Summary
Her beskrives en metode for å mate Drosophila melanogaster med medisiner og planteekstrakter og vurdere deres effekt på mage-tarmkanalen ved å analysere fruktfluene fekale forekomster. De medikamentbehandlede fluene kan brukes som modell for videre forskning.
Abstract
For å studere human gastrointestinal fysiologi har biomedisinske forskere stolt på bruk av modellorganismer. Selv om mange forskere har brukt mus som en modell for å studere tarmfunksjonen, har bare noen få rapporter fokusert på Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Sammenlignet med mus gir bananfluer mange fordeler, for eksempel kort livssyklus, kostnadseffektivt og enkelt vedlikehold, og ingen etiske problemer. Videre er pattedyrs gastrointestinale fysiologi, anatomi og signalveier sterkt bevart i D. melanogaster. Planteekstrakter har tradisjonelt blitt brukt til å behandle diaré og forstoppelse. For eksempel er Psidium guajava (P. guajava) et av de mest kjente antidiarrheal-midlene i tropene. Imidlertid har ingen studier evaluert effekten av antidiarrheal og avføringsmidler og planteekstrakter i D. melanogaster, og det er fortsatt ukjent om lignende effekter (f.eks. Mindre, mer konsentrert og mindre rikelig fekale forekomster i tilfelle av antidiarrheal drugs) kan forekomme i fruktfluene sammenlignet med pattedyr. I denne studien er en antidiarrheal effekt indusert av P. guajava demonstrert i en D. melanogaster stamme som presenterer en diaré fenotype. Fekal prøvetaking produsert av fluer overvåkes ved hjelp av en fargestoffsupplert mat. Denne protokollen skisserer metoden som brukes til å tilberede mat med narkotika, evaluere fekale forekomster av fluer matet på disse matpreparatene og tolke dataene som er oppnådd.
Introduction
Mage-tarmkanalen (GI), også kalt fordøyelseskanalen, er ansvarlig for fordøyelsen og absorpsjonen av næringsstoffer og utskillelse av ufordøyde produkter1. GI-kanalen er sårbar for en rekke lidelser som kan forårsake ubehag, smerte og forstyrrelse i dagliglivet. Gastrointestinale sykdommer inkluderer magesmerter og ubehag, oppblåsthet, halsbrann, fordøyelsesbesvær eller dyspepsi, kvalme, oppkast, diaré og forstoppelse2. Diaré er det vanligste symptomet på GI-lidelse3, og det er definert som en sykdom med minst tre løs og vannaktig avføring i løpet av en 24 timers periode4. Diaré er forårsaket av et bredt spekter av patogener, inkludert bakterier, virus, parasitter, sopp, og kan også være forårsaket av narkotika 5,6. Over hele verden fortsetter diaré å være den nest største dødsårsaken blant barn under 5 år7. Selv om diaré kan løse seg selv, kan det også indikere en mer alvorlig underliggende tilstand hvis den varer i mer enn noen få dager.
For å studere tarmkanalen henvender forskerne seg til dyremodeller som mus, rotter og griser 8,9. Imidlertid kan bruken av disse dyrene være dyrt og tidkrevende fordi de krever spesialiserte fasiliteter og etiske hensyn. Nylige studier har vist at D. melanogaster kan brukes som en modell for å studere GI-kanalen og undersøke noen mekanismer som vedlikehold av regenerativ homeostase, utvikling av immun senescens, tap av epitelbarrierefunksjon og nedgangen i metabolsk homeostase10,11. D. melanogaster, kjent som bananfluen, deler en høy grad av genetisk homologi med mennesker; Omtrent 75% av menneskelige sykdomsgener antas å ha en funksjonell homolog i FLY12. De har også et enkelt fordøyelsessystem bestående av en foregut, en midgut og en hindgut13. D. melanogaster er lett å dyrke i laboratoriet og kan genmodifiseres på forskjellige måter14. Derfor er bruk av D. melanogaster for in vivo-testing et kraftig verktøy som gjør det mulig for forskere å studere komplekse biologiske prosesser i en kontrollert setting.
