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Biology

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर पर एंटीडायरेहिल ड्रग्स और प्लांट एक्सट्रैक्ट्स के प्रभाव का आकलन

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65877
Automatic Translation
1, 1
1UMR 152 PharmaDev, Université Paul Sabatier, Institut de Recherche pour le Développement

Summary

यहां, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर को दवाओं और पौधों के अर्क के साथ खिलाने और फल मक्खियों के मल जमा का विश्लेषण करके जठरांत्र संबंधी मार्ग पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। दवा-उपचारित मक्खियों को आगे के शोध के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

मानव गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए, जैव चिकित्सा वैज्ञानिकों ने मॉडल जीवों के उपयोग पर भरोसा किया है। हालांकि कई शोधकर्ताओं ने आंतों के कार्य का अध्ययन करने के लिए चूहों को एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया है, केवल कुछ रिपोर्टों ने ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (डी। चूहों की तुलना में, फल मक्खियों कई फायदे पेश करते हैं, जैसे कि एक छोटा जीवन चक्र, लागत प्रभावी और सरल रखरखाव, और कोई नैतिक मुद्दे नहीं। इसके अलावा, स्तनधारी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फिजियोलॉजी, शरीर रचना विज्ञान, और सिग्नलिंग मार्ग डी. मेलानोगास्टर में अत्यधिक संरक्षित हैं। पौधे के अर्क का उपयोग पारंपरिक रूप से दस्त और कब्ज के इलाज के लिए किया जाता है। उदाहरण के लिए, Psidium guajava (P. guajava) उष्णकटिबंधीय में सबसे प्रसिद्ध antidiarrheal एजेंटों में से एक है। हालांकि, किसी भी अध्ययन ने डी. मेलानोगास्टर में एंटीडायरेहियल और रेचक दवाओं और पौधों के अर्क के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं किया है, और यह अज्ञात है कि समान प्रभाव (जैसे, एंटीडायरेहिल दवाओं के मामले में छोटे, अधिक केंद्रित, और कम प्रचुर मात्रा में फेकल जमा) स्तनधारियों की तुलना में फल मक्खियों में हो सकते हैं। इस अध्ययन में, पी. गुजावा द्वारा प्रेरित एक एंटीडायरेहियल प्रभाव एक डी मेलानोगास्टर तनाव में प्रदर्शित किया जाता है जो एक डायरिया फेनोटाइप प्रस्तुत करता है। मक्खियों द्वारा उत्पादित फेकल नमूने की निगरानी डाई-पूरक भोजन का उपयोग करके की जाती है। यह प्रोटोकॉल दवाओं के साथ भोजन तैयार करने, इन खाद्य तैयारियों पर खिलाए गए मक्खियों के मल जमा का मूल्यांकन करने और प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि की रूपरेखा तैयार करता है।

Introduction

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ, जिसे पाचन तंत्र भी कहा जाता है, पोषक तत्वों के पाचन और अवशोषण और अपचितउत्पादों के उत्सर्जन के लिए जिम्मेदार है। जीआई पथ विकारों की एक श्रृंखला के प्रति संवेदनशील है जो दैनिक जीवन में असुविधा, दर्द और व्यवधान पैदा कर सकता है। गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों में पेट दर्द और बेचैनी, सूजन, नाराज़गी, अपच या अपच, मतली, उल्टी, दस्त और कब्जशामिल हैं 2. डायरिया जीआई विकार3 का सबसे आम लक्षण है, और इसे 24 घंटे की अवधि4 के दौरान कम से कम तीन ढीले और पानी के मल के साथ एक बीमारी के रूप में परिभाषित किया गया है। दस्त रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण होता है, बैक्टीरिया, वायरस, परजीवी, कवक सहित, और यह भी दवाओं 5,6 के कारण हो सकता है. दुनिया भर में, डायरिया5 साल से कम उम्र के बच्चों में मृत्यु दर का दूसरा प्रमुख कारण बना हुआ है। हालांकि दस्त खुद को हल कर सकता है, यह अधिक गंभीर अंतर्निहित स्थिति का संकेत भी दे सकता है यदि यह कुछ दिनों से अधिक समय तक रहता है।

