Summary
Здесь описан способ кормления Drosophila melanogaster лекарственными препаратами и растительными экстрактами и оценка их влияния на желудочно-кишечный тракт путем анализа фекальных отложений плодовых мушек. Обработанные лекарственными препаратами мухи могут быть использованы в качестве модели для дальнейших исследований.
Abstract
Для изучения физиологии желудочно-кишечного тракта человека ученые-биомедики полагались на использование модельных организмов. Несмотря на то, что многие исследователи использовали мышей в качестве модели для изучения функции кишечника, лишь немногие сообщения были сосредоточены на Drosophila melanogaster (D. melanogaster). По сравнению с мышами, плодовые мушки имеют много преимуществ, таких как короткий жизненный цикл, экономичность и простота обслуживания, а также отсутствие этических проблем. Кроме того, физиология желудочно-кишечного тракта млекопитающих, анатомия и сигнальные пути высоко консервативны у D. melanogaster. Растительные экстракты традиционно использовались для лечения диареи и запоров. Например, псидиум гуаявский (P. guajava) является одним из самых известных противодиарейных средств в тропиках. Тем не менее, ни в одном исследовании не оценивалось влияние противодиарейных и слабительных препаратов и растительных экстрактов на D. melanogaster, и остается неизвестным, могут ли аналогичные эффекты (например, меньшие, более концентрированные и менее обильные фекальные отложения в случае противодиарейных препаратов) наблюдаться у плодовых мушек по сравнению с млекопитающими. В этом исследовании противодиарейный эффект, индуцированный P. guajava , продемонстрирован у штамма D. melanogaster , который имеет диарейный фенотип. Отбор проб фекалий, производимых мухами, контролируется с помощью корма с добавлением красителя. В этом протоколе описывается метод, используемый для приготовления пищи с лекарственными препаратами, оценки фекальных отложений мух, питающихся этими пищевыми препаратами, и интерпретации полученных данных.
Introduction
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), также называемый пищеварительным трактом, отвечает за переваривание и всасывание питательных веществ и выведение непереваренныхпродуктов1. Желудочно-кишечный тракт уязвим к целому ряду заболеваний, которые могут вызывать дискомфорт, боль и нарушать повседневную жизнь. Желудочно-кишечные расстройства включают боль и дискомфорт в животе, вздутие живота, изжогу, расстройство желудка или диспепсию, тошноту, рвоту, диарею и запор2. Диарея является наиболее распространенным симптомом расстройства желудочно-кишечного тракта3 и определяется как заболевание, при котором в течение 24 ч выделяется не менее трех жидких и водянистых испражнений. Диарея вызывается широким спектром возбудителей, включая бактерии, вирусы, паразитов, грибки, а также может быть вызвана лекарственными препаратами 5,6. Во всем мире диарея продолжает оставаться второй по значимости причиной смертности среди детей в возрасте до 5лет7. Хотя диарея может пройти сама по себе, она также может указывать на более серьезное основное заболевание, если она длится более нескольких дней.
Для изучения желудочно-кишечного тракта исследователи обращаются к животным моделям, таким как мыши, крысы и свиньи. Однако использование этих животных может быть дорогостоящим и трудоемким, поскольку требует специализированных условий и этических соображений. Недавние исследования показали, что D. melanogaster может быть использован в качестве модели для изучения желудочно-кишечного тракта и изучения некоторых механизмов, таких как поддержание регенеративного гомеостаза, развитие иммунного старения, потеря функции эпителиального барьера и снижение метаболического гомеостаза10,11. D. melanogaster, известный как плодовая мушка, имеет высокую степень генетической гомологии с человеком; Считается, что примерно 75% генов болезней человека имеют функциональный гомолог у мухи12. У них также есть простая пищеварительная система, состоящая из передней, средней и задней кишки. D. melanogaster легко культивируется в лаборатории и может быть генетически модифицирован различными способами14. Таким образом, использование D. melanogaster для тестирования in vivo является мощным инструментом, позволяющим исследователям изучать сложные биологические процессы в контролируемых условиях.
