Summary
Her beskrives en metode til at fodre Drosophila melanogaster med lægemidler og planteekstrakter og vurdere deres virkning på mave-tarmkanalen ved at analysere frugtfluernes fækale aflejringer. De lægemiddelbehandlede fluer kan bruges som model for videre forskning.
Abstract
For at studere human gastrointestinal fysiologi har biomedicinske forskere påberåbt sig brugen af modelorganismer. Selvom mange forskere har brugt mus som model til at studere tarmfunktionen, har kun få rapporter fokuseret på Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Sammenlignet med mus har bananfluer mange fordele, såsom en kort livscyklus, omkostningseffektiv og enkel vedligeholdelse og ingen etiske problemer. Desuden er pattedyrs gastrointestinale fysiologi, anatomi og signalveje stærkt bevaret i D. melanogaster. Planteekstrakter er traditionelt blevet brugt til behandling af diarré og forstoppelse. For eksempel er Psidium guajava (P. guajava) et af de mest kendte antidiarrheal midler i troperne. Imidlertid har ingen undersøgelser evalueret effekten af antidiarrheal og afføringsmidler og planteekstrakter i D. melanogaster, og det er fortsat ukendt, om lignende virkninger (fx mindre, mere koncentrerede og mindre rigelige fækale aflejringer i tilfælde af antidiarrheal medicin) kan forekomme i bananfluerne sammenlignet med pattedyr. I denne undersøgelse, en antidiarrheal effekt induceret af P. guajava er demonstreret i en D. melanogaster stamme, der præsenterer en diarrheic fænotype. Fækal prøveudtagning produceret af fluer overvåges ved hjælp af en farvestof-suppleret mad. Denne protokol skitserer den metode, der anvendes til tilberedning af mad med lægemidler, evaluering af fækale aflejringer af fluer fodret med disse tilberedninger og fortolkning af de opnåede data.
Introduction
Mave-tarmkanalen (GI), også kaldet fordøjelseskanalen, er ansvarlig for fordøjelsen og absorptionen af næringsstoffer og udskillelse af ufordøjede produkter1. GI-kanalen er sårbar over for en række lidelser, der kan forårsage ubehag, smerte og forstyrrelse i det daglige liv. Gastrointestinale lidelser omfatter mavesmerter og ubehag, oppustethed, halsbrand, fordøjelsesbesvær eller dyspepsi, kvalme, opkastning, diarré og forstoppelse2. Diarré er det mest almindelige symptom på GI lidelse3, og det er defineret som en sygdom med mindst tre løs og vandig afføring i løbet af en 24 timers periode4. Diarré er forårsaget af en lang række patogener, herunder bakterier, vira, parasitter, svampe og kan også være forårsaget af lægemidler 5,6. På verdensplan er diarré fortsat den næststørste årsag til dødelighed blandt børn under 5 år7. Selvom diarré kan løse sig selv, kan det også indikere en mere alvorlig underliggende tilstand, hvis den varer i mere end et par dage.
For at studere tarmkanalen henvender forskere sig til dyremodeller som mus, rotter og svin 8,9. Brugen af disse dyr kan dog være dyrt og tidskrævende, fordi de kræver specialiserede faciliteter og etiske overvejelser. Nylige undersøgelser har vist, at D. melanogaster kan bruges som model til at studere mave-tarmkanalen og undersøge nogle mekanismer såsom vedligeholdelse af regenerativ homeostase, udvikling af immunældning, tab af epitelbarrierefunktion og faldet i metabolisk homeostase10,11. D. melanogaster, kendt som frugtfluen, deler en høj grad af genetisk homologi med mennesker; Ca. 75% af humane sygdomsgener menes at have en funktionel homolog i Fly12. De har også et simpelt fordøjelsessystem bestående af en forgut, en midgut og en bagtarm13. D. melanogaster er let at dyrke i laboratoriet og kan genetisk modificeres på forskellige måder14. Derfor er brug af D. melanogaster til in vivo-test et kraftfuldt værktøj, der giver forskere mulighed for at studere komplekse biologiske processer i kontrollerede omgivelser.
Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) bruger omkring 80% af de mennesker, der bor i udviklingslande, traditionel medicin til deres primære sundhedsbehov15. Den høje brug af lægeplanter kan forklares ved, at de er let tilgængelige, billige og har få bivirkninger16. De vigtigste plantedele, der anvendes i urteterapi, omfatter blade, bark, rødder, frø17, mens de vigtigste fremstillingsmetoder er infusion, afkogning og maceration18. Disse naturlægemidler indeholder fytokemiske stoffer såsom alkaloider, terpenoider, flavonoider, steroider, tanniner og kulhydrater19, som har terapeutiske virkninger på menneskekroppen. Folk bruger en række medicinske planter til behandling af GI-lidelser som diarré, mavepine og dysenteri20. For eksempel er Psidium guajava en af de mest almindeligt anvendte planter til behandling af diarré i verden. Forskellige farmakologiske og kliniske tests har allerede vist dets sikkerhed, hvilket gør det til en god antidiarrheal kandidat til at studere21,22. De største begrænsninger ved plantelægemidler er imidlertid manglen på effektivitets- og sikkerhedsvurdering samt manglen på konkrete og fuldstændige oplysninger om sammensætningen af de anvendte planteekstrakter23. For at validere plantelægemidlers effektivitet og sikkerhed er der behov for en systematisk tilgang med eksperimentel og klinisk validering, og tilgangen bør understøttes af tilstrækkelige data fra in vivo- og in vitro-undersøgelser.
For at evaluere traditionelle midler til deres effektivitet i behandlingen af diarré har brugen af mus og rotter været fremherskende i de seneste årtier24,25. På grund af de tidligere nævnte vigtigste fordele, dvs. brugervenlighed, overkommelige, replikerbare, bevarede absorberende og fordøjelsesfunktioner mellem fluer og pattedyr, foreslår vi at anvende D. melanogaster som model til evaluering af planters antidiarrheale aktivitet. Den diarrheiske fænotype i D. melanogaster kan karakteriseres af flere funktioner, herunder øget overflod af fækale aflejringer, større aflejringsstørrelser, en lysere farve (mindre koncentreret) og højere fækal materiale26. Denne fænotype kan kvantificeres ved hjælp af forskellige parametre: antal fækale aflejringer, samlet areal af aflejringer, gennemsnitlig lethed og total integreret optisk tæthed (IOD). Total IOD defineres som det samlede farveindhold i aflejringen, hvilket betyder det samlede fækale materiale udskilt27. Tidligere er der udviklet et assay til analyse af fækale aflejringer af D. melanogaster27,28. I dette assay blev den ultimative læser af gødning (T.U.R.D.) brugt som et fækal analyseværktøj, som gør det muligt at kontrollere antallet, størrelsen og letheden af fækale aflejringer og dermed overvåge bananfluernes tarmfysiologi. Denne metode blev imidlertid aldrig anvendt til at evaluere den diarrheiske fænotype hos fluer. Ion Transport Peptide (ITP) genet er en vigtig endokrin regulator af tørst og udskillelse og kombinerer vand homeostase med fodring i D. melanogaster. I en nylig undersøgelse blev det vist, at hastigheden af fødevaretransit gennem mave-tarmkanalen og hyppigheden af afføringshændelser blev reduceret af ITP-overekspression og øget ved ITP-knockdown. Sidstnævnte fænotype blev beskrevet som diarrheisk af forfatterne af denne undersøgelse29.
I denne protokol, en modificeret version af fækal depositum assay anvendes til at vurdere virkningen af en antidiarrheal agent (dvs, guava blade ekstrakt) på mave-tarmkanalen af D. melanogaster ved hjælp af ITPi stamme som en diarrheic model. Det overordnede mål med denne metode er: 1) at give en nem og pålidelig metode til at evaluere antidiarrheal effekt af lægemidler og planteekstrakter, og 2) at tillade opdagelsen af bioaktive forbindelser, der er ansvarlige for antidiarrheal effekt i planteekstrakter ved at anvende en bioaktivitetsstyret tilgang.
Protocol
1. Forberedelse af planteekstrakt
- Saml Psidium guajava L. blade30 fra et voksen træ og behandle som følger: tør bladene i en ovn ved 40 ° C i 6 dage, lufttør derefter i 6 dage, tør derefter igen i ovnen ved 40 ° C i 4 dage, og tilbered til sidst bladpulver ved at male de tørre blade i en slibemølle eller en kaffekværn.