आंत्र पथ का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं ऐसे चूहों, चूहों, और सूअरों 8,9 के रूप में पशु मॉडल के लिए बारी. हालांकि, इन जानवरों का उपयोग महंगा और समय लेने वाला हो सकता है क्योंकि उन्हें विशेष सुविधाओं और नैतिक विचारों की आवश्यकता होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि डी. मेलानोगास्टर जीआई पथ का अध्ययन करने और पुनर्योजी होमियोस्टेसिस के रखरखाव जैसे कुछ तंत्रों की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिरक्षा जीर्णता का विकास, उपकला बाधा समारोह का नुकसान, और चयापचय होमियोस्टेसिस10,11में गिरावट. मेलानोगास्टर, जिसे फल मक्खी के रूप में जाना जाता है, मनुष्यों के साथ आनुवंशिक होमोलॉजी का एक उच्च स्तर साझा करता है; माना जाता है कि लगभग 75% मानव रोग जीन में एक कार्यात्मक होमोलॉग होता है मक्खी12. उनके पास एक सरल पाचन तंत्र भी होता है जिसमें एक फोरगट, एक मिडगट और एक हिंदगट13 होता है। मेलानोगास्टर प्रयोगशाला में संस्कृति के लिए आसान है और आनुवंशिक रूप से विभिन्न तरीकों से संशोधित किया जा सकता है14. इसलिए, विवो परीक्षण में के लिए डी. मेलानोगास्टर का उपयोग करना एक शक्तिशाली उपकरण है जो शोधकर्ताओं को नियंत्रित सेटिंग में जटिल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, विकासशील देशों में रहने वाले लगभग 80% लोग अपनी प्राथमिकस्वास्थ्य आवश्यकताओं के लिए पारंपरिक चिकित्सा का उपयोग करते हैं। औषधीय पौधों के उच्च उपयोग तथ्य यह है कि वे आसानी से उपलब्ध हैं, सस्ती है, और कुछ साइड इफेक्ट16 द्वारा समझाया जा सकता है. हर्बल थेरेपी में उपयोग किए जाने वाले मुख्य पौधों के हिस्सों में पत्ते, छाल, जड़ें, बीज17 शामिल हैं, जबकि तैयारी के मुख्य तरीके जलसेक, काढ़ा और मैक्रेशन18 हैं। इन हर्बल उपचार ऐसे उपक्षारों के रूप में phytochemical पदार्थ शामिल, terpenoids, flavonoids, स्टेरॉयड, टैनिन और कार्बोहाइड्रेट19, जो मानव शरीर पर चिकित्सीय प्रभाव पड़ता है. लोग जीआई विकारों जैसे दस्त, पेट दर्द और पेचिशके इलाज के लिए विभिन्न प्रकार के औषधीय पौधों का उपयोग करते हैं। उदाहरण के लिए, Psidium guajava दुनिया में दस्त के इलाज के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले पौधों में से एक है। विभिन्न औषधीय और नैदानिक परीक्षणों ने पहले ही अपनी सुरक्षा दिखाई है, जो इसे21,22 का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा एंटीडायरेहिल उम्मीदवार बनाते हैं। हालांकि, हर्बल दवाओं की प्रमुख सीमाओं दक्षता और सुरक्षा मूल्यांकन की कमी है, साथ ही23 इस्तेमाल संयंत्र के अर्क की संरचना के बारे में निश्चित और पूरी जानकारी की कमी के रूप में अच्छी तरह से. हर्बल दवाओं की दक्षता और सुरक्षा को मान्य करने के लिए, प्रयोगात्मक और नैदानिक सत्यापन से जुड़े एक व्यवस्थित दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है और दृष्टिकोण को इन विवो और इन विट्रो अध्ययनों से पर्याप्त डेटा द्वारा समर्थित किया जाना चाहिए।