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) bruker ca 80% av mennesker som bor i utviklingsland tradisjonell medisin for deres primære helsebehov15. Den høye bruken av medisinplanter kan forklares med at de er lett tilgjengelige, billige og har få bivirkninger16. De viktigste plantedelene som brukes i urteterapi inkluderer blader, bark, røtter, frø17, mens de viktigste fremstillingsmetodene er infusjon, avkok og maserasjon18. Disse urtemedisinene inneholder fytokjemiske stoffer som alkaloider, terpenoider, flavonoider, steroider, tanniner og karbohydrater19, som har terapeutiske effekter på menneskekroppen. Folk bruker en rekke medisinske planter for å behandle GI-lidelser som diaré, magesmerter og dysenteri20. For eksempel er Psidium guajava en av de mest brukte plantene for å behandle diaré i verden. Ulike farmakologiske og kliniske tester har allerede vist sin sikkerhet, noe som gjør det til en god antidiarrheal kandidat til å studere21,22. Imidlertid er de største begrensningene til urtemedisiner mangelen på effektivitet og sikkerhetsvurdering, samt mangel på sikker og fullstendig informasjon om sammensetningen av planteekstrakter som brukes23. For å validere effektiviteten og sikkerheten til urtelegemidler er det nødvendig med en systematisk tilnærming som involverer eksperimentell og klinisk validering, og tilnærmingen bør støttes av nok data fra in vivo- og in vitro-studier.
For å evaluere tradisjonelle rettsmidler for deres effekt i behandlingen av diaré, har bruken av mus og rotter vært dominerende de siste tiårene24,25. På grunn av de viktigste fordelene nevnt tidligere, dvs. brukervennlighet, rimelig, replikerbar, konservert absorberende og fordøyelsesfunksjoner mellom fluer og pattedyr, foreslår vi å bruke D. melanogaster som en modell for å evaluere plantens antidiarrheal aktivitet. Den diaréfenotypen i D. melanogaster kan karakteriseres av flere funksjoner, inkludert økt overflod av fekale avsetninger, større innskuddsstørrelser, en lysere farge (mindre konsentrert) og høyere fekalmateriale26. Denne fenotypen kan kvantifiseres ved hjelp av forskjellige parametere: antall fekale avsetninger, totalt areal av avleiringer, gjennomsnittlig lyshet og total integrert optisk tetthet (IOD). Total IOD er definert som det totale fargeinnholdet i forekomsten, noe som betyr at det totale fekale materialet utskilles27. Tidligere har en analyse blitt utviklet for å analysere fekale forekomster av D. melanogaster27,28. I denne analysen ble den ultimate leseren av møkk (T.U.R.D.) brukt som et fekalanalyseverktøy, som gjør det mulig å sjekke antall, størrelse og lyshet av fekale forekomster og dermed overvåke tarmfysiologien til fruktfluene. Denne metoden ble imidlertid aldri brukt for å evaluere diaréfenotypen hos fluer. Ion Transport Peptide (ITP) -genet er en viktig endokrin regulator av tørst og utskillelse og kombinerer vannhomeostase med fôring i D. melanogaster. I en nylig studie ble det vist at hastigheten på mattransitt gjennom GI-kanalen og hyppigheten av avføringshendelser ble redusert av ITP-overuttrykk og økt ved ITP-knockdown. Sistnevnte fenotype ble beskrevet som diaréaktig av forfatterne av denne studien29.
I denne protokollen brukes en modifisert versjon av fekalinnskuddsanalysen for å vurdere effekten av et antidiarrheal middel (dvs. guavabladekstrakt) på mage-tarmkanalen til D. melanogaster ved å bruke ITPi-stammen som en diarémodell. Det overordnede målet med denne metoden er: 1) å gi en enkel og pålitelig metode for å evaluere antidiarrheal effekten av narkotika og planteekstrakter, og 2) å tillate oppdagelsen av bioaktive forbindelser som er ansvarlige for antidiarrheal effekten i planteekstrakter ved å anvende en bioaktivitetsstyrt tilnærming.