- Macerat 100 g af det tørrede pulver i 1 liter 96% ethanol i 24 timer under kontinuerlig omrøring ved hjælp af en ryster. Udsæt planteresten for samme proces endnu en gang, og de resulterende filtrater inddampes til tørhed ved hjælp af en vakuumrotationsfordamper under reduceret tryk (175 mbar) ved 40 °C.
- Planteekstraktet opløses i ethanol for at opnå den ønskede koncentration. Bestem den optimale koncentration (ved hjælp af protokollen beskrevet her) ved at teste en række koncentrationer.
- For planteekstrakter testes et koncentrationsområde på 100 μg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 100 mg/ml, og der anvendes dem, der ikke påvirker fluens overlevelsesrate. For rene forbindelser testes følgende koncentrationsområde: 0,05, 0,5, 5 og 50 mM12.
2. Tilberedning af fødevaremedium
- Afmål 100 ml destilleret vand og hæld i bægerglasset med 4 g sukker og 0,8 g agar (se materialetabel). Opvarm til 100 °C (under omrøring) og hold den i 10 min.
- Sænk temperaturen til 80 °C, tilsæt 7,4 g mel og 2,8 g gær under omrøring. Der opvarmes i mindst 20 minutter, stadig under omrøring og kontrol af temperaturen, som skal være omkring 80 °C.
- Tilsæt moldex-propionsyreopløsningen (1 ml moldex og 0,3 g propionsyreblanding godt). Vent til temperaturen falder til omkring 50 °C, tilsæt planteekstraktopløsningen (1 mg/ml) og 0,5 g bromphenolblåt pulver.
BEMÆRK: Se afsnit 1.3.1 for yderligere oplysninger om de øvrige koncentrationer, der skal testes. - Hæld maden i petriskålene og stop, når petriskålen er fuld (figur 1A). Lad petriskålene afkøle til stuetemperatur (ca. 3 timer), luk derefter låget, og opbevar dem i køleskab ved 4 °C.
BEMÆRK: Petriskåle bør opbevares i køleskabet i højst 2 uger for at undgå vandfordampning.
Figur 1: Demonstration af forsøgsprocessen for fækal aflejringstest. (A) Billede, der viser petriskåle fulde af fødevaremedium. Sørg for at have nok mad i petriskålen, så ingen huller fanger fluerne og forhindrer dem i at bevæge sig. Overbelast dog ikke petriskålen med mad, så overfladen kan dækkes jævnt. (B) Billede af spatlen som beskrevet i protokollen. (C) Billede af fækal aflejringstest som beskrevet i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Forberedelse af fluer
- Forbered CO2 tanke, CO2 blæsepistol med nåle, fluepud, pensel og mikroskop. Flyvestationen leverer CO2 til både fluepuden og blæsepistolen. Fluepuden bruges til sortering af fluer, mens CO2 blæsepistolen bruges til at bedøve fluer i hætteglas, flasker og petriskåle.
- Standardiser fluernes alder ved at vælge hætteglas, der indeholder pupper (mindst 10), og kassér de voksne fluer fra røret ved hjælp af følgende metode. Vend hætteglassene på hovedet en efter en og sæt kanylen ind mellem bomuldsproppen og hætteglassets sidevæg. Bedøv voksne fluer med CO2 -blæsepistolen, indtil alle fluer sover på bomuldsproppen (et par sekunder er nødvendigt for at bedøve dem, og bedøvelsesvirkningen varer i et par sekunder efter frigivelse af blæsepistolen). Åbn hætteglasset over en glasflaske, der indeholder 70% ethanol, og slip fluerne ned i det. Luk hætteglasset med bomuldsproppen og opbevar det i en inkubator ved 25 °C med 60% fugtighed. Indstil inkubatorens lyscyklus til 12 timers lys / 12 timer mørk.
- Efter inkubation (maks. 8 timer) sorteres de i jomfruelige hunner og hanner under mikroskop og fluepude ved at dreje dem på ryggen og se på deres kønsorganer.