दस्त के उपचार में उनकी प्रभावकारिता के लिए पारंपरिक उपचार का मूल्यांकन करने के लिए, चूहों और चूहों का उपयोग हाल के दशकों24,25 में प्रमुख रहा है. पहले वर्णित मुख्य लाभों के कारण, यानी, मक्खियों और स्तनधारियों के बीच उपयोग में आसानी, सस्ती, प्रतिकृति, संरक्षित अवशोषक और पाचन कार्य, हम पौधों की एंटीडायरेहियल गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल के रूप में डी. मेलानोगास्टर का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं। डी. मेलानोगास्टर में डायरेरिक फेनोटाइप को कई विशेषताओं की विशेषता हो सकती है, जिसमें फेकल जमा की बहुतायत में वृद्धि, बड़े जमा आकार, एक हल्का रंग (कम केंद्रित), और उच्च फेकल सामग्री26शामिल है। इस फेनोटाइप को विभिन्न मापदंडों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है: फेकल जमा की संख्या, जमा का कुल क्षेत्रफल, मतलब हल्कापन, और कुल एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (आईओडी)। कुल आईओडी को जमा की कुल डाई सामग्री के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसका अर्थ है कुल फेकल सामग्री27 उत्सर्जित होती है। पहले, एक परख डी के fecal जमा का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है मेलानोगास्टर27,28. इस परख में, गोबर (T.U.R.D.) के अंतिम पाठक का उपयोग एक फेकल विश्लेषण उपकरण के रूप में किया गया था, जो फेकल जमा की संख्या, आकार और हल्केपन की जांच करने की अनुमति देता है और इस प्रकार फल मक्खियों के आंतों के शरीर विज्ञान की निगरानी करता है। हालांकि, मक्खियों में डायरेरिक फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए इस विधि को कभी लागू नहीं किया गया था। आयन ट्रांसपोर्ट पेप्टाइड (आईटीपी) जीन प्यास और उत्सर्जन का एक महत्वपूर्ण अंतःस्रावी नियामक है और डी. मेलानोगास्टर में भोजन के साथ पानी के होमियोस्टेसिस को जोड़ता है। हाल के एक अध्ययन में, यह दिखाया गया था कि जीआई पथ में खाद्य पारगमन की गति और शौच की घटनाओं की आवृत्ति आईटीपी अति-अभिव्यक्ति से कम हो गई और आईटीपी नॉकडाउन द्वारा बढ़ गई। उत्तरार्द्ध फेनोटाइप को इस अध्ययन29 के लेखकों द्वारा डायरिक के रूप में वर्णित किया गया था।

इस प्रोटोकॉल में, फेकल जमा परख का एक संशोधित संस्करण एक डायरेहियल मॉडल के रूप में ITPi तनाव का उपयोग करके डी मेलानोगास्टर के जठरांत्र संबंधी मार्ग पर एक antidiarrheal एजेंट (यानी, अमरूद पत्ती निकालने) के प्रभाव का आकलन करने के लिए नियोजित किया जाता है। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य है: 1) दवाओं और पौधों के अर्क के एंटीडायरेहियल प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक आसान और विश्वसनीय तरीका प्रदान करना, और 2) बायोएक्टिविटी-निर्देशित दृष्टिकोण लागू करके पौधे के अर्क में एंटीडायरेहिल प्रभाव के लिए जिम्मेदार बायोएक्टिव यौगिकों की खोज की अनुमति देना।

Protocol

1. पौधे का अर्क तैयार करना

  1. एक वयस्क पेड़ से Psidium guajava L. पत्ते30 इकट्ठा करें और निम्नानुसार प्रक्रिया करें: पत्तियों को 6 दिनों के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में सुखाएं, फिर 6 दिनों के लिए हवा में सुखाएं, फिर 40 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में फिर से सूखें 4 दिन, और अंत में सूखी पत्तियों को पीसकर पत्ती पाउडर तैयार करें एक पीस चक्की या कॉफी की चक्की में सूखी पत्तियां।
  2. 24 घंटे के लिए 96% इथेनॉल के 1 एल में सूखे पाउडर के 100 ग्राम को मैक्रट करें, एक प्रकार के बरतन का उपयोग करके लगातार सरगर्मी के साथ। पौधे के अवशेषों को एक बार फिर उसी प्रक्रिया के अधीन करें और 40 डिग्री सेल्सियस पर कम दबाव (175 मिलीबार) के तहत वैक्यूम रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करके सूखापन के लिए परिणामी छानना वाष्पित करें।
  3. वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इथेनॉल में पौधे के अर्क को भंग करें। सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करके इष्टतम एकाग्रता (यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके) निर्धारित करें।
    1. पौधे के अर्क के लिए, 100 μg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL की एकाग्रता सीमा का परीक्षण करें और उन लोगों का उपयोग करें जो मक्खी की उत्तरजीविता दर को प्रभावित नहीं करते हैं। शुद्ध यौगिकों के लिए, सांद्रता की निम्न श्रेणी का परीक्षण करें: 0.05, 0.5, 5 और 50 मिमी12.