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), около 80% людей, живущих в развивающихся странах, используют народную медицину для удовлетворения своих первичных медико-санитарныхпотребностей15. Высокую степень применения лекарственных растений можно объяснить тем, что они легкодоступны, недороги и имеют мало побочныхэффектов16. Основные части растений, используемые в фитотерапии, включают листья, кору, корни, семена17, в то время как основными методами приготовления являются настой, отвар и мацерация18. Эти растительные средства содержат фитохимические вещества, такие как алкалоиды, терпеноиды, флавоноиды, стероиды, дубильные вещества и углеводы19, которые оказывают лечебное воздействие на организм человека. Люди используют различные лекарственные растения для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как диарея, боль в животе и дизентерия20. Например, Psidium guajava является одним из наиболее часто используемых растений для лечения диареи в мире. Различные фармакологические и клинические испытания уже показали его безопасность, что делает его хорошим кандидатом на противодиарейное средство для изучения21,22. Однако основными ограничениями растительных лекарственных средств являются недостаточная оценка эффективности и безопасности, а также отсутствие определенной и полной информации о составе используемых растительных экстрактов23. Для подтверждения эффективности и безопасности лекарственных средств растительного происхождения необходим систематический подход, включающий экспериментальную и клиническую валидацию, и этот подход должен быть подкреплен достаточным количеством данных исследований in vivo и in vitro.
Для оценки эффективности традиционных средств в лечении диареи в последние десятилетия преобладало использование мышей и крыс24,25. В связи с основными преимуществами, упомянутыми ранее, а именно: простотой использования, доступностью, воспроизводимостью, сохранением всасывающих и пищеварительных функций у мух и млекопитающих, мы предлагаем использовать D. melanogaster в качестве модели для оценки противодиарейной активности растений. Диарейный фенотип у D. melanogaster может характеризоваться несколькими особенностями, в том числе повышенным обилием фекальных отложений, более крупными размерами отложений, более светлой окраской (менее концентрированной) и более высоким содержанием фекального материала26. Этот фенотип может быть количественно определен с помощью различных параметров: количество фекальных отложений, общая площадь отложений, средняя светлота и общая интегральная оптическая плотность (IOD). Общее количество ОВН определяется как общее содержание красителя в осадке, то есть общее количество выделяемого фекального материала27. Ранее был разработан анализ фекальных отложений D. melanogaster27,28. В этом анализе в качестве инструмента анализа кала использовался конечный считыватель навоза (T.U.R.D.), который позволяет проверить количество, размер и легкость фекальных отложений и, таким образом, контролировать физиологию кишечника плодовых мушек. Однако этот метод никогда не применялся для оценки диарейного фенотипа у мух. Ген ионного транспортного пептида (ITP) является важным эндокринным регулятором жажды и выведения и сочетает в себе водный гомеостаз с питанием у D. melanogaster. В недавнем исследовании было показано, что скорость прохождения пищи по желудочно-кишечному тракту и частота дефекаций снижались при чрезмерной экспрессии ИТП и увеличивались при нокдауне ИТП. Последний фенотип был описан авторами данного исследования как диарейный29.
В этом протоколе модифицированная версия анализа фекальных отложений используется для оценки влияния противодиарейного агента (т.е. экстракта листьев гуавы) на желудочно-кишечный тракт D. melanogaster с использованием штамма ITPi в качестве диарейной модели. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы: 1) предоставить простой и надежный метод оценки противодиарейного эффекта лекарств и растительных экстрактов, и 2) позволить обнаружить биологически активные соединения, ответственные за противодиарейный эффект, в растительных экстрактах, путем применения подхода, основанного на биоактивности.