- Kvindelige kønsorganer er blege sammenlignet med mandlige kønsorganer, som er af rødlig farve. Hannerne kan også identificeres ved tilstedeværelsen af mørke børstehår, kaldet sexkamme, på deres forreste par ben. Del fluerne i to friske rør (et til hanner og et til hunner) og udruget i 6-8 dage ved 25 °C.
BEMÆRK: Ved 25 °C forbliver hunnerne jomfruelige i ca. 8 timer efter klækning.
- Kvindelige kønsorganer er blege sammenlignet med mandlige kønsorganer, som er af rødlig farve. Hannerne kan også identificeres ved tilstedeværelsen af mørke børstehår, kaldet sexkamme, på deres forreste par ben. Del fluerne i to friske rør (et til hanner og et til hunner) og udruget i 6-8 dage ved 25 °C.
4. Fækal deponeringstest
- Mærk petriskålene med den tilsvarende stamme, køn og medicin for at undgå forveksling mellem petriskålene. Stak petriskålene oven på hinanden.
- Tag petriskålene, der indeholder den farvede mad, og vend dem på blottingpapiret for at absorbere den ekstra væske. Brug en spatel (figur 1B) til at skære maden i 12 lige store dele og brug derefter spatlen til at lægge en skive i en tom petriskål.
BEMÆRK: Afhængigt af antallet af replikater kan antallet af skiver, der skal skæres, øges op til 20 pr. petriskål. Hver skive skal være af samme størrelse. - Bedøv fluerne med CO2 , indtil alle fluerne sover på bomuldsproppen. Overfør seks sunde fluer i hver petriskål (figur 1C), luk låget med det samme, og læg dem derefter i inkubatoren (25 ° C, 60% fugtighed, 12 timers lys / 12 timer mørk).
- For at sikre, at fluerne ikke slipper ud af petriskålen under eksperimentet, skal du fastgøre petriskålens øverste og nederste dæksel med et bånd. For hver testgruppe skal du forberede seks replikate petriskåle (mindst).
- Efter at have ladet fluerne hæve i 24 timer, skal du bruge CO2 til at bedøve dem, overføre fluerne til en beholder fyldt med 70% ethanol og bortskaffe resterende mad.
- Opbevar petriskålene og fortsæt til trin 5.
5. Kvantificering af petriskåle
- Indstil en mappe på computeren, og omdøb den ved at inkludere eksperimentstammenavnet, fluernes køn og den anvendte type medicin. I denne mappe skal du oprette undermapper med navnene Original, Cut og Analysis.
- Scan petriskålene ved hjælp af en højopløsningsscanner med en optisk opløsning på 6.400 pixel pr. tomme (ppi). Scan top- og bunddækslerne på hver petriskål separat ved at placere dem individuelt midt i scannerfeltet.
- Åbn det program, der er installeret på computeren. Et velkomstvindue åbnes på computerskærmen med alle de generelle indstillinger (figur 2A).
BEMÆRK: Du må ikke ændre de avancerede indstillinger. Dette trin er kun gyldigt for brugere, der har den samme scanner som foreslået i materialetabellen. Se retningslinjerne, hvis du bruger anden software.- Navngiv petriskålen i applikationen ved at inkludere løbenummer, top- eller bunddæksel, køn og anvendt madtype. Vælg den oprindelige undermappe, der blev indstillet i trin 5.1.
- Se et eksempel på petriskålen. Klik på Preview nederst i vinduet, vent et par sekunder på, at scanneren forscanner, så vises et vindue på computerskærmen. Flyt firkanten, der vises på skærmen, for at omgive petriskålen.
- Klik på Scan nederst til højre i vinduet på computerskærmen, scanningen gemmes automatisk som et billede i den valgte mappe.
- Beskær billedet ved hjælp af et program (f.eks. open source-Fiji-applikationen), så ingen artefakter og madrester betragtes som aflejringer.
BEMÆRK: Følgende trin er kun gyldige for brugere, der har Fiji-applikationen. Se retningslinjerne, hvis du bruger anden software.- Åbn Fiji-applikationen, vent et par sekunder, indtil der vises en værktøjslinje på skærmen.