2. भोजन माध्यम तैयार करना

  1. आसुत जल के 100 एमएल उपाय और चीनी के 4 ग्राम और अगर के 0.8 ग्राम ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ बीकर में डालना. 100 डिग्री सेल्सियस (सरगर्मी करते समय) तक गरम करें और 10 मिनट के लिए पकड़ें।
  2. तापमान को 80 डिग्री सेल्सियस तक कम करें, सरगर्मी करते हुए 7.4 ग्राम आटा और 2.8 ग्राम खमीर जोड़ें। कम से कम 20 मिनट के लिए गरम करें, फिर भी तापमान को हिलाएं और नियंत्रित करें जो लगभग 80 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए।
  3. मोल्डेक्स-प्रोपियोनिक एसिड समाधान (मोल्डेक्स के 1 एमएल और 0.3 ग्राम प्रोपियोनिक एसिड मिश्रण) को अच्छी तरह मिलाएं। तापमान के लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक गिरने की प्रतीक्षा करें, पौधे निकालने का घोल (1 मिलीग्राम/एमएल) और 0.5 ग्राम ब्रोमोफेनॉल नीला पाउडर डालें।
    नोट: कृपया परीक्षण किए जाने वाले अन्य सांद्रता के बारे में अधिक जानकारी के लिए खंड 1.3.1 देखें।
  4. पेट्री व्यंजन में भोजन डालो और बंद करो जब पेट्री पकवान (चित्रा 1 ए) भरा है. पेट्री व्यंजन कमरे के तापमान (लगभग 3 घंटे) को ठंडा करने के लिए अनुमति दें, तो ढक्कन बंद करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में दुकान.
    नोट: पेट्री व्यंजन पानी के वाष्पीकरण से बचने के लिए 2 सप्ताह से अधिक नहीं फ्रिज में संग्रहित किया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: फेकल जमा परीक्षण के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का प्रदर्शन। (ए) खाद्य माध्यम से भरा पेट्री व्यंजन दिखा छवि। पेट्री डिश में पर्याप्त भोजन करना सुनिश्चित करें, ताकि कोई अंतराल मक्खियों को फँसाए और उन्हें आगे बढ़ने से रोक सके। हालांकि, भोजन के साथ पेट्री डिश अधिभार नहीं है ताकि सतह समान रूप से कवर किया जा सकता है. (बी) स्पैटुला की छवि जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। (सी)प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में मल जमा परीक्षण की छवि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. मक्खियों की तैयारी

  1. CO2 टैंक, CO2 ब्लो गन को सुई, फ्लाई पैड, पेंटब्रश और माइक्रोस्कोप के साथ तैयार करें। फ्लाई स्टेशन फ्लाई पैड और ब्लो गन दोनों को CO2 की आपूर्ति करता है। फ्लाई पैड का उपयोग मक्खियों को छांटने के लिए किया जाता है, जबकि सीओ2 ब्लो गन का उपयोग शीशियों, बोतलों और पेट्री डिश में मक्खियों को एनेस्थेटाइज करने के लिए किया जाता है।
  2. प्यूपा (कम से कम 10) वाली शीशियों का चयन करके मक्खियों की उम्र को मानकीकृत करें और निम्नलिखित विधि का उपयोग करके ट्यूब से वयस्कों की मक्खियों को त्याग दें। एक-एक करके, शीशियों को उल्टा कर दें और कपास प्लग और शीशी के फुटपाथ के बीच सुई डालें। सीओ2 ब्लो गन के साथ वयस्क मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें जब तक कि सभी मक्खियों को कपास प्लग पर सो न जाएं (उन्हें एनेस्थेटाइज करने के लिए कुछ सेकंड की आवश्यकता होती है, और ब्लो गन जारी करने के बाद संवेदनाहारी कार्रवाई कुछ सेकंड तक चलेगी)। 70% इथेनॉल युक्त एक कांच की बोतल के ऊपर शीशी खोलें और इसे में मक्खियों ड्रॉप. कपास प्लग के साथ शीशी बंद करें और 60% आर्द्रता के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें. इनक्यूबेटर के प्रकाश चक्र को 12 घंटे प्रकाश/12 घंटे अंधेरे पर सेट करें।
  3. इनक्यूबेशन (अधिकतम 8 घंटे) के बाद, उन्हें माइक्रोस्कोप के तहत कुंवारी महिलाओं और पुरुषों में क्रमबद्ध करें और उन्हें अपनी पीठ पर घुमाकर और उनके जननांगों को देखकर पैड को फ्लाई पैड करें।
    1. पुरुष जननांग की तुलना में महिला जननांग पीले होते हैं, जो लाल रंग के होते हैं। पुरुषों को उनके पैरों की सामने की जोड़ी पर गहरे रंग के ब्रिसल्स की उपस्थिति से भी पहचाना जा सकता है, जिन्हें सेक्स कॉम्ब्स कहा जाता है। दो ताजा ट्यूबों (पुरुषों के लिए एक और महिलाओं के लिए एक) में मक्खियों को विभाजित करें और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर 6-8 दिनों के लिए सेते हैं।
      नोट: 25 डिग्री सेल्सियस पर, मादाएं अंडे सेने के बाद लगभग 8 घंटे तक कुंवारी रहती हैं।