Protocol
1. Приготовление растительного экстракта
- Соберите30 листьев Psidium guajava L. со взрослого дерева и обработайте следующим образом: высушите листья в духовке при температуре 40 °C в течение 6 дней, затем высушите на воздухе в течение 6 дней, затем снова высушите в духовке при 40 °C в течение 4 дней и, наконец, приготовьте порошок листьев, измельчив сухие листья в мельнице или кофемолке.
- Вымачивают 100 г высушенного порошка в 1 л 96% этилового спирта в течение 24 ч при непрерывном помешивании с помощью шейкера. Подвергните растительные остатки той же обработке еще раз и выпарите полученные фильтраты досуха с помощью вакуумного ротационного испарителя при пониженном давлении (175 мбар) при 40 °C.
- Растворите растительный экстракт в этаноле до получения нужной концентрации. Определите оптимальную концентрацию (используя протокол, описанный здесь), проверив серию концентраций.
- Для растительных экстрактов тестируйте диапазон концентраций 100 мкг/мл, 1 мг/мл, 10 мг/мл, 100 мг/мл и используйте те, которые не влияют на выживаемость мух. Для чистых соединений испытайте следующий диапазон концентраций: 0,05, 0,5, 5 и 50 мМ12.
2. Приготовление пищевой среды
- Отмерьте 100 мл дистиллированной воды и налейте в стакан 4 г сахара и 0,8 г агара (см. таблицу материалов). Нагрейте до 100 °C (помешивая) и держите 10 мин.
- Температуру снизить до 80 °С, при помешивании добавить 7,4 г муки и 2,8 г дрожжей. Нагревайте не менее 20 минут, продолжая помешивать и контролируя температуру, которая должна быть около 80 °C.
- Добавить раствор молдекс-пропионовой кислоты (1 мл молдекса и 0,3 г пропионовой кислоты хорошо перемешать). Подождите, пока температура не упадет примерно до 50 °C, добавьте раствор растительного экстракта (1 мг/мл) и 0,5 г порошка бромфенола синего цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к разделу 1.3.1 для получения более подробной информации о других концентрациях, подлежащих испытанию. - Вылейте продукты в чашки Петри и остановитесь, когда чашка Петри наполнится (Рисунок 1A). Дайте чашкам Петри остыть до комнатной температуры (около 3 ч), затем закройте крышкой и храните в холодильнике при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чашки Петри следует хранить в холодильнике не более 2 недель, чтобы избежать испарения воды.
Рисунок 1: Демонстрация экспериментального процесса исследования фекальных отложений. (A) Изображение, показывающее чашки Петри, заполненные пищевой средой. Убедитесь, что в чашке Петри достаточно корма, чтобы никакие щели не задержали мух и не позволили им двигаться. Однако не перегружайте чашку Петри пищей, чтобы поверхность могла быть покрыта равномерно. (Б) Изображение шпателя, как описано в протоколе. (C) Изображение теста на фекальные отложения, как описано в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
3. Подготовка мух
- Подготовьте баллоны сСО2 , пистолет для продувкиСО2 с иглами, подушечку для мух, кисть и микроскоп. Флайстан подает CO2 как на налетную подушку, так и на продувочный пистолет. Коврик для мух используется для сортировки мух, в то время как продувочный пистолет CO2 используется для обезболивания мух во флаконах, бутылках и чашках Петри.
- Стандартизируйте возраст мух, выбрав флаконы, содержащие куколок (не менее 10), и выбросьте взрослых мух из пробирки, используя следующий метод. Один за другим переверните флаконы вверх дном и вставьте иглу между ватной пробкой и боковой стенкой флакона. Обезболивайте взрослых мух с помощью продувочного пистолета CO2 до тех пор, пока все мухи не уснут на ватной пробке (для их обезболивания необходимо несколько секунд, а анестезирующее действие будет продолжаться в течение нескольких секунд после отпускания выдувного пистолета). Откройте флакон над стеклянной бутылкой, содержащей 70% этанола, и опустите в него мух. Закройте флакон ватной пробкой и храните в инкубаторе при температуре 25 °C и влажности 60%. Установите световой цикл инкубатора на 12 часов света/12 часов темноты.