- Træk det billede, der skal beskæres, til værktøjslinjen. Vælg det 3. ikon Polygonvalg i værktøjslinjen, beskær den uønskede del af billedet (det farvede cirkeldiagram) ved at klikke på skærmen for at markere en vinkel omkring cirkeldiagrammet (figur 2B-1,2).
BEMÆRK: Når du afgrænser beskæringsområdet i et billede, er det bydende nødvendigt, at de valgte rammer er problemfrit forbundet ende-til-ende. - Klik på Rediger øverst til venstre på bjælken og derefter på Udfyld / Ryd udenfor (figur 2B-3).
- For at gemme billedet skal du klikke på Filer øverst til venstre på bjælken, derefter på Gem som og til sidst på Tiff. Vælg undermappen Klip sæt i trin 5.1.
BEMÆRK: Når du gemmer det beskårne billede, skal du sørge for, at der ikke findes specialtegn (f.eks. !, &, $, #, _,-,...) eller for mange tegn i filnavnet.
Figur 2: Nøgletrin i processen med at analysere dataene fra fækal deponeringstest. (A) Skærmbillede, der viser indstillingsoplysningerne for scanningsprogrammet. (B) Billeder beskåret ved hjælp af Fiji-applikationen. Sørg for, at ingen artefakter og madrester betragtes som aflejringer. (C) Skærmbillede, der viser, hvordan det ser ud, når du åbner Excel_merge-v4-applikationen. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Identifikation af fækale aflejringer ved hjælp af den ultimative læser af gødning open source-software
BEMÆRK: Introduktionen og brugen af den ultimative læser af gødningssoftware findes i Supplementary File 1.
- Åbn først T.U.R.D.-softwaren (supplerende figur 1). Opret et nyt eksperiment, giv dokumentet et navn, og gem det derefter i undermappen Analysesæt i trin 5.1.
- Klik på Plader og derefter på Tilføj plade. Vælg den petriskål, der skal behandles. Et nyt vindue vises med navnene på de valgte plader og nye parametre. Indstil blokstørrelse, forskydning, min størrelse og maks. størrelse (supplerende figur 2).
- For at kontrollere, at de detekterede fækale aflejringer er de rigtige, skal du klikke på Plader, derefter inspicere valgte plader, derefter Grafik og Se kommenterede billeder (supplerende figur 3). Zoom ind og se på optællingerne. Hvis der kun er nogle få indskud, der ikke bør medtages i analysen, fravælges de indskud, der skal udelukkes (supplerende figur 4).
- For hver ny afbildning, der skal behandles, skal du genstarte fra trin 6.3.
- Efter at have analyseret pladerne med T.U.R.D.-softwaren, skal du ændre antallet af fluer ved at klikke på Nej. Fluer (supplerende figur 5).
- Rediger gruppenavnet ved at klikke på Plader > Rediger grupper > Tilføj, og vælg derefter gruppenavnet i kolonnen Gruppe .
- Eksporter de forskellige replikate data separat ved at klikke på Analysér > Beskrivende statistik > Vælg gruppe (supplerende figur 6). Opbevar alle regnearksfiler (.csv) i den samme mappe.
- For at samle alle filer (opnået i trin 6.7) i et unikt regneark skal du åbne applikationen Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), vent til følgende sætning vises Vælg stien til mappen (med .csv filer):, og indsæt derefter ovenstående mappeadresse. Stien kan f.eks. være C:\Eksperiment\Fækal indbetalingstest\, og klik derefter på Enter to gange på tastaturet (Figur 2C). Derefter oprettes en ny regnearkfil i samme mappe. Den nye regnearksfil indeholder alle de eksporterede filer i forskellige ark.
- I den forrige regnearksfil skal du tilføje et andet ark for at indsamle gennemsnittet af hver parameter for alle replikater (brug funktionen LOPSLAG til behandling af dataene). Et eksempel findes i den supplerende tabel 1.
- Analyser p-værdien.