Protocol
1. Forbereder planteekstrakt
- Samle Psidium guajava L. blader30 fra et voksent tre og behandle som følger: tørk bladene i en ovn ved 40 ° C i 6 dager, lufttørk deretter i 6 dager, tørk deretter igjen i ovnen ved 40 ° C i 4 dager, og til slutt tilbered bladpulver ved å male de tørre bladene i en slipemølle eller en kaffekvern.
- Macerer 100 g tørket pulver i 1 l 96% etanol i 24 timer, med kontinuerlig omrøring med en shaker. Utsett planterestene for den samme prosessen en gang til og fordamp de resulterende filtratene til tørrhet ved hjelp av en vakuumroterende fordamper under redusert trykk (175 mbar) ved 40 °C.
- Løs opp planteekstraktet i etanol for å oppnå ønsket konsentrasjon. Bestem den optimale konsentrasjonen (ved hjelp av protokollen beskrevet her) ved å teste en rekke konsentrasjoner.
- For planteekstrakter, test et konsentrasjonsområde på 100 μg / ml, 1 mg / ml, 10 mg / ml, 100 mg / ml og bruk de som ikke påvirker overlevelsesgraden av fly. For rene forbindelser, test følgende konsentrasjonsområde: 0,05, 0,5, 5 og 50 mM12.
2. Forbereder matmedium
- Mål 100 ml destillert vann og hell i begeret med 4 g sukker og 0,8 g agar (se materialtabell). Varm opp til 100 °C (under omrøring) og hold i 10 min.
- Senk temperaturen til 80 °C, tilsett 7,4 g mel og 2,8 g gjær under omrøring. Varm opp i minst 20 min, rør fortsatt og kontroller temperaturen som skal være rundt 80 °C.
- Tilsett moldex-propionsyreoppløsningen (1 ml moldex og 0,3 g propionsyre blandes godt). Vent til temperaturen synker til rundt 50 °C, tilsett planteekstraktløsningen (1 mg/ml) og 0,5 g bromfenolblått pulver.
MERK: Se pkt. 1.3.1 for mer informasjon om de andre konsentrasjonene som skal testes. - Hell maten i petriskålene og stopp når petriskålen er full (figur 1A). La petriskålene avkjøles til romtemperatur (ca. 3 timer), lukk deretter lokket og oppbevar i kjøleskap ved 4 °C.
MERK: Petri-retter skal oppbevares i kjøleskapet i ikke mer enn 2 uker for å unngå vannfordampning.
Figur 1: Demonstrasjon av eksperimentell prosess for fekal innskuddstest. (A) Bilde som viser petriskåler fulle av matmedium. Sørg for å ha nok mat i petriskålen, slik at ingen hull vil fange fluene og hindre dem i å bevege seg. Ikke overbelast petriskålen med mat slik at overflaten kan dekkes jevnt. (B) Bilde av slikkepotten som beskrevet i protokollen. (C) Bilde av avføringstesten som beskrevet i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Forbereder fluer
- Forbered CO2 -tankene, CO2 -blåspistolen med nåler, fluepute, pensel og mikroskop. Flystasjonen leverer CO2 til både flueputen og blåsekanonen. Flueputen brukes til sortering av fluer, mens CO2 -blåspistolen brukes til å bedøve fluer i hetteglass, flasker og petriskåler.
- Standardiser alderen på fluene ved å velge hetteglass som inneholder pupper (minst 10) og kast de voksne fluene fra røret ved hjelp av følgende metode. Snu hetteglassene opp ned én etter én og stikk nålen inn mellom bomullspluggen og sideveggen på hetteglasset. Bedøv voksne fluer med CO2 blåspistolen til alle fluer sover på bomullspluggen (noen sekunder er nødvendig for å bedøve dem, og bedøvelsesvirkningen varer i noen sekunder etter at du har sluppet blåspistolen). Åpne hetteglasset over en glassflaske som inneholder 70% etanol og slipp fluene inn i den. Lukk hetteglasset med bomullspluggen og oppbevar det i en inkubator ved 25 °C med 60 % fuktighet. Sett lyssyklusen til inkubatoren til 12 timers lys / 12 h mørk.