- После инкубации (максимум 8 ч) отсортируйте их на девственных самок и самцов под микроскопом и подушечкой мух, перевернув их на спину и посмотрев на их гениталии.
- Женские гениталии бледные по сравнению с мужскими, которые имеют красноватый цвет. Самцов также можно определить по наличию темных щетинок, называемых половыми гребнями, на передней паре ног. Разделите мух на две свежие пробирки (одну для самцов и одну для самок) и инкубируйте их в течение 6-8 дней при температуре 25 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: При температуре 25 °C самки остаются девственниками в течение примерно 8 часов после вылупления.
- Женские гениталии бледные по сравнению с мужскими, которые имеют красноватый цвет. Самцов также можно определить по наличию темных щетинок, называемых половыми гребнями, на передней паре ног. Разделите мух на две свежие пробирки (одну для самцов и одну для самок) и инкубируйте их в течение 6-8 дней при температуре 25 °C.
4. Анализ кала
- Маркируйте чашки Петри соответствующим штаммом, полом и лекарством, чтобы избежать путаницы между чашками Петри. Сложите чашки Петри друг на друга.
- Возьмите чашки Петри, содержащие окрашенную пищу, и переверните их на промокательной бумаге, чтобы впитать лишнюю жидкость. С помощью лопатки (рис. 1B) разрежьте продукты на 12 равных частей, а затем с помощью лопатки положите один ломтик в пустую чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества повторов, количество нарезаемых ломтиков может быть увеличено до 20 на чашку Петри. Каждый ломтик должен быть одинакового размера. - Обезболивайте мухСО2 до тех пор, пока все мухи не уснут на ватной пробке. Пересадите шесть здоровых мух в каждую чашку Петри (рис. 1C) и немедленно закройте крышку, затем поместите их в инкубатор (25°C, влажность 60%, 12 часов света / 12 часов темноты).
- Чтобы мухи не вырвались из чашки Петри во время эксперимента, прикрепите верхнюю и нижнюю крышки чашки Петри скотчем. Для каждой испытуемой группы подготовьте не менее шести чашек Петри.
- Дав мухам встать на дыбы в течение 24 часов, используйте CO2 для их анестезии, переложите мух в контейнер, наполненный 70% этанолом, и утилизируйте оставшуюся пищу.
- Сохраните чашки Петри и переходите к шагу 5.
5. Количественная оценка чашек Петри
- Установите папку на компьютере и переименуйте ее, включив в нее название экспериментального штамма, пол мух и тип используемых препаратов. В этой папке создайте вложенные папки с именами Original, Cut и Analysis.
- Сканируйте чашки Петри с помощью сканера высокого разрешения с оптическим разрешением 6 400 пикселей на дюйм (ppi). Отсканируйте верхнюю и нижнюю крышки каждой чашки Петри отдельно, поместив их по отдельности в середину поля сканера.
- Откройте приложение, установленное на компьютере. На экране компьютера откроется окно приветствия со всеми общими настройками (рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте дополнительные настройки. Этот шаг действителен только для пользователей, у которых есть такой же сканер, как предложено в таблице материалов. Пожалуйста, ознакомьтесь с рекомендациями при использовании другого программного обеспечения.- Назовите чашку Петри в приложении, указав порядковый номер, верхнюю или нижнюю крышку, пол и тип используемой пищи. Выберите исходный набор вложенных папок на шаге 5.1.
- Предварительный просмотр чашки Петри. Нажмите « Предварительный просмотр » в нижней части окна, подождите несколько секунд, пока сканер выполнит предварительное сканирование, после чего на экране компьютера появится окно. Переместите квадрат, отображаемый на экране, чтобы окружить чашку Петри.
- Нажмите « Сканировать » в правом нижнем углу окна на экране компьютера, скан автоматически сохранится в виде изображения в выбранной папке.
