Summary
Hier wordt een methode beschreven om Drosophila melanogaster te voeden met medicijnen en plantenextracten en hun effect op het maagdarmkanaal te beoordelen door de fecale afzettingen van fruitvliegjes te analyseren. De met medicijnen behandelde vliegen kunnen worden gebruikt als model voor verder onderzoek.
Abstract
Om de menselijke gastro-intestinale fysiologie te bestuderen, hebben biomedische wetenschappers vertrouwd op het gebruik van modelorganismen. Hoewel veel onderzoekers muizen als model hebben gebruikt om de darmfunctie te bestuderen, hebben slechts enkele rapporten zich gericht op Drosophila melanogaster (D. melanogaster). In vergelijking met muizen bieden fruitvliegjes veel voordelen, zoals een korte levenscyclus, kosteneffectief en eenvoudig onderhoud en geen ethische problemen. Bovendien zijn de gastro-intestinale fysiologie, anatomie en signaalroutes van zoogdieren sterk geconserveerd in D. melanogaster. Plantenextracten worden van oudsher gebruikt om diarree en constipatie te behandelen. Psidium guajava (P. guajava) is bijvoorbeeld een van de meest bekende middelen tegen diarree in de tropen. Er zijn echter geen studies die het effect van diarreeremmers en laxeermiddelen en plantenextracten bij D. melanogaster hebben geëvalueerd, en het blijft onbekend of vergelijkbare effecten (bijv. kleinere, meer geconcentreerde en minder overvloedige fecale afzettingen in het geval van geneesmiddelen tegen diarree) kunnen optreden bij de fruitvliegen in vergelijking met zoogdieren. In deze studie wordt een antidiarree-effect geïnduceerd door P. guajava aangetoond in een D. melanogaster-stam die een diarrheïsch fenotype vertoont. Fecale bemonstering geproduceerd door vliegen wordt gecontroleerd met behulp van een met kleurstof aangevuld voedsel. Dit protocol schetst de methode die wordt gebruikt voor het bereiden van voedsel met medicijnen, het evalueren van de fecale afzettingen van vliegen die met deze voedselbereidingen worden gevoed en het interpreteren van de verkregen gegevens.
Introduction
Het maagdarmkanaal (GI), ook wel het spijsverteringskanaal genoemd, is verantwoordelijk voor de vertering en opname van voedingsstoffen en de uitscheiding van onverteerde producten1. Het maagdarmkanaal is kwetsbaar voor een reeks aandoeningen die ongemak, pijn en verstoring van het dagelijks leven kunnen veroorzaken. Gastro-intestinale stoornissen omvatten buikpijn en ongemak, een opgeblazen gevoel, brandend maagzuur, indigestie of dyspepsie, misselijkheid, braken, diarree enobstipatie. Diarree is het meest voorkomende symptoom van gastro-intestinale stoornis3 en wordt gedefinieerd als een ziekte met ten minste drie losse en waterige ontlasting gedurende een periode van 24 uur4. Diarree wordt veroorzaakt door een breed scala aan ziekteverwekkers, waaronder bacteriën, virussen, parasieten, schimmels en kan ook worden veroorzaakt door medicijnen 5,6. Wereldwijd blijft diarree de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij kinderen jonger dan 5 jaar7. Hoewel diarree zichzelf kan oplossen, kan het ook wijzen op een ernstigere onderliggende aandoening als deze langer dan een paar dagen aanhoudt.
Om het darmkanaal te bestuderen, wenden onderzoekers zich tot diermodellen zoals muizen, ratten en varkens 8,9. Het gebruik van deze dieren kan echter duur en tijdrovend zijn omdat ze gespecialiseerde faciliteiten en ethische overwegingen vereisen. Recente studies hebben aangetoond dat D. melanogaster kan worden gebruikt als een model om het maagdarmkanaal te bestuderen en enkele mechanismen te onderzoeken, zoals het behoud van regeneratieve homeostase, de ontwikkeling van immuunveroudering, het verlies van de epitheliale barrièrefunctie en de afname van de metabole homeostase10,11. D. melanogaster, bekend als de fruitvlieg, deelt een hoge mate van genetische homologie met mensen; Van ongeveer 75% van de menselijke ziektegenen wordt aangenomen dat ze een functionele homoloog hebben in vlieg12. Ze hebben ook een eenvoudig spijsverteringsstelsel dat bestaat uit een voordarm, een middendarm en een achterdarm13. D. melanogaster is gemakkelijk te kweken in het laboratorium en kan op verschillende manieren genetisch gemodificeerd worden14. Daarom is het gebruik van D. melanogaster voor in vivo testen een krachtig hulpmiddel waarmee onderzoekers complexe biologische processen in een gecontroleerde omgeving kunnen bestuderen.
Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) gebruikt ongeveer 80% van de mensen in ontwikkelingslanden traditionele geneeskunde voor hun primairegezondheidsbehoeften15. Het hoge gebruik van geneeskrachtige planten kan worden verklaard door het feit dat ze gemakkelijk verkrijgbaar en goedkoop zijn en weinig bijwerkingen hebben16. De belangrijkste plantendelen die in kruidentherapie worden gebruikt, zijn bladeren, schors, wortels, zaden17, terwijl de belangrijkste bereidingsmethoden infusie, afkooksel en maceratie zijn18. Deze kruidengeneesmiddelen bevatten fytochemische stoffen zoals alkaloïden, terpenoïden, flavonoïden, steroïden, tannines en koolhydraten19, die therapeutische effecten hebben op het menselijk lichaam. Mensen gebruiken een verscheidenheid aan geneeskrachtige planten om gastro-intestinale aandoeningen zoals diarree, buikpijn en dysenterie te behandelen20. Psidium guajava is bijvoorbeeld een van de meest gebruikte planten ter wereld om diarree te behandelen. Verschillende farmacologische en klinische tests hebben de veiligheid ervan al aangetoond, waardoor het een goede kandidaat tegen diarree is om 21,22 te bestuderen. De belangrijkste beperkingen van kruidengeneesmiddelen zijn echter het gebrek aan efficiëntie en veiligheidsbeoordeling, evenals een gebrek aan definitieve en volledige informatie over de samenstelling van de gebruikte plantenextracten23. Om de efficiëntie en de veiligheid van kruidengeneesmiddelen te valideren, is een systematische aanpak met experimentele en klinische validatie vereist en moet de aanpak worden ondersteund door voldoende gegevens uit in-vivo- en in-vitrostudies.
Om traditionele remedies te evalueren op hun werkzaamheid bij de behandeling van diarree, is het gebruik van muizen en ratten de afgelopen decennia overheersend geweest24,25. Vanwege de belangrijkste eerder genoemde voordelen, d.w.z. gebruiksgemak, betaalbare, repliceerbare, geconserveerde absorptie- en spijsverteringsfuncties tussen vliegen en zoogdieren, stellen we voor om D. melanogaster te gebruiken als model om de diarreebestrijdende activiteit van planten te evalueren. Het diarroïsche fenotype bij D. melanogaster kan worden gekenmerkt door verschillende kenmerken, waaronder een verhoogde overvloed aan fecale afzettingen, grotere afzettingen, een lichtere kleuring (minder geconcentreerd) en meer fecaal materiaal. Dit fenotype kan worden gekwantificeerd aan de hand van verschillende parameters: aantal fecale afzettingen, totale oppervlakte van afzettingen, gemiddelde lichtheid en totale geïntegreerde optische dichtheid (IOD). Totale IOD wordt gedefinieerd als het totale kleurstofgehalte van de afzetting, d.w.z. het totale fecale materiaal dat wordt uitgescheiden27. Eerder is een test ontwikkeld om fecale afzettingen van D. melanogaster27,28 te analyseren. In deze test werd de ultieme lezer van mest (T.U.R.D.) gebruikt als fecaal analyse-instrument, dat het mogelijk maakt om het aantal, de grootte en de lichtheid van fecale afzettingen te controleren en zo de darmfysiologie van de fruitvliegjes te volgen. Deze methode werd echter nooit toegepast om het diarrheic fenotype bij vliegen te evalueren. Het Ion Transport Peptide (ITP)-gen is een belangrijke endocriene regulator van dorst en uitscheiding en combineert waterhomeostase met voeding in D. melanogaster. In een recente studie werd aangetoond dat de snelheid van voedseldoorvoer door het maagdarmkanaal en de frequentie van ontlastingsgebeurtenissen werden verminderd door ITP-overexpressie en verhoogd door ITP-knockdown. Dit laatste fenotype werd door de auteurs van deze studie beschreven als diarrheic29.
In dit protocol wordt een aangepaste versie van de fecale afzettingstest gebruikt om het effect van een middel tegen diarree (d.w.z. guavebladextract) op het maagdarmkanaal van D. melanogaster te beoordelen door de ITPi-stam als diarrheïsch model te gebruiken. Het algemene doel van deze methode is: 1) een gemakkelijke en betrouwbare methode bieden om het antidiarree-effect van geneesmiddelen en plantenextracten te evalueren, en 2) de ontdekking mogelijk te maken van bioactieve stoffen die verantwoordelijk zijn voor het antidiarree-effect in plantenextracten door een bioactiviteit-geleide benadering toe te passen.