- Etter inkubering (maksimalt 8 timer), sorter dem i jomfruhunner og hanner under mikroskopet og fluepute ved å snu dem på ryggen og se på kjønnsorganene deres.
- Kvinnelige kjønnsorganer er bleke sammenlignet med mannlige kjønnsorganer, som er av rødaktig farge. Hanner kan også identifiseres ved tilstedeværelse av mørke børster, kalt kjønnskammer, på deres fremre par ben. Del fluene i to ferske tuber (en for hanner og en for hunner) og rug dem i 6-8 dager ved 25 °C.
MERK: Ved 25 °C forblir hunnene jomfruelige i ca. 8 timer etter klekking.
- Kvinnelige kjønnsorganer er bleke sammenlignet med mannlige kjønnsorganer, som er av rødaktig farge. Hanner kan også identifiseres ved tilstedeværelse av mørke børster, kalt kjønnskammer, på deres fremre par ben. Del fluene i to ferske tuber (en for hanner og en for hunner) og rug dem i 6-8 dager ved 25 °C.
4. Fekal innskuddstest
- Merk petriskålene med tilhørende belastning, sex og stoff for å unngå forvirring mellom petriskålene. Stable petriskålene oppå hverandre.
- Få petriskålene som inneholder den fargede maten og reverser dem på blottpapiret for å absorbere den ekstra væsken. Bruk en slikkepott (figur 1B) til å skjære maten i 12 like deler og bruk deretter slikkepotten til å legge en skive i en tom petriskål.
MERK: Avhengig av antall replikater, kan antall skiver som skal kuttes økes opp til 20 per petriskål. Hver skive skal være av samme størrelse. - Bedøv fluene med CO2 til alle fluene sover på bomullspluggen. Overfør seks friske fluer i hver petriskål (figur 1C), lukk lokket umiddelbart, og legg dem deretter i inkubatoren (25 °C, 60 % luftfuktighet, 12 timer lys / 12 timer mørkt).
- For å sikre at fluene ikke rømmer fra petriskålen under forsøket, fest topp- og bunndekslene på petriskålen med et tape. For hver testgruppe, tilbered seks replikere petriskåler (minst).
- Etter å ha latt fluene heve i 24 timer, bruk CO2 til å bedøve dem, overfør fluene til en beholder fylt med 70% etanol og kast bort gjenværende mat.
- Behold petriskålene og fortsett til trinn 5.
5. Kvantifisering av petriskåler
- Angi en mappe på datamaskinen og gi den nytt navn, ved å inkludere navnet på eksperimentstammen, fluenes kjønn og typen narkotika som brukes. I denne mappen lager du undermapper kalt Original, Klipp ut og Analyse.
- Skann petriskålene ved hjelp av en skanner med høy oppløsning med en optisk oppløsning på 6 400 piksler per tomme (ppi). Skann topp- og bunndekslene på hver petriskål separat ved å plassere dem enkeltvis midt i skannerfeltet.
- Åpne programmet som er installert på datamaskinen. Et velkomstvindu åpnes på dataskjermen med alle de generelle innstillingene (figur 2A).
MERK: Ikke endre de avanserte innstillingene. Dette trinnet er bare gyldig for brukere som har den samme skanneren som foreslått i materialfortegnelsen. Se retningslinjene hvis du bruker en annen programvare.- Navngi petriskålen i applikasjonen, ved å inkludere sekvensnummer, topp- eller bunndeksel, kjønn og type mat som brukes. Velg originalsettet for undermappen i trinn 5.1.
- Forhåndsvis petriskålen. Klikk på Forhåndsvisning nederst i vinduet, vent noen sekunder til skanneren forhåndsskanner, så vises et vindu på dataskjermen. Flytt firkanten som vises på skjermen for å omgi petriskålen.
- Klikk på Skann nederst til høyre i vinduet på dataskjermen, skanningen lagres automatisk som et bilde i mappen du ønsker.
- Beskjær bildet ved hjelp av et program (f.eks. Fiji-programmet med åpen kildekode), slik at ingen gjenstander og matrester betraktes som avleiringer.