- Обрежьте изображение с помощью приложения (например, приложения Fiji с открытым исходным кодом), чтобы артефакты и остатки пищи не считались отложениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги действительны только для пользователей, у которых есть приложение Fiji. Пожалуйста, ознакомьтесь с рекомендациями при использовании другого программного обеспечения.- Откройте приложение Fiji, подождите несколько секунд, пока на экране не появится панель инструментов.
- Перетащите обрезаемое изображение на панель инструментов. Выберите 3-й значок Полигональные выделения на панели инструментов, обрежьте ненужную часть фотографии (цветную круговую диаграмму), щелкнув по экрану, чтобы отметить угол вокруг круговой диаграммы (рис. 2B-1,2).
ПРИМЕЧАНИЕ: При очерчивании области обрезки в изображении крайне важно, чтобы выбранные кадры были бесшовно соединены друг с другом. - Нажмите «Редактировать» в левом верхнем углу панели, затем «Заливка/Очистить снаружи» (рисунок 2B-3).
- Чтобы сохранить фотографию, нажмите « Файл » в левом верхнем углу панели, затем «Сохранить как» и, наконец, « Tiff». Выберите подпапку Cut set на шаге 5.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сохранении обрезанного изображения убедитесь, что в имени файла нет специальных символов (например, !, &, $, #, _,-,...) или слишком много символов.
Рисунок 2: Основные этапы процесса анализа данных теста на фекальные отложения. (A) Снимок экрана, показывающий информацию о настройках приложения сканирования. (B) Изображения, обрезанные с помощью приложения Fiji. Следите за тем, чтобы никакие артефакты и остатки пищи не считались отложениями. (C) Снимок экрана, показывающий, как это выглядит при открытии приложения Excel_merge-v4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
6. Идентификация фекальных отложений с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом для считывателя навоза
ПРИМЕЧАНИЕ: Введение и использование программного обеспечения для считывания навоза можно найти в Дополнительном файле 1.
- Во-первых, откройте программное обеспечение T.U.R.D. (дополнительный рисунок 1). Создайте новый эксперимент и присвойте документу имя, а затем сохраните его во вложенной папке Analysis, заданной на шаге 5.1.
- Нажмите « Тарелки », а затем « Добавить тарелку». Выберите чашку Петри для обработки. Появится новое окно с названиями выбранных пластин и новыми параметрами. Задайте размер блока, смещение, минимальный размер и максимальный размер (дополнительный рисунок 2).
- Чтобы убедиться в правильности обнаруженных фекальных отложений, нажмите на Plates, затем Inspect Selected Plates, затем Graphics и View annotated images (дополнительный рисунок 3). Увеличьте масштаб и посмотрите на счетчики. Если есть только несколько месторождений, которые не должны быть включены в анализ, отмените выбор отложений, которые нужно исключить (дополнительный рисунок 4).
- Для обработки каждого нового образа начинайте с шага 6.3.
- Проанализировав пластины с помощью программного обеспечения T.U.R.D., измените количество мух, нажав на кнопку «Нет». Мухи (дополнительный рисунок 5).
- Измените имя группы, щелкнув Пластины > Редактировать группы > Добавить, а затем в столбце Группа выберите имя группы.
- Экспортируйте различные данные репликации по отдельности, щелкнув Analyze > Descriptive Statistics > Select Group (дополнительный рисунок 6). Храните все файлы электронных таблиц (.csv) в одной папке.
- Для того, чтобы собрать все файлы (полученные на шаге 6.7) в уникальную электронную таблицу, откройте приложение Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), подождите, пока не появится следующее предложение Выберите путь к папке (с .csv файлами):, а затем вставьте указанный выше адрес папки. Например, путь может быть таким: C:\Experiment\Fecal deposit test\, а затем дважды нажать клавишу Enter на клавиатуре (рисунок 2C). После этого в той же папке создается новый файл электронной таблицы. Новый файл электронной таблицы включает в себя все экспортированные файлы в разных таблицах.