Representative Results
Undersøgelsen, der præsenteres her, viser, at måling af diarré i D. melanogaster kan opnås ved anvendelse af fækal aflejringsanalyse. Signifikante forskelle mellem fænotyperne (diarrheic eller ej) kan bestemmes ved at analysere forskellige parametre, herunder antallet af fækale aflejringer, det samlede areal af aflejringer, det gennemsnitlige areal af aflejringer, den gennemsnitlige lysstyrke og den samlede integrerede optiske densitet (IOD), som er et mål for den samlede mængde farvestof, der er til stede i aflejringen og repræsenterer det samlede fækale materialeindhold udskilt27.
ITP-genets knockdown i fluer kan fremkalde en diarrheisk fænotype, kendetegnet ved øget hyppighed af afføring, hvilket gør dem til en passende model til at studere diarré29. I forbindelse med dette eksperiment blev ITPi-stammen (w1118; datterløs-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) anvendt og opdrættet på et standardmedium. Psidium guajava blade ekstrakt blev valgt som antidiarrheal intervention, givet den udbredte anvendelse af denne plante i tropiske områder til at håndtere diarré. Crofelemer, et antidiarrheal middel, blev godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) til at give symptomatisk lindring for ikke-infektiøs diarré hos voksne patienter med hiv / aids, der gennemgår antiretroviral behandling31. Crofelemer er et ekstrakt fra latex af Croton lechleri Müll.Arg. stamme bark32. Loperamid er et syntetisk stof, der anvendes over hele verden til behandling af diarré33. Både Crofelemer og Loperamid blev anvendt som potentielle positive kontroller.
Hypotesen var, at fodring af fluer med P. guajava-ekstrakt , Crofelemer og Loperamid ville reducere den diarrheiske fænotype sammenlignet med dem, der blev fodret med normal mad. For at undersøge denne hypotese blev der udført en måling af fækale aflejringer i D. melanogaster ved at sammenligne flere parametre mellem fluer fodret med normal mad og dem, der blev fodret med P. guajava-ekstrakt (1 g / 100 ml), Crofelemer (1 g / 100 ml) og Loperamid (10 mM). Til forsøgsopstillingen blev 6-7 dage gamle jomfruhunner eller hanner brugt. Hver petriskål indeholdt seks fluer, og seks replikater blev udført. Fluerne blev opdrættet i 24 timer, og derefter blev hver gruppe analyseret. Den studerendes t-test blev brugt til at sammenligne den signifikante forskel mellem testgruppen. Resultaterne viser, at antallet af fækale aflejringer (figur 3A), det samlede areal af aflejringer (figur 3B) og den samlede IOD (figur 3C) udviste signifikant højere værdier i den normale fødevaregruppe sammenlignet med P. guajava-ekstraktgruppen (1 g / 100 ml) hos både jomfruhunner og mænd. Desværre viste loperamid ingen effekt hos begge køn (men det blev allerede påvist, at det virker som et antispasmodisk middel hos D. melanogaster)34 , mens Crofelemer kun havde en virkning på kvinder.
Figur 3: ITPi-stammeanalyse . ITPi-stammen blev analyseret under fire betingelser: fodring med normal mad, mad suppleret med 1 g / 100 ml P. guajava-ekstrakt , 1 g / 100 ml Crofelemer og 10 mM Loperamid. Dataene præsenteres som gennemsnitlig SD ± hver tilstand hos både kvinder og mænd (for seks replikater af to sider af en petriskål). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en studerendes t-test, der sammenlignede to grupper. p-værdier vises som følger: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Antallet af fækale aflejringer af ITPi-stammen blev sammenlignet hos fluer fodret med mad suppleret med 1 g/100 ml Crofelemer, 10 mM Loperamid, 1 g/100 ml P. guajava-ekstrakt og hos fluer fodret med normal mad. Derudover blev forskellen i antallet af fækale aflejringer mellem jomfruhunner og mænd også analyseret. I begge grupper var antallet af fækale aflejringer signifikant højere hos fluer fodret med normal mad end dem, der blev fodret med 1 g / 100 ml P. guajava-ekstrakt . (B) Det samlede areal af fækale aflejringer af ITPi-stammen blev sammenlignet hos fluer fodret med normal mad og hos fluer fodret med mad suppleret med 1 g/100 ml P. guajava-ekstrakt , 1 g/100 ml Crofelemer og 10 mM Loperamid. Hos mænd og kvinder var det samlede areal af fækale aflejringer signifikant højere hos fluer fodret med normal mad end dem, der blev fodret med 1 g / 100 ml P. guajava-ekstrakt . (C) Forskellen i den samlede IOD af ITPi-stammen blev analyseret mellem fluer fodret med normal mad og fluer fodret med mad suppleret med 1 g / 100 ml P. guajava-ekstrakt , 1 g / 100 ml Crofelemer og 10 mM Loperamid. Hos mænd og kvinder var den totale IOD signifikant højere hos fluer fodret med normal mad end dem, der blev fodret med 1 g / 100 ml P. guajava-ekstrakt . Forkortelser: F = kvinde; M = mand; Crofe = Crofelemer; Lope = Loperamid; Heller ikke mad = Normal mad; P. gua ext = Psidium guajava ekstrakt. Klik her for at se en større version af denne figur.