Protocol
1. Plantenextract bereiden
- Verzamel Psidium guajava L. bladeren30 van een volwassen boom en verwerk als volgt: droog de bladeren gedurende 6 dagen in een oven op 40 °C, vervolgens 6 dagen aan de lucht laten drogen, vervolgens opnieuw drogen in de oven op 40 °C gedurende 4 dagen, en tenslotte bladpoeder bereiden door de droge bladeren te malen in een maalmolen of een koffiemolen.
- Macureer 100 g van het gedroogde poeder in 1 L 96% ethanol gedurende 24 uur, onder voortdurend roeren met behulp van een shaker. Dompel de plantenresten nogmaals aan hetzelfde proces en damp de resulterende filtraten droog met behulp van een vacuüm roterende verdamper onder gereduceerde druk (175 mbar) bij 40 °C.
- Los het plantenextract op in ethanol om de gewenste concentratie te verkrijgen. Bepaal de optimale concentratie (met behulp van het hier beschreven protocol) door een reeks concentraties te testen.
- Test voor plantenextracten een concentratiebereik van 100 μg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 100 mg/ml en gebruik extracten die geen invloed hebben op de overlevingskans van vliegen. Test voor zuivere verbindingen het volgende concentratiebereik: 0,05, 0,5, 5 en 50 mM12.
2. Voedselmedium bereiden
- Meet 100 ml gedestilleerd water af en giet het in het bekerglas met 4 g suiker en 0,8 g agar (zie materiaaltabel). Verwarm tot 100 °C (al roerend) en houd 10 minuten vast.
- Verlaag de temperatuur tot 80 °C, voeg al roerend 7,4 g bloem en 2,8 g gist toe. Verwarm gedurende ten minste 20 minuten, nog steeds roerend en regel de temperatuur die rond de 80 °C moet zijn.
- Voeg de moldex-propionzuuroplossing toe (1 ml moldex en 0,3 g propionzuur goed mengen). Wacht tot de temperatuur is gedaald tot ongeveer 50 °C, voeg de plantenextractoplossing (1 mg/ml) en 0,5 g broomfenolblauw poeder toe.
OPMERKING: Zie rubriek 1.3.1 voor meer informatie over de andere te testen concentraties. - Giet het voedsel in de petrischaaltjes en stop als de petrischaal vol is (Figuur 1A). Laat de petrischaaltjes afkoelen tot kamertemperatuur (ongeveer 3 uur), sluit het deksel en bewaar ze in de koelkast bij 4 °C.
NOTITIE: Petrischalen mogen niet langer dan 2 weken in de koelkast worden bewaard om verdamping van water te voorkomen.
Figuur 1: Demonstratie van het experimentele proces voor de fecale afzettingstest. (A) Afbeelding van petrischalen vol voedingsmedium. Zorg ervoor dat er voldoende voedsel in de petrischaal zit, zodat er geen openingen zijn die de vliegen vasthouden en voorkomen dat ze bewegen. Overlaad de petrischaal echter niet met voedsel, zodat het oppervlak gelijkmatig kan worden bedekt. (B) Afbeelding van de spatel zoals beschreven in het protocol. (C) Afbeelding van de fecale afzettingstest zoals beschreven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Vliegen voorbereiden
- Bereid de CO2 - tanks, het CO2 -blaaspistool voor met naalden, vliegenkussen, penseel en microscoop. Het vliegstation levert CO2 aan zowel het vliegenkussen als het blaaspistool. Het vliegenkussen wordt gebruikt voor het sorteren van vliegen, terwijl het CO2 -blaaspistool wordt gebruikt om vliegen in flesjes, flessen en petrischalen te verdoven.
- Standaardiseer de leeftijd van de vliegen door flesjes te selecteren die poppen bevatten (minimaal 10) en gooi de volwassen vliegen uit de buis met behulp van de volgende methode. Draai de injectieflacons één voor één ondersteboven en steek de naald tussen de wattenstaaf en de zijwand van de flacon. Verdoof volwassen vliegen met het CO2 blaaspistool totdat alle vliegen op de katoenen plug slapen (er zijn een paar seconden nodig om ze te verdoven en de verdovende werking duurt enkele seconden na het loslaten van het blaaspistool). Open de flacon boven een glazen fles met 70% ethanol en laat de vliegen erin vallen. Sluit de injectieflacon met de wattenstaaf en bewaar deze in een incubator bij 25 °C met een luchtvochtigheid van 60%. Stel de lichtcyclus van de couveuse in op 12 uur licht/12 uur donker.
- Sorteer ze na incubatie (maximaal 8 uur) in maagdelijke vrouwtjes en mannetjes onder de microscoop en het vliegenkussen door ze op hun rug te draaien en naar hun geslachtsdelen te kijken.