MERK: Følgende trinn er bare gyldige for brukere som har Fiji-programmet. Se retningslinjene hvis du bruker en annen programvare.- Åpne Fiji-applikasjonen, vent noen sekunder til en verktøylinje vises på skjermen.
- Dra bildet som skal beskjæres, til verktøylinjen. Velg det tredje ikonet Polygon-valg i verktøylinjen, beskjær den uønskede delen av bildet (det fargede sektordiagrammet) ved å klikke på skjermen for å markere en vinkel rundt kakediagrammet (figur 2B-1,2).
MERK: Når du avgrenser beskjæringsområdet i et bilde, er det viktig at de valgte rammene er sømløst koblet fra ende til ende. - Klikk på Rediger øverst til venstre på linjen og deretter på Fyll / Fjern utenfor (figur 2B-3).
- For å lagre bildet, klikk på Fil øverst til venstre på linjen, deretter på Lagre som, og til slutt på Tiff. Velg undermappen Klipp ut sett i trinn 5.1.
MERK: Når du lagrer det beskårne bildet, må du kontrollere at det ikke finnes spesialtegn (f.eks. !, &, $, #, _,-,...) eller for mange tegn i filnavnet.
Figur 2: Viktige trinn i prosessen med å analysere dataene fra fekal innskuddstest. (A) Skjermbilde som viser innstillingsinformasjonen til skanneprogrammet. (B) Bilder beskåret ved hjelp av Fiji-programmet. Pass på at ingen gjenstander og matrester regnes som deponier. (C) Skjermbilde som viser hvordan det ser ut når du åpner Excel_merge-v4-applikasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Fekal innskudd identifikasjon ved hjelp av den ultimate leseren av møkk åpen kildekode-programvare
MERK: Introduksjonen og bruken av den ultimate leseren av møkkprogramvare finner du i tilleggsfil 1.
- Først åpner du T.U.R.D.-programvaren (tilleggsfigur 1). Opprett et nytt eksperiment og gi dokumentet et navn, og lagre det deretter i analysesettet i undermappen Analyse i trinn 5.1.
- Klikk på Plater og deretter på Legg til plate. Velg petriskålen som skal behandles. Et nytt vindu vises med navnene på de valgte platene og nye parametere. Angi blokkstørrelse, forskyvning, minstørrelse og maksimal størrelse (tilleggsfigur 2).
- For å bekrefte at de påviste fekalavleiringene er de riktige, klikker du på Plater, deretter Inspiser valgte plater, deretter Grafikk og Vis kommenterte bilder (tilleggsfigur 3). Zoom inn og se på tellingene. Hvis det bare er noen få innskudd som ikke bør inkluderes i analysen, velger du bort innskuddene som skal holdes utenfor (tilleggsfigur 4).
- For hvert nytt bilde som skal behandles, starter du på nytt fra trinn 6.3.
- Etter å ha analysert platene med T.U.R.D.-programvaren, endrer du antall fluer ved å klikke på Nei. Fluer (tilleggsfigur 5).
- Endre gruppenavnet ved å klikke på Plater > Rediger grupper > Legg til, og velg deretter gruppenavnet i Gruppe-kolonnen .
- Eksporter de forskjellige replikasjonsdataene separat ved å klikke på Analyser > Beskrivende statistikk > Velg gruppe (tilleggsfigur 6). Oppbevar alle regnearkfiler (.csv) i samme mappe.
- For å samle alle filer (oppnådd i trinn 6.7) i et unikt regneark, åpne programmet Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), vent til følgende setning vises Velg banen til mappen (med .csv filer):, og lim deretter inn mappeadressen ovenfor. Banen kan for eksempel være C:\Eksperiment\Fekal innskuddstest\, og deretter klikke på Enter to ganger på tastaturet (figur 2C). Deretter opprettes en ny regnearkfil i samme mappe. Den nye regnearkfilen inneholder alle de eksporterte filene i forskjellige ark.
- I den forrige regnearkfilen legger du til et nytt ark for å samle gjennomsnittet av hver parameter for alle replikater (bruk VLOOKUP-funksjonen for å behandle dataene). Et eksempel er gitt i tilleggstabell 1.
- Analyser p-verdien.