For at demonstrere, at den reducerede udskillelse observeret i P. guajava-ekstraktgruppen skyldes ekstraktets hæmmende virkning og ikke et reduceret fødeforbrug, udførte vi direkte indtagelsesestimering og sporing af fast fødeforbrug (DIETS) metode35. Resultaterne viste, at der ikke var nogen signifikante forskelle i fødevareforbruget mellem de stofleverede grupper og dem uden medicin, bortset fra loperamid hos mænd, hvilket fik fluer til at indtage mindre mad end normalt (figur 4).
Figur 4: Foderanalyse. Foderanalysen målte fast fødeindtagelse i fluer. Fluer blev fodret med fire forskellige medier: 1 g / 100 ml P. guajava ekstrakt, 1 g / 100 ml Crofelemer, 10 mM Loperamid og normal mad. Hver gruppe bestod af 20 fluer med fem replikater. Dataene præsenteres som gennemsnitlig SD ± for hver tilstand hos både kvinder og mænd. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en studerendes t-test, der sammenlignede to grupper. p-værdier vises som følger: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
De fækale aflejringer og fodring assay resultater viste, at P. guajava ekstrakt er en pålidelig lægeplante til behandling af diarré i bananfluer.
Supplerende figur 1:T.U.R.D. åbningsvindue. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: T.UR.D.-vindue med indstillinger, der skal justeres. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: T.U.R.D.-vindue med et kommenteret billede. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: T.U.R.D.-vindue, der viser hvert registreret sted fra et billede, der allerede er behandlet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: T.U.R.D.-vindue, der viser hvert behandlet billede. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 6: T.U.R.D.-vindue, der viser processen til eksport af data for hver gruppe. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Hurtig retningslinje for brug af T.U.R.D.-softwaren. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Eksempel på de endelige regneark, der er klar til analyse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: Ansøgning om sammenlægning af regneark. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
D. melanogaster er blevet bredt accepteret som model for forskellige biologiske processer på grund af ligheden i gener mellem D. melanogaster og mennesker36. Brugen af D. melanogaster som model til undersøgelse af tarmkanalen er udbredt, og anvendelsen af T.U.R.D. er blevet brugt til at estimere antallet, arealet og mængden af fækale aflejringer. Imidlertid er den fænotypiske detektionsmetode ikke blevet brugt til at vurdere diarré hos bananfluer. Derfor introducerer denne protokol en ny metode til groft at vurdere tilstedeværelsen af diarré ved at detektere fækale aflejringer.
Fækale aflejringer er en væsentlig indikator for tarmkanalens funktion og sundhed37. I denne sammenhæng foreslås en metode til opdræt af D. melanogaster på lægemiddelholdigt medium for at undersøge forskellige parametre for fækale aflejringer. Ved at overvåge antallet af aflejringer er det muligt at bestemme hyppigheden af afføring og vurdere, om et lægemiddel har nogen indflydelse på tarmtransiteringen. Det samlede areal af aflejringerne kan måles for at evaluere koncentrationen og fortyndingen af fækalt stof, hvilket er en vigtig faktor til bestemmelse af tarmkanalens generelle sundhed. Derudover kan den samlede integrerede optiske tæthed (IOD) bruges til at detektere den samlede mængde fækalt materiale, der er til stede i aflejringerne. Denne protokol giver en effektiv metode til at screene og evaluere lægemidler samt planteekstrakter, der påvirker tarmkanalen. Når D. melanogaster anvendes som modelorganisme, er det muligt at vurdere effektiviteten af potentielle lægemidler, hvilket kan bidrage til at fremskynde lægemiddelopdagelsesprocessen. Ved at anvende denne metode på planteekstrakter kan forskere hjælpe med at validere deres anvendelse som antidiarrheal agenter.