- Vrouwelijke genitaliën zijn bleek in vergelijking met mannelijke genitaliën, die roodachtig van kleur zijn. Mannetjes zijn ook te herkennen aan de aanwezigheid van donkere borstelharen, sekskammen genaamd, op hun voorpoten. Verdeel de vliegen over twee verse buizen (één voor mannetjes en één voor vrouwtjes) en broed ze 6-8 dagen uit bij 25 °C.
OPMERKING: Bij 25 °C blijven de vrouwtjes ongeveer 8 uur na het uitkomen maagdelijk.
- Vrouwelijke genitaliën zijn bleek in vergelijking met mannelijke genitaliën, die roodachtig van kleur zijn. Mannetjes zijn ook te herkennen aan de aanwezigheid van donkere borstelharen, sekskammen genaamd, op hun voorpoten. Verdeel de vliegen over twee verse buizen (één voor mannetjes en één voor vrouwtjes) en broed ze 6-8 dagen uit bij 25 °C.
4. Fecale afzettingstest
- Label de petrischalen met de bijbehorende stam, het geslacht en het medicijn om verwarring tussen de petrischalen te voorkomen. Stapel de petrischaaltjes op elkaar.
- Pak de petrischaaltjes met het geverfde voedsel en draai ze om op het vloeipapier om de extra vloeistof op te nemen. Snijd het voedsel met een spatel (Figuur 1B) in 12 gelijke delen en gebruik vervolgens de spatel om een plakje in een lege petrischaal te doen.
OPMERKING: Afhankelijk van het aantal replicaten kan het aantal te snijden plakjes worden verhoogd tot 20 per petrischaal. Elke plak moet even groot zijn. - Verdoof de vliegen met CO2 totdat alle vliegen op de wattenstaaf slapen. Breng zes gezonde vliegen over in elke petrischaal (Figuur 1C), sluit het deksel onmiddellijk en plaats ze vervolgens in de incubator (25°C, 60% luchtvochtigheid, 12 uur licht / 12 uur donker).
- Om ervoor te zorgen dat de vliegen tijdens het experiment niet uit de petrischaal ontsnappen, bevestigt u de boven- en onderafdekking van de petrischaal met een tape. Bereid voor elke testgroep (minstens) zes nagebootste petrischaaltjes.
- Nadat u de vliegen 24 uur hebt laten steigeren, gebruikt u CO2 om ze te verdoven, brengt u de vliegen over in een container gevuld met 70% ethanol en gooit u het resterende voedsel weg.
- Bewaar de petrischaaltjes en ga verder met stap 5.
5. Kwantificering van petrischalen
- Stel een map in op de computer en hernoem deze door de naam van de experimentstam, het geslacht van de vliegen en het type gebruikte drugs op te nemen. Maak in deze map submappen met de naam Origineel, Knippen en Analyseren.
- Scan de petrischaaltjes met behulp van een scanner met hoge resolutie en een optische resolutie van 6.400 pixels per inch (ppi). Scan de boven- en onderkant van elke petrischaal afzonderlijk door ze afzonderlijk in het midden van het scannerveld te plaatsen.
- Open de applicatie die op de computer is geïnstalleerd. Er wordt een welkomstvenster geopend op het computerscherm met alle algemene instellingen (Figuur 2A).
OPMERKING: Wijzig de geavanceerde instellingen niet. Deze stap is alleen geldig voor gebruikers die dezelfde scanner hebben als voorgesteld in de Materiaaltabel. Raadpleeg de richtlijnen als u andere software gebruikt.- Geef de petrischaal een naam in de toepassing, door volgnummer, boven- of onderdeksel, geslacht en type voedsel te vermelden. Selecteer de originele set van de submap in stap 5.1.
- Bekijk een voorbeeld van de petrischaal. Klik op Voorbeeld onderaan het venster, wacht een paar seconden totdat de scanner vooraf scant, waarna er een venster op het computerscherm verschijnt. Verplaats het vierkant dat op het scherm wordt weergegeven om de petrischaal te omringen.
- Klik rechtsonder in het venster op het computerscherm op Scannen , de scan wordt automatisch als afbeelding opgeslagen in de map van uw keuze.
- Snijd de afbeelding bij met behulp van een applicatie (bijv. de open-source Fiji-applicatie), zodat er geen artefacten en voedselresten als afzettingen worden beschouwd.
OPMERKING: De volgende stappen zijn alleen geldig voor gebruikers die de Fiji-toepassing hebben. Raadpleeg de richtlijnen als u andere software gebruikt.- Open de Fiji-applicatie, wacht een paar seconden totdat er een werkbalk op het scherm verschijnt.