Representative Results
Studien som presenteres her viser at måling av diaré i D. melanogaster kan oppnås ved bruk av fekalinnskuddsanalysen. Signifikante forskjeller mellom fenotypene (diaré eller ikke) kan bestemmes ved å analysere forskjellige parametere, inkludert antall fekale avsetninger, det totale arealet av avleiringer, gjennomsnittlig areal av avleiringer, gjennomsnittlig lyshet og total integrert optisk tetthet (IOD), som er et mål på den totale mengden fargestoff som er tilstede i innskuddet og representerer det totale fekale materialinnholdet som utskilles27.
ITP-genet knockdown i fluer kan indusere en diaréfenotype, preget av økt frekvens av avføring, noe som gjør dem til en egnet modell for å studere diaré29. I sammenheng med dette eksperimentet ble ITPi-stammen (w1118; datterløs-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) ansatt og oppdrettet på et standardmedium. Psidium guajava blader ekstrakt ble valgt som antidiarrheal intervensjon, gitt den utbredte bruken av denne planten i tropiske områder for å håndtere diaré. Crofelemer, et antidiarrheal middel, ble godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for å gi symptomatisk lindring for ikke-smittsom diaré hos voksne pasienter med HIV / AIDS som gjennomgår antiretroviral behandling31. Crofelemer er et ekstrakt fra latex av Croton lechleri Müll.Arg. stammebark32. Loperamid er et syntetisk stoff som brukes over hele verden for å behandle diaré33. Både Crofelemer og Loperamid ble brukt som potensielle positive kontroller.
Hypotesen var at fôring av fluer med P. guajava-ekstrakt , Crofelemer og Loperamid ville redusere diaréfenotypen sammenlignet med de som ble matet med vanlig mat. For å undersøke denne hypotesen ble det utført en måling av fekale forekomster i D. melanogaster ved å sammenligne flere parametere mellom fluer matet med vanlig mat og de som ble matet med P. guajava-ekstrakt (1 g / 100 ml), Crofelemer (1 g / 100 ml ) og loperamid (10 mM). For forsøksoppsettet ble 6-7 dager gamle jomfruhunner eller hanner brukt. Hver petriskål inneholdt seks fluer, og seks replikater ble utført. Fluene ble oppdrettet i 24 timer, og deretter ble hver gruppe analysert. Studentens t-test ble brukt for å sammenligne den signifikante forskjellen mellom testgruppen. Resultatene viser at antall fekale avsetninger (figur 3A), det totale arealet av innskudd (figur 3B) og total IOD (figur 3C) viste signifikant høyere verdier i den normale matvaregruppen sammenlignet med P. guajava-ekstraktgruppen (1 g / 100 ml), både hos jomfruhunner og hanner. Dessverre viste loperamid ingen effekt hos begge kjønn (men det var allerede påvist at det virker som et krampeløsende middel i D. melanogaster)34 mens Crofelemer kun hadde effekt på kvinner.