Der er flere kritiske trin at overveje, når du bruger denne protokol til at studere fækale aflejringer i D. melanogaster. For det første er det vigtigt at beregne den masse, der kræves for at opnå den ønskede koncentration af lægemidlet i mediet. Desuden er det vigtigt at sikre god forberedelsestilstand, når lægemidlet tilsættes til mediet, da høje temperaturer kan nedbryde lægemidlet og påvirke dets styrke. For det andet er udvælgelsen af kvindelige fluer vigtig i denne protokol. Det er vigtigt at bruge jomfru kvindelige fluer for at undgå forskellene i fækal produktion mellem jomfru og parret hunner. For eksempel er pletterne produceret af jomfruhunner mere cirkulære end parrede hunner, og parrede hunner har tendens til at udskille mere fækalt materiale end jomfruhunner27,28. Derfor anbefales det at indsamle fluer inden 8 timers lukning for at sikre, at alle indsamlede hunner er jomfruer. Derudover skal de testede fluer være stærke og sunde, da deres helbred kan påvirke fødeindtagelse og fækal produktion. For eksempel kan fluer med en anormal form af vinger have svært ved at få maden. Endelig, for at bruge T.U.R.D. med succes, er blokstørrelsen (pixels) og forskydningsindstillingerne afgørende. På grund af forskellen i billedernes lyskontrast kan det være nødvendigt at prøve forskellige indstillinger for at opnå den bedst mulige identifikation af fækale aflejringer.
Selvom den præsenterede metode er effektiv, er der flere begrænsninger. Den ene er nøjagtigheden af lægemiddelkoncentrationen i mediet. Da mediet opvarmes under fremstillingen, kan noget vand fordampe, hvilket kan påvirke koncentrationen af lægemidlet. En anden begrænsning er scanningen af petriskålene. Nogle dele af petriskålene (dvs. kanter) scannes ikke, og dette kan resultere i en fejlberegning af de samlede fækale aflejringer. Derudover producerer fluerne ikke den samme mængde fækale aflejringer på petriskålenes øverste og nederste dæksler. Fordi de har tendens til at producere flere aflejringer på bunddækslet, kan standardafvigelsen i analysen mellem top- og bunddækslet være høj, hvilket kan påvirke nøjagtigheden af resultaterne.
Ved hjælp af denne protokol kan forskere studere diarré i D. melanogaster. Ved at ændre det lægemiddelholdige medium kan denne metode bruges til at screene antidiarrheal planter, hvilket giver en ny tilgang til lægemiddelopdagelse. Traditionel medicin og naturlige produkter er blevet brugt i århundreder til behandling af forskellige sygdomme, herunder gastrointestinale lidelser. Ved at bruge denne protokol til at evaluere effektiviteten af planteekstrakter på fækale aflejringer kan potentielle nye behandlinger for tarmlidelser identificeres, og der kan gives en videnskabelig begrundelse for deres anvendelse som antidiarrheal agent. Denne tilgang kan yde et værdifuldt bidrag til området for lægemiddelopdagelse og etnofarmakologi.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Martina Gáliková for at give os Drosophila-stammerne . Vi er taknemmelige for Michelle Crozatier-Borde og Marc Haenlin-teamet for at give feedback på vores undersøgelse og hjælpe os med at forbedre vores model. Vi vil gerne takke Napo Pharmaceuticals Company for at give os lægemidlet Crofelemer. Forfatterne er også taknemmelige over for gæsteredaktøren Dr. Hugues Petitjean for at give os mulighed for at offentliggøre denne protokol. Denne undersøgelse blev finansieret af Agence Nationale de la Recherche (ANR) under projektet ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
- Cheng, L. K., et al.
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D.
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H.
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A.
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