- В предыдущем файле электронной таблицы добавьте еще один лист для сбора среднего значения каждого параметра всех репликаций (используйте функцию ВПР для обработки данных). Пример приведен в Дополнительной таблице 1.
- Проанализируйте p-значение.
Representative Results
Представленное здесь исследование показывает, что измерение диареи у D. melanogaster может быть достигнуто с помощью анализа фекальных отложений. Существенные различия между фенотипами (диарейные или нет) могут быть определены путем анализа различных параметров, включая количество фекальных отложений, общую площадь отложений, среднюю площадь отложений, среднюю светлоту и общую интегральную оптическую плотность (IOD), которая является мерой общего количества красителя, присутствующего в отложении, и представляет собой общее содержание экскретируемого фекального материала27.
Нокдаун гена ITP у мух может индуцировать диарейный фенотип, характеризующийся повышенной частотой дефекации, что делает их подходящей моделью для изучения диареи29. В контексте этого эксперимента был использован штамм ITPi (w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) и выращен на стандартной среде. Экстракт листьев Psidium guajava был выбран в качестве противодиарейного средства, учитывая широкое использование этого растения в тропических регионах для лечения диареи. Крофелемер, противодиарейное средство, было одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для обеспечения симптоматического облегчения неинфекционной диареи у взрослых пациентов с ВИЧ/СПИДом, проходящих антиретровируснуютерапию. Crofelemer - это экстракт латекса Croton lechleri Müll.Arg. кора стебля32. Лоперамид — синтетический препарат, используемый во всем мире для лечения диареи33. И Крофелемер, и Лоперамид были использованы в качестве потенциальных положительных контрольных препаратов.
Гипотеза заключалась в том, что кормление мух экстрактом P. guajava , крофелемером и лоперамидом уменьшит фенотип диареи по сравнению с теми, кого кормят обычной пищей. Чтобы проверить эту гипотезу, было проведено измерение фекальных отложений у D. melanogaster путем сравнения нескольких параметров между мухами, которых кормили обычной пищей, и теми, которых кормили экстрактом P. guajava (1 г/100 мл), крофелемером (1 г/100 мл) и лоперамидом (10 мМ). Для постановки эксперимента использовали 6-7-дневных девственных самок или самцов. Каждая чашка Петри содержала шесть мух, и было проведено шесть повторений. Мух выращивали в течение 24 ч, а затем анализировали каждую группу. Для сравнения значимой разницы между испытуемыми группами использовали t-критерий Стьюдента. Результаты показывают, что количество фекальных отложений (Рисунок 3А), общая площадь отложений (Рисунок 3В) и общий ОВН (Рисунок 3С) показали значительно более высокие значения в группе нормальных продуктов питания по сравнению с группой экстракта P. guajava (1 г/100 мл), как у девственниц, так и у мужчин. К сожалению, Лоперамид не показал никакого эффекта у обоих полов (но уже было продемонстрировано, что он действует как спазмолитик у D. melanogaster)34 , в то время как Крофелемер оказывал влияние только на самок.