- Sleep de afbeelding die u wilt bijsnijden naar de werkbalk. Selecteer het 3e pictogram Polygoonselecties in de werkbalk, snijd het ongewenste deel van de foto (het gekleurde cirkeldiagram) bij door op het scherm te klikken om een hoek rond het cirkeldiagram te markeren (Figuren 2B-1,2).
OPMERKING: Bij het afbakenen van het bijsnijdgebied binnen een afbeelding, is het absoluut noodzakelijk dat de gekozen frames naadloos end-to-end met elkaar verbonden zijn. - Klik op Bewerken linksboven in de balk en vervolgens op Vullen/Buiten wissen (Figuur 2B-3).
- Om de foto op te slaan, klikt u op Bestand linksboven in de balk, vervolgens op Opslaan als en ten slotte op Tiff. Kies de submap Knippen set in stap 5.1.
OPMERKING: Zorg er bij het opslaan van de bijgesneden afbeelding voor dat er geen speciale tekens (bijv. !, &, $, #, _,-,...) of te veel tekens in de bestandsnaam aanwezig zijn.
Figuur 2: Belangrijkste stappen in het proces van het analyseren van de gegevens van de fecale afzettingstest. (A) Schermafbeelding met de instellingsinformatie van de scantoepassing. (B) Afbeeldingen bijgesneden met behulp van de Fiji-applicatie. Zorg ervoor dat er geen artefacten en voedselresten als afzettingen worden beschouwd. (C) Schermafbeelding die laat zien hoe het eruit ziet bij het openen van de Excel_merge-v4-toepassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Identificatie van fecale afzettingen met behulp van de ultieme lezer van open source-software voor mest
OPMERKING: De introductie en het gebruik van de ultieme lezer van mestsoftware is te vinden in Aanvullend bestand 1.
- Open eerst de T.U.R.D.-software (aanvullende afbeelding 1). Maak een nieuw experiment en geef het document een naam en sla het vervolgens op in de submap Analyse die is ingesteld in stap 5.1.
- Klik op Platen en vervolgens op Plaat toevoegen. Selecteer de petrischaal die moet worden verwerkt. Er verschijnt een nieuw venster met de namen van de geselecteerde platen en nieuwe parameters. Stel de blokgrootte, offset, minusgrootte en max-grootte in (aanvullende afbeelding 2).
- Om te controleren of de gedetecteerde fecale afzettingen de juiste zijn, klikt u op Platen, vervolgens op Geselecteerde platen inspecteren, vervolgens op Afbeeldingen en Geannoteerde afbeeldingen bekijken (aanvullende afbeelding 3). Zoom in en bekijk de tellingen. Als er slechts enkele afzettingen zijn die niet in de analyse moeten worden opgenomen, deselecteer dan de afzettingen die moeten worden uitgesloten (aanvullende figuur 4).
- Voor elke nieuwe afbeelding die u wilt verwerken, start u opnieuw vanaf stap 6.3.
- Nadat u de platen met de T.U.R.D.-software hebt geanalyseerd, wijzigt u het aantal vliegen door op nr. Vliegt (aanvullende figuur 5).
- Wijzig de groepsnaam door te klikken op Platen > Groepen bewerken > Toevoegen, en kies vervolgens op Groepskolom de groepsnaam.
- Exporteer de verschillende gerepliceerde gegevens afzonderlijk door te klikken op Analyseer > beschrijvende statistieken > selecteer groep (aanvullende figuur 6). Bewaar alle spreadsheetbestanden (.csv) in dezelfde map.
- Om alle bestanden (verkregen in stap 6.7) in een unieke spreadsheet te verzamelen, opent u de toepassing Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), wacht u tot de volgende zin verschijnt Selecteer het pad van de map (met .csv bestanden):, en plak vervolgens het bovenstaande mapadres. Het pad kan bijvoorbeeld C:\Experiment\Fecale stortingstest\ zijn en klik vervolgens twee keer op Enter op het toetsenbord (Afbeelding 2C). Daarna wordt er een nieuw spreadsheetbestand aangemaakt in dezelfde map. Het nieuwe spreadsheetbestand bevat alle geëxporteerde bestanden in verschillende werkbladen.
- Voeg in het vorige spreadsheetbestand nog een blad toe om het gemiddelde van elke parameter van alle replica's te verzamelen (gebruik de functie VERT.ZOEKEN voor het verwerken van de gegevens). Een voorbeeld wordt gegeven in de aanvullende tabel 1.
- Analyseer de p-waarde.