4. फेकल जमा परीक्षण

  1. पेट्री व्यंजन के बीच भ्रम से बचने के लिए इसी तनाव, सेक्स और दवा के साथ पेट्री व्यंजन लेबल करें। एक दूसरे के ऊपर पेट्री व्यंजन ढेर.
  2. रंगे भोजन युक्त पेट्री व्यंजन प्राप्त करें और अतिरिक्त तरल को अवशोषित करने के लिए सोख्ता कागज पर उन्हें रिवर्स. एक स्पैटुला (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके, भोजन को 12 बराबर भागों में काट लें और फिर एक खाली पेट्री डिश में एक टुकड़ा डालने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें।
    नोट: प्रतिकृति की संख्या के आधार पर, कटौती की जा करने के लिए स्लाइस की संख्या पेट्री डिश प्रति 20 तक बढ़ाया जा सकता है। प्रत्येक टुकड़ा एक ही आकार का होना चाहिए।
  3. CO2 के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज़ करें जब तक कि सभी मक्खियाँ कपास प्लग पर सो न जाएँ। प्रत्येक पेट्री डिश (चित्रा 1 सी) में छह स्वस्थ मक्खियों को स्थानांतरित करें, और तुरंत ढक्कन बंद करें, फिर उन्हें इनक्यूबेटर (25 डिग्री सेल्सियस, 60% आर्द्रता, 12 एच प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे) में रखें।
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोग के दौरान मक्खियों पेट्री डिश से बच नहीं है, एक टेप के साथ पेट्री डिश के ऊपर और नीचे कवर देते हैं. प्रत्येक परीक्षण समूह के लिए, छह दोहराने पेट्री व्यंजन (कम से कम) तैयार करें।
  5. मक्खियों को 24 घंटे के लिए पीछे की अनुमति देने के बाद, उन्हें संवेदनाहारी करने के लिए सीओ2 का उपयोग करें, मक्खियों को 70% इथेनॉल से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें, और किसी भी शेष भोजन का निपटान करें।
  6. पेट्री व्यंजन रखें और चरण 5 पर आगे बढ़ें।