Рисунок 3: Анализ деформации ITPi. Штамм ITPi был проанализирован в четырех условиях: питание обычной пищей, пища, дополненная 1 г/100 мл экстракта P. guajava, 1 г/100 мл крофелемера и 10 мМ лоперамида. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения каждого состояния как у женщин, так и у мужчин (для шести повторений двух сторон чашки Петри). Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента при сравнении двух групп. p-значения отображаются следующим образом: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Количество фекальных отложений штамма ITPi сравнивали у мух, которых кормили пищей с добавлением 1 г/100 мл крофелемера, 10 мМ лоперамида, 1 г/100 мл экстракта P. guajava, и у мух, которых кормили обычной пищей. Кроме того, была проанализирована разница в количестве фекальных отложений между девственными женщинами и мужчинами. В обеих группах количество фекальных отложений было значительно выше у мух, которых кормили обычной пищей, чем у мух, которых кормили 1 г/100 мл экстракта P. guajava. (B) Общая площадь фекальных отложений штамма ITPi сравнивалась у мух, которых кормили обычной пищей, и у мух, которых кормили пищей, дополненной 1 г/100 мл экстракта P. guajava, 1 г/100 мл крофелемера и 10 мМ лоперамида. У самцов и самок общая площадь фекальных отложений была значительно выше у мух, которых кормили обычной пищей, чем у мух, которых кормили экстрактом P. guajava в дозе 1 г/100 мл. (C) Была проанализирована разница в общей ОВН штамма ITPi между мухами, которых кормили обычной пищей, и мухами, которых кормили пищей, дополненной 1 г/100 мл экстракта P. guajava, 1 г/100 мл крофелемера и 10 мМ лоперамида. У самцов и самок общий ОВН был значительно выше у мух, получавших обычную пищу, чем у мух, получавших 1 г/100 мл экстракта P. guajava. Сокращения: F = женский; M = Мужчина; Кроф = Крофелемер; Лопе = лоперамид; Ни пища = Нормальная пища; P. gua ext = Экстракт Psidium guajava. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы продемонстрировать, что снижение экскреции, наблюдаемое в группе экстракта P. guajava , обусловлено ингибирующим действием экстракта, а не снижением потребления пищи, мы провели прямую оценку потребления и отслеживание потребления твердой пищи (DIETS) методом35. Результаты показали, что не было существенных различий в потреблении пищи между группами, получавшими лекарства, и теми, кто не получал лекарств, за исключением лоперамида у самцов, который заставлял мух потреблять меньше пищи, чем обычно (рис. 4).
Рисунок 4: Анализ кормления. В анализе кормления измерялось потребление твердой пищи у мух. Мух кормили четырьмя различными средами: 1 г/100 мл экстракта гуаявы, 1 г/100 мл крофелемера, 10 мМ лоперамида и обычной пищи. Каждая группа состояла из 20 мух с пятью репликами. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения по каждому заболеванию как у женщин, так и у мужчин. Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента при сравнении двух групп. p-значения отображаются следующим образом: *: p < 0,05; **: р < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Фекальные отложения и результаты анализа кормления показали, что экстракт P. guajava является надежным лекарственным растением для лечения диареи у плодовых мушек.
Дополнительный рисунок 1: Открывающееся окно T.U.R.D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Окно T.UR.D. с настройками, которые необходимо настроить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Окно T.U.R.D. с аннотированным изображением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Окно T.U.R.D., представляющее каждое обнаруженное пятно из уже обработанного изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 5: Окно T.U.R.D., представляющее каждое обработанное изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 6: Окно T.U.R.D., показывающее процесс экспорта данных для каждой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 1: Краткое руководство по использованию программного обеспечения T.U.R.D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 1: Пример итоговых электронных таблиц, готовых к анализу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл кода 1: Приложение для объединения электронных таблиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Discussion
D. melanogaster был широко принят в качестве модели для различных биологических процессов из-за сходства генов между D. melanogaster и человеком36. Широко распространено использование D. melanogaster в качестве модели для изучения кишечного тракта, а применение T.U.R.D. было использовано для оценки количества, площади и количества фекальных отложений. Однако метод фенотипического выявления не использовался для оценки диареи у плодовых мушек. Таким образом, этот протокол вводит новый метод приблизительной оценки наличия диареи путем обнаружения фекальных отложений.