Representative Results
De hier gepresenteerde studie toont aan dat de meting van diarree bij D. melanogaster kan worden bereikt door het gebruik van de fecale afzettingstest. Significante verschillen tussen de fenotypes (diarrheic of niet) kunnen worden bepaald door verschillende parameters te analyseren, waaronder het aantal fecale afzettingen, de totale oppervlakte van afzettingen, de gemiddelde oppervlakte van afzettingen, de gemiddelde lichtheid en de totale geïntegreerde optische dichtheid (IOD), die een maat is voor de totale hoeveelheid kleurstof die in de afzetting aanwezig is en het totale fecale materiaalgehalte vertegenwoordigt dat wordt uitgescheiden27.
Het uitschakelen van het ITP-gen bij vliegen kan een diarrheïsch fenotype induceren, gekenmerkt door een verhoogde frequentie van ontlasting, waardoor ze een geschikt model zijn voor het bestuderen van diarree29. In het kader van dit experiment werd de ITPi-stam (w1118; dochterloos-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) gebruikt en gekweekt op een standaardmedium. Psidium guajava-bladerenextract werd geselecteerd als de antidiarree-interventie, gezien het wijdverbreide gebruik van deze plant in tropische gebieden om diarree te beheersen. Crofelemer, een middel tegen diarree, werd goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) om symptomatische verlichting te bieden voor niet-infectieuze diarree bij volwassen patiënten met HIV/AIDS die antiretrovirale therapie ondergaan31. Crofelemer is een extract van de latex van Croton lechleri Müll.Arg. stengel schors32. Loperamide is een synthetisch medicijn dat wereldwijd wordt gebruikt om diarree tebehandelen33. Zowel Crofelemer als Loperamide werden gebruikt als potentiële positieve controles.
De hypothese was dat het voeren van vliegen met P. guajava-extract , Crofelemer en Loperamide het diarrheïsche fenotype zou verminderen in vergelijking met vliegen die met normaal voedsel werden gevoerd. Om deze hypothese te onderzoeken, werd een meting van fecale afzettingen uitgevoerd in D. melanogaster door verschillende parameters te vergelijken tussen vliegen die werden gevoed met normaal voedsel en vliegen die werden gevoed met P. guajava-extract (1 g/100 ml), Crofelemer (1 g/100 ml) en loperamide (10 mM). Voor de opzet van het experiment werden maagdelijke vrouwtjes of mannetjes van 6-7 dagen oud gebruikt. Elke petrischaal bevatte zes vliegen en er werden zes replica's uitgevoerd. De vliegen werden 24 uur lang gekweekt en daarna werd elke groep geanalyseerd. De t-toets van de student werd gebruikt om het significante verschil tussen de testgroep te vergelijken. De resultaten tonen aan dat het aantal fecale afzettingen (Figuur 3A), de totale oppervlakte van de afzettingen (Figuur 3B) en de totale IOD (Figuur 3C) significant hogere waarden vertoonden in de normale voedselgroep in vergelijking met de P. guajava-extract (1 g/100 ml) groep, zowel bij maagdelijke vrouwtjes als bij mannetjes. Helaas vertoonde loperamide geen effect bij beide geslachten (maar het was al aangetoond dat het werkt als een krampstillend middel bij D. melanogaster)34 , terwijl Crofelemer alleen een effect had op vrouwen.
Figuur 3: Analyse van de ITPi-stam . De ITPi-stam werd geanalyseerd onder vier omstandigheden: voeding met normaal voedsel, voedsel aangevuld met 1 g/100 ml P. guajava-extract , 1 g/100 ml Crofelemer en 10 mM Loperamide. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van elke aandoening bij zowel vrouwen als mannen (voor zes replicaten van twee zijden van een petrischaal). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de t-toets van een student waarbij twee groepen werden vergeleken. p-waarden worden als volgt weergegeven: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Het aantal fecale afzettingen van de ITPi-stam werd vergeleken bij vliegen die werden gevoed met voedsel aangevuld met 1 g/100 ml Crofelemer, 10 mM Loperamide, 1 g/100 ml P. guajava-extract en bij vliegen die werden gevoed met normaal voedsel. Bovendien werd ook het verschil in het aantal fecale afzettingen tussen maagdelijke vrouwtjes en mannetjes geanalyseerd. In beide groepen was het aantal fecale afzettingen significant hoger bij vliegen die normaal voedsel kregen dan bij vliegen die werden gevoed met 1 g/100 ml P. guajava-extract . (B) De totale oppervlakte van de fecale afzettingen van de ITPi-stam werd vergeleken bij vliegen die werden gevoed met normaal voedsel en bij vliegen die werden gevoed met voedsel aangevuld met 1 g/100 ml P. guajava-extract , 1 g/100 ml Crofelemer en 10 mM Loperamide. Bij mannetjes en vrouwtjes was het totale oppervlak van de fecale afzettingen significant hoger bij vliegen die met normaal voedsel werden gevoed dan bij vliegen die werden gevoed met 1 g/100 ml P. guajava-extract . (C) Het verschil in de totale IOD van de ITPi-stam werd geanalyseerd tussen vliegen die normaal voedsel kregen en vliegen die werden gevoed met voedsel aangevuld met 1 g/100 ml P. guajava-extract , 1 g/100 ml Crofelemer en 10 mM Loperamide. Bij mannetjes en vrouwtjes was de totale IOD significant hoger bij vliegen die normaal voedsel kregen dan bij vliegen die gevoed werden met 1 g/100 ml P. guajava-extract . Afkortingen: F = vrouwelijk; M = mannelijk; Crofe = Crofelemer; Lope = Loperamide; Noch voedsel = Normaal voedsel; P. gua ext = Psidium guajava-extract . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om aan te tonen dat de verminderde uitscheiding die wordt waargenomen in de P. guajava-extractgroep te wijten is aan het remmende effect van het extract en niet aan een verminderde voedselconsumptie, hebben we de directe innameschatting en tracking van de consumptie van vast voedsel (DIETS) methode35 uitgevoerd. De resultaten toonden aan dat er geen significante verschillen waren in voedselconsumptie tussen de groepen die medicijnen kregen en degenen zonder medicijnen, behalve loperamide bij mannen, waardoor vliegen minder voedsel consumeerden dan normaal (figuur 4).
Figuur 4: Voedingstest. De voedingstest meet de consumptie van vast voedsel bij vliegen. Vliegen werden gevoed met vier verschillende mediums: 1 g/100 ml P. guajava-extract , 1 g/100 ml Crofelemer, 10 mM Loperamide en normaal voer. Elke groep bestond uit 20 vliegen met vijf replicaten. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van elke aandoening bij zowel vrouwen als mannen. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de t-toets van een student waarbij twee groepen werden vergeleken. p-waarden worden als volgt weergegeven: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De fecale afzettingen en de resultaten van de voedingstest toonden aan dat P. guajava-extract een betrouwbare medicinale plant is om diarree bij fruitvliegjes te behandelen.
Aanvullende figuur 1: T.U.R.D. openingsvenster. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 2: T.UR.D.-venster met in te stellen instellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: T.U.R.D.-venster met een geannoteerde afbeelding. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: T.U.R.D.-venster met elke gedetecteerde plek van een reeds verwerkt beeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: T.U.R.D.-venster waarin elk verwerkt beeld wordt weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 6: T.U.R.D.-venster met het proces voor het exporteren van de gegevens voor elke groep. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Beknopte handleiding voor het gebruik van de T.U.R.D.-software. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Voorbeeld van de definitieve spreadsheets die klaar zijn voor analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: Aanvraag voor het samenvoegen van spreadsheets. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
D. melanogaster is algemeen aanvaard als een model voor verschillende biologische processen vanwege de gelijkenis in genen tussen D. melanogaster en mensen36. Het gebruik van D. melanogaster als model om het darmkanaal te bestuderen is wijdverbreid en de toepassing van T.U.R.D. is gebruikt om het aantal, de oppervlakte en de hoeveelheid fecale afzettingen te schatten. De fenotypische detectiemethode is echter niet gebruikt om de diarree bij fruitvliegjes te beoordelen. Daarom introduceert dit protocol een nieuwe methode om de aanwezigheid van diarree ruwweg te beoordelen door de fecale afzettingen te detecteren.
Fecale afzettingen zijn een essentiële indicator van de werking en gezondheid van het darmkanaal37. In deze context wordt een methode voorgesteld voor het kweken van D. melanogaster op een medium dat geneesmiddelen bevat om verschillende parameters van fecale afzettingen te onderzoeken. Door het aantal afzettingen te monitoren, is het mogelijk om de frequentie van ontlasting te bepalen en te beoordelen of een medicijn enige invloed heeft op de darmtransit. Het totale oppervlak van de afzettingen kan worden gemeten om de concentratie en verdunning van ontlasting te evalueren, wat een belangrijke factor is bij het bepalen van de algehele gezondheid van het darmkanaal. Bovendien kan de totale geïntegreerde optische dichtheid (IOD) worden gebruikt om de totale hoeveelheid fecaal materiaal in de afzettingen te detecteren. Dit protocol biedt een efficiënte methode om medicijnen en plantenextracten die het darmkanaal aantasten te screenen en te evalueren. Wanneer D. melanogaster wordt gebruikt als een modelorganisme, is het mogelijk om de werkzaamheid van potentiële geneesmiddelen te beoordelen, wat het proces van het ontdekken van geneesmiddelen kan helpen versnellen. Door deze methode toe te passen op plantenextracten, kunnen onderzoekers helpen om hun gebruik als middelen tegen diarree te valideren.