5. पेट्री व्यंजन की मात्रा का ठहराव

  1. कंप्यूटर पर एक फ़ोल्डर सेट करें और प्रयोग तनाव नाम, मक्खियों के लिंग और उपयोग की जाने वाली दवाओं के प्रकार को शामिल करके इसका नाम बदलें। इस फ़ोल्डर के भीतर, मूल, कट और विश्लेषण नाम के सबफ़ोल्डर बनाएं।
  2. एक 6,400 पिक्सेल प्रति इंच (पीपीआई) ऑप्टिकल संकल्प के साथ एक उच्च संकल्प स्कैनर का उपयोग करके पेट्री व्यंजन स्कैन. स्कैनर क्षेत्र के बीच में उन्हें व्यक्तिगत रूप से रखकर अलग से प्रत्येक पेट्री डिश के ऊपर और नीचे कवर को स्कैन करें।
  3. कंप्यूटर पर इंस्टॉल किए गए एप्लिकेशन को खोलें। सभी सामान्य सेटिंग्स (चित्रा 2 ए) के साथ कंप्यूटर स्क्रीन पर एक स्वागत विंडो खुल जाएगी।
    नोट: उन्नत सेटिंग्स को संशोधित न करें। यह चरण केवल उन उपयोगकर्ताओं के लिए मान्य है जिनके पास सामग्री तालिका में प्रस्तावित समान स्कैनर है। यदि किसी अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं तो कृपया दिशानिर्देश देखें।
    1. आवेदन में पेट्री डिश का नाम, अनुक्रम संख्या, ऊपर या नीचे कवर, लिंग, और इस्तेमाल किया भोजन के प्रकार सहित द्वारा. चरण 5.1 में सबफ़ोल्डर मूल सेट का चयन करें।
    2. पेट्री डिश पूर्वावलोकन करें. विंडो के नीचे पूर्वावलोकन पर क्लिक करें, स्कैनर को प्री-स्कैन करने के लिए कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें, फिर कंप्यूटर स्क्रीन पर एक विंडो दिखाई देती है। पेट्री डिश चारों ओर स्क्रीन पर प्रदर्शित वर्ग ले जाएँ.
    3. कंप्यूटर स्क्रीन पर विंडो के नीचे दाईं ओर स्कैन पर क्लिक करें, स्कैन स्वचालित रूप से पसंद के फ़ोल्डर में एक छवि के रूप में सहेजा जाता है।
  4. एक एप्लिकेशन (जैसे, ओपन-सोर्स फिजी एप्लिकेशन) का उपयोग करके छवि को क्रॉप करें, ताकि कोई कलाकृतियों और खाद्य अवशेषों को जमा के रूप में न माना जाए।
    नोट:: निम्न चरणों केवल फिजी अनुप्रयोग है जो उपयोगकर्ताओं के लिए मान्य हैं। यदि किसी अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं तो कृपया दिशानिर्देश देखें।
    1. फिजी एप्लिकेशन खोलें, स्क्रीन पर टूलबार दिखाई देने तक कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें।
    2. छवि को काट-छाँट करने के लिए उपकरण पट्टी पर खींचें. टूलबार में तीसरे आइकन बहुभुज चयन का चयन करें, पाई चार्ट (आंकड़े 2B-1,2) के चारों ओर एक कोण को चिह्नित करने के लिए स्क्रीन पर क्लिक करके फोटो के अवांछित हिस्से (रंगीन पाई चार्ट) को क्रॉप करें।
      नोट: एक छवि के भीतर फसल क्षेत्र को चित्रित करते समय, यह जरूरी है कि चुने गए फ्रेम मूल रूप से एंड-टू-एंड जुड़े हों।
    3. बार के ऊपर बाईं ओर संपादित करें पर क्लिक करें और फिर बाहर भरें/साफ़ करें (चित्र 2B-3) पर क्लिक करें।
    4. फोटो को सेव करने के लिए, बार के ऊपर बाईं ओर फ़ाइल पर क्लिक करें, फिर सेव अस पर और अंत में टिफ़ पर क्लिक करें। चरण 5.1 में कट सेट सबफ़ोल्डर चुनें।
      नोट: क्रॉप की गई छवि को सहेजते समय, सुनिश्चित करें कि फ़ाइल नाम में कोई विशेष वर्ण (जैसे, !, &, $, #, _,-,...) या बहुत अधिक वर्ण मौजूद नहीं हैं।

Figure 2
चित्रा 2: फेकल जमा परीक्षण से डेटा का विश्लेषण करने की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम। (ए) स्कैन एप्लिकेशन की सेटिंग जानकारी दिखाने वाला स्क्रीनशॉट। (बी) छवियों को फिजी एप्लिकेशन का उपयोग करके क्रॉप किया गया। सुनिश्चित करें कि कोई कलाकृति और खाद्य अवशेष जमा नहीं माना जाता है। (C) स्क्रीनशॉट दिखा रहा है कि Excel_merge-v4 एप्लिकेशन खोलते समय यह कैसा दिखता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. गोबर ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर के अंतिम पाठक का उपयोग करके फेकल जमा पहचान

नोट: गोबर सॉफ्टवेयर के अंतिम पाठक का परिचय और उपयोग पूरक फ़ाइल 1 में पाया जा सकता है।

  1. सबसे पहले, T.U.R.D. सॉफ्टवेयर खोलें (पूरक चित्रा 1)। एक नया प्रयोग बनाएं और दस्तावेज़ को एक नाम दें, फिर इसे चरण 5.1 में सेट किए