Figur 3: ITPi-belastningsanalyse . ITPi-stammen ble analysert under fire forhold: fôring på vanlig mat, mat supplert med 1 g / 100 ml P. guajava-ekstrakt , 1 g / 100 ml Crofelemer og 10 mM loperamid. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD for hver tilstand hos både kvinner og menn (for seks replikater av to sider av en petriskål). Statistisk analyse ble utført med studentens t-test som sammenlignet to grupper. p-verdier vises som følger: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Antall fekale forekomster av ITPi-stamme ble sammenlignet hos fluer fôret med mat tilsatt 1 g/100 ml Crofelemer, 10 mM Loperamid, 1 g/100 ml P. guajava ekstrakt og hos fluer matet med vanlig mat. I tillegg ble forskjellen i antall fekale innskudd mellom jomfruhunner og menn også analysert. I begge gruppene var antall fekale avleiringer signifikant høyere hos fluer fôret med vanlig mat enn de som ble fôret med 1 g/100 ml P. guajava-ekstrakt . (B) Totalt areal av fekale avleiringer av ITPi-stammen ble sammenlignet hos fluer fôret med vanlig mat og hos fluer fôret med mat tilsatt 1 g/100 ml P. guajava-ekstrakt , 1 g/100 ml Crofelemer og 10 mM loperamid. Hos menn og kvinner var det totale arealet av fekale forekomster signifikant høyere hos fluer matet med vanlig mat enn de som ble matet med 1 g / 100 ml P. guajava-ekstrakt . (C) Forskjellen i total IOD av ITPi-stammen ble analysert mellom fluer fôret på vanlig mat og fluer fôret med mat tilsatt 1 g / 100 ml P. guajava ekstrakt, 1 g / 100 ml Crofelemer og 10 mM Loperamid. Hos hanner og hunner var den totale IOD signifikant høyere hos fluer fôret med vanlig mat enn de som ble fôret med 1 g/100 ml P. guajava-ekstrakt . Forkortelser: F = Kvinne; M = Mann; Crofe = Crofelemer; lope = loperamid; Heller ikke mat = Vanlig mat; P. gua ext = Psidium guajava ekstrakt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å demonstrere at den reduserte utskillelsen observert i P. guajava-ekstraktgruppen skyldes ekstraktets hemmende effekt og ikke redusert matforbruk, utførte vi direkte inntaksestimering og sporing av fast matforbruk (DIETS) metode35. Resultatene viste at det ikke var signifikante forskjeller i matforbruk mellom de medikamentelle gruppene og de uten legemidler, bortsett fra Loperamid hos menn, noe som førte til at fluer spiste mindre mat enn normalt (figur 4).
Figur 4: Fôringsanalyse. Fôringsanalysen målte fast matforbruk i fluer. Fluene ble fôret med fire forskjellige medier: 1 g/100 ml P. guajava-ekstrakt , 1 g/100 ml Crofelemer, 10 mM loperamid og vanlig mat. Hver gruppe besto av 20 fluer med fem replikater. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for hver tilstand hos både kvinner og menn. Statistisk analyse ble utført med studentens t-test som sammenlignet to grupper. p-verdier vises som følger: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fekale forekomster og fôringsanalyseresultatene viste at P. guajava-ekstrakt er en pålitelig medisinsk plante for å behandle diaré hos fruktfluer.
Tilleggsfigur 1:T.U.R.D. åpningsvindu. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: T.UR.D.-vindu med innstillinger som skal justeres. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: T.U.R.D.-vindu med et kommentert bilde. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 4: T.U.R.D.-vindu som viser hvert oppdaget punkt fra et bilde som allerede er behandlet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 5: T.U.R.D.-vindu som viser hvert behandlede bilde. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 6: T.U.R.D.-vindu som viser prosessen for å eksportere dataene for hver gruppe. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Hurtigveiledning for bruk av T.U.R.D.-programvaren. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 1: Eksempel på de endelige regnearkene klare for analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 1: Søknad om sammenslåing av regneark. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
D. melanogaster har blitt allment akseptert som en modell for ulike biologiske prosesser på grunn av likheten i gener mellom D. melanogaster og mennesker36. Bruken av D. melanogaster som en modell for å studere tarmkanalen er utbredt, og anvendelsen av T.U.R.D. har blitt brukt til å estimere antall, areal og mengde fekale avsetninger. Den fenotypiske deteksjonsmetoden har imidlertid ikke blitt brukt til å vurdere diaré hos bananfluer. Derfor introduserer denne protokollen en ny metode for å grovt vurdere tilstedeværelsen av diaré ved å oppdage fekale forekomster.
Fekale innskudd er en viktig indikator på tarmkanalens funksjon og helse37. I denne sammenheng foreslås en metode for oppdrett av D. melanogaster på legemiddelholdig medium for å undersøke ulike parametere av fekale forekomster. Ved å overvåke antall innskudd, er det mulig å bestemme hyppigheten av avføring og vurdere om et stoff har noen innvirkning på tarmtransittrasjonen. Det totale arealet av innskuddene kan måles for å evaluere konsentrasjonen og fortynningen av avføring, noe som er en viktig faktor for å bestemme den generelle helsen til tarmkanalen. I tillegg kan den totale integrerte optiske tettheten (IOD) brukes til å oppdage den totale mengden fecal materiale som er tilstede i innskuddene. Denne protokollen gir en effektiv metode for å screene og evaluere medisiner samt planteekstrakter som påvirker tarmkanalen. Når D. melanogaster brukes som en modellorganisme, er det mulig å vurdere effekten av potensielle stoffer, noe som kan bidra til å akselerere stoffoppdagelsesprosessen. Ved å bruke denne metoden på planteekstrakter, kan forskere bidra til å validere bruken som antidiarrheal agenter.