Er zijn verschillende cruciale stappen waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van dit protocol om fecale afzettingen in D. melanogaster te bestuderen. Ten eerste is het essentieel om de massa te berekenen die nodig is om de gewenste concentratie van het medicijn in het medium te bereiken. Bovendien is het belangrijk om te zorgen voor een goede voorbereidingsconditie bij het toevoegen van het medicijn aan het medium, omdat hoge temperaturen het medicijn kunnen afbreken en de potentie ervan kunnen beïnvloeden. Ten tweede is de selectie van vrouwelijke vliegen belangrijk in dit protocol. Het is belangrijk om maagdelijke vrouwtjesvliegen te gebruiken om de verschillen in ontlasting tussen maagdelijke en gepaarde vrouwtjes te voorkomen. De vlekken die door maagdelijke vrouwtjes worden geproduceerd, zijn bijvoorbeeld meer cirkelvormig dan gepaarde vrouwtjes, en gepaarde vrouwtjes hebben de neiging om meer ontlastingsmateriaal uit te scheiden dan maagdelijkevrouwtjes27,28. Daarom wordt aanbevolen om vliegen te verzamelen vóór 8 uur na de ontruiming om ervoor te zorgen dat alle verzamelde vrouwtjes maagd zijn. Bovendien moeten de geteste vliegen sterk en gezond zijn, omdat hun gezondheid de voedselinname en ontlasting kan beïnvloeden. Vliegen met een anormale vorm van vleugels kunnen bijvoorbeeld moeite hebben om aan het voedsel te komen. Tot slot, om T.U.R.D. succesvol te gebruiken, zijn de blokgrootte (pixels) en offset-instellingen cruciaal. Vanwege het verschil in het lichtcontrast van de beelden kan het nodig zijn om verschillende instellingen uit te proberen om de best mogelijke identificatie van fecale afzettingen te bereiken.
Hoewel de gepresenteerde methode effectief is, zijn er verschillende beperkingen. Een daarvan is de nauwkeurigheid van de geneesmiddelconcentratie in het medium. Omdat het medium tijdens de bereiding wordt verwarmd, kan er wat water verdampen, wat de concentratie van het medicijn kan beïnvloeden. Een andere beperking is het scannen van de petrischaaltjes. Sommige delen van de petrischalen (d.w.z. randen) worden niet gescand, en dit kan leiden tot een verkeerde berekening van de totale fecale afzettingen. Bovendien produceren de vliegen niet dezelfde hoeveelheid fecale afzettingen op de boven- en onderkant van de petrischalen. Omdat ze de neiging hebben om meer afzettingen op de bodembedekking te produceren, kan de standaarddeviatie van de analyse tussen de boven- en onderbedekking hoog zijn, wat de nauwkeurigheid van de resultaten kan beïnvloeden.
Met behulp van dit protocol kunnen onderzoekers diarree bestuderen bij D. melanogaster. Door het geneesmiddelbevattende medium aan te passen, kan deze methode worden gebruikt om planten tegen diarree te screenen, wat een nieuwe benadering biedt voor het ontdekken van geneesmiddelen. Traditionele geneeskunde en natuurlijke producten worden al eeuwenlang gebruikt om verschillende ziekten te behandelen, waaronder gastro-intestinale stoornissen. Door dit protocol te gebruiken om de werkzaamheid van plantenextracten op fecale afzettingen te evalueren, kunnen potentiële nieuwe behandelingen voor aandoeningen van het darmkanaal worden geïdentificeerd en kan een wetenschappelijke onderbouwing voor het gebruik ervan als middelen tegen diarree worden gegeven. Deze aanpak kan een waardevolle bijdrage leveren aan het gebied van geneesmiddelenontdekking en etnofarmacologie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dr. Martina Gáliková voor het verstrekken van de Drosophila-soorten . We zijn het team van Michelle Crozatier-Borde en Marc Haenlin dankbaar voor het geven van feedback op onze studie en het helpen verbeteren van ons model. We willen Napo Pharmaceuticals Company bedanken voor het ter beschikking stellen van het medicijn Crofelemer. De auteurs zijn ook de gastredacteur Dr. Hugues Petitjean dankbaar voor het feit dat hij ons de mogelijkheid heeft geboden om dit protocol te publiceren. Deze studie werd gefinancierd door het Agence Nationale de la Recherche (ANR) in het kader van het project ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
- Cheng, L. K., et al.
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D.
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H.
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A.
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