Фекальные отложения являются важным показателем функционирования и здоровья кишечного тракта37. В связи с этим предложен способ выращивания D. melanogaster на лекарственной среде для исследования различных параметров фекальных отложений. Контролируя количество отложений, можно определить частоту дефекации и оценить, оказывает ли препарат какое-либо влияние на кишечный транзит. Общая площадь отложений может быть измерена для оценки концентрации и разжижения фекальных масс, что является важным фактором в определении общего состояния кишечного тракта. Кроме того, общая интегральная оптическая плотность (IOD) может быть использована для определения общего количества фекального материала, присутствующего в отложениях. Этот протокол обеспечивает эффективный метод скрининга и оценки лекарств, а также растительных экстрактов, влияющих на кишечный тракт. При использовании D. melanogaster в качестве модельного организма можно оценить эффективность потенциальных лекарств, что может помочь ускорить процесс разработки лекарств. Применяя этот метод к растительным экстрактам, исследователи могут помочь подтвердить их использование в качестве противодиарейных средств.
Существует несколько важных шагов, которые следует учитывать при использовании этого протокола для изучения фекальных отложений у D. melanogaster. Во-первых, необходимо рассчитать массу, необходимую для достижения нужной концентрации препарата в среде. Кроме того, при добавлении препарата в среду важно обеспечить хорошие условия приготовления, так как высокие температуры могут испортить препарат и повлиять на его эффективность. Во-вторых, в этом протоколе важен отбор самок мух. Важно использовать девственных самок мух, чтобы избежать различий в выделении фекалий между девственными и спаренными самками. Например, пятна, образующиеся у девственных самок, более круглые, чем у спаривающихся самок, и спаренные самки, как правило, выделяют больше фекального материала, чем девственные самки27,28. Поэтому рекомендуется собирать мух до 8 часов после эклозии, чтобы убедиться, что все собранные самки являются девственницами. Кроме того, тестируемые мухи должны быть сильными и здоровыми, так как их здоровье может влиять на потребление пищи и выделение фекалий. Например, мухи, имеющие ненормальную форму крыльев, могут испытывать трудности с добыванием пищи. Наконец, для успешного использования T.U.R.D. решающее значение имеют размер блока (пиксели) и настройки смещения. Из-за разницы в световом контрасте изображений может потребоваться попробовать разные настройки, чтобы добиться наилучшей идентификации фекальных отложений.
Несмотря на то, что представленный метод является эффективным, существует ряд ограничений. Одним из них является точность концентрации препарата в среде. При нагревании среды во время приготовления часть воды может испаряться, что может повлиять на концентрацию препарата. Еще одним ограничением является сканирование чашек Петри. Некоторые части чашек Петри (т.е. края) не сканируются, и это может привести к неправильному подсчету общих фекальных отложений. Кроме того, мухи не производят одинаковое количество фекальных отложений на верхней и нижней крышках чашек Петри. Поскольку они имеют тенденцию образовывать больше отложений на нижней крышке, стандартное отклонение анализа между верхней и нижней крышкой может быть высоким, что может повлиять на точность результатов.
Используя этот протокол, исследователи могут изучать диарею у D. melanogaster. Модифицируя лекарственную среду, этот метод может быть использован для скрининга противодиарейных растений, что обеспечивает новый подход к открытию лекарств. Народная медицина и натуральные продукты веками использовались для лечения различных заболеваний, в том числе и желудочно-кишечных расстройств. Используя этот протокол для оценки эффективности растительных экстрактов в фекальных отложениях, можно определить потенциальные новые методы лечения заболеваний кишечного тракта и предоставить научное обоснование их использования в качестве противодиарейных средств. Такой подход может внести ценный вклад в разработку лекарств и этнофармакологию.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Мартину Галикову за предоставленные нам штаммы дрозофилы . Мы благодарны команде Michelle Crozatier-Borde и Marc Haenlin за отзывы о нашем исследовании и помощь в улучшении нашей модели. Благодарим компанию Napo Pharmaceuticals за предоставленный нам препарат Крофелемер. Авторы также благодарят приглашенного редактора д-ра Юга Петижана за предоставленную нам возможность опубликовать этот протокол. Это исследование финансировалось Национальным агентством исследований (ANR) в рамках проекта ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
- Cheng, L. K., et al.
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D.
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H.
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A.
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