Det er flere kritiske skritt å vurdere når du bruker denne protokollen til å studere fekale forekomster i D. melanogaster. For det første er det viktig å beregne massen som kreves for å oppnå ønsket konsentrasjon av legemidlet i mediet. Videre er det viktig å sikre god forberedelsestilstand når stoffet tilsettes til mediet, da høye temperaturer kan forringe stoffet og påvirke dets styrke. For det andre er utvelgelsen av hunnfluer viktig i denne protokollen. Det er viktig å bruke jomfruelige hunnfluer for å unngå forskjellene i avføring mellom jomfruelige og parrede hunner. For eksempel er flekkene produsert av jomfruhunner mer sirkulære enn parrede hunner, og parrede hunner har en tendens til å skille ut mer fekalt materiale enn jomfruhunner27,28. Derfor anbefales det å samle fluer før 8 timer med eclosion for å sikre at alle hunner som samles inn er jomfruer. I tillegg bør de testede fluene være sterke og sunne, da helsen deres kan påvirke matinntaket og fekal produksjon. For eksempel kan fluer som har en anormal form av vinger ha problemer med å få maten. Til slutt, for å bruke T.U.R.D. vellykket, er innstillingene for blokkstørrelse (piksler) og offset avgjørende. På grunn av forskjellen i lyskontrasten til bildene, kan det være nødvendig å prøve forskjellige innstillinger for å oppnå best mulig identifisering av fekale forekomster.
Selv om metoden som presenteres er effektiv, er det flere begrensninger. Den ene er nøyaktigheten av legemiddelkonsentrasjonen i mediet. Da mediet oppvarmes under tilberedningen, kan noe vann fordampe, noe som kan påvirke konsentrasjonen av legemidlet. En annen begrensning er skanningen av petriskålene. Noen deler av petriskålene (dvs. kanter) skannes ikke, og dette kan føre til en feilberegning av de totale fekale avsetningene. I tillegg produserer fluene ikke samme mengde fekale forekomster på topp- og bunndekslene på petriskålene. Fordi de har en tendens til å produsere flere innskudd på bunndekselet, kan standardavviket til analysen mellom topp- og bunndekselet være høyt, noe som kan påvirke nøyaktigheten av resultatene.
Ved hjelp av denne protokollen kan forskere studere diaré i D. melanogaster. Ved å modifisere det stoffholdige mediet, kan denne metoden brukes til å skjerme antidiarrheal planter, noe som gir en ny tilnærming til narkotikaforskning. Tradisjonell medisin og naturlige produkter har blitt brukt i århundrer for å behandle ulike sykdommer, inkludert gastrointestinale sykdommer. Ved å bruke denne protokollen for å evaluere effekten av planteekstrakter på fekale forekomster, kan potensielle nye behandlinger for tarmlidelser identifiseres og en vitenskapelig begrunnelse for deres bruk som antidiarrheal midler kan gis. Denne tilnærmingen kan gi et verdifullt bidrag til feltet narkotikaforskning og etnofarmakologi.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Martina Gáliková for å gi oss Drosophila-stammene . Vi er takknemlige for Michelle Crozatier-Borde og Marc Haenlin-teamet for å gi tilbakemelding på studien vår og hjelpe oss med å forbedre modellen vår. Vi takker Napo Pharmaceuticals Company for å ha gitt oss stoffet Crofelemer. Forfatterne er også takknemlige til gjesteredaktør Dr. Hugues Petitjean for å gi oss muligheten til å publisere denne protokollen. Denne studien ble finansiert av Agence Nationale de la Recherche (ANR) under prosjektet ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
- Cheng, L. K., et al.
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D.
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H.
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A.
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
