 있어 약물 발견 프로세스를 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 식물 추출물에 이 방법을 적용함으로써 연구자들은 지사제로서의 사용을 검증하는 데 도움을 줄 수 있습니다.
D. melanogaster의 대변 침전물을 연구하기 위해 이 프로토콜을 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배지에서 원하는 약물 농도를 달성하는 데 필요한 질량을 계산하는 것이 중요합니다. 또한, 약물을 배지에 첨가할 때 양호한 준비 조건을 보장하는 것이 중요합니다., 고온은 약물을 분해하고 효능에 영향을 미칠 수 있기 때문에. 둘째, 이 프로토콜에서는 암컷 파리의 선택이 중요합니다. 처녀 암컷과 짝짓기 암컷 사이의 배설물 배출량 차이를 피하기 위해 처녀 암컷 파리를 사용하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 처녀 암컷에 의해 생성된 반점은 짝짓기 암컷보다 더 원형이며, 짝짓기 암컷은 처녀 암컷보다 더 많은 배설물을 배설하는 경향이 있다27,28. 따라서 수집 된 모든 암컷이 처녀인지 확인하기 위해 8 시간 전에 파리를 수집하는 것이 좋습니다. 또한 테스트된 파리는 건강이 음식 섭취와 배설물 배출량에 영향을 미칠 수 있으므로 강하고 건강해야 합니다. 예를 들어, 날개 모양이 비정상적인 파리는 먹이를 얻는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 마지막으로, T.U.R.D.를 성공적으로 사용하기 위해서는 블록 크기(픽셀)와 오프셋 설정이 중요합니다. 이미지의 빛 대비의 차이로 인해 배설물 침전물을 가장 잘 식별하기 위해 다른 설정을 시도해야 할 수도 있습니다.
제시된 방법은 효과적이지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 하나는 배지에서 약물 농도의 정확도입니다. 준비 중에 매체가 가열됨에 따라 일부 물이 증발하여 약물 농도에 영향을 줄 수 있습니다. 또 다른 제한 사항은 페트리 접시를 스캔하는 것입니다. 페트리 접시의 일부(즉, 가장자리)는 스캔되지 않으며, 이로 인해 총 배설물 침전물이 잘못 계산될 수 있습니다. 또한 파리는 페트리 접시의 상단 및 하단 덮개에 동일한 양의 배설물 침전물을 생성하지 않습니다. 하단 커버에 더 많은 침전물을 생성하는 경향이 있기 때문에 상단 커버와 하단 커버 사이의 분석 표준 편차가 높을 수 있으며, 이는 결과의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 연구원은 D. melanogaster의 설사를 연구할 수 있습니다. 약물 함유 배지를 변형시킴으로써 이 방법은 약물 발견에 대한 새로운 접근 방식을 제공하는 지사제 식물을 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 전통 의학과 천연 제품은 수세기 동안 위장 장애를 포함한 다양한 질병을 치료하는 데 사용되어 왔습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대변 침전물에 대한 식물 추출물의 효능을 평가함으로써 장관 장애에 대한 잠재적인 새로운 치료법을 식별하고 지사제로 사용하기 위한 과학적 근거를 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 약물 발견 및 민족 약리학 분야에 귀중한 기여를 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
초파리 균주를 제공해 주신 Martina Gáliková 박사님께 감사드립니다. 연구에 대한 피드백을 제공하고 모델을 개선하는 데 도움을 준 Michelle Crozatier-Borde와 Marc Haenlin 팀에 감사드립니다. Crofelemer라는 약을 제공해 주신 Napo Pharmaceuticals Company에 감사드립니다. 저자들은 또한 이 프로토콜을 출판할 수 있는 기회를 제공해준 객원 편집자 Hugues Petitjean 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 ANR-22-CE03-0001-01 프로젝트에 따라 ANR(Agence Nationale de la Recherche)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
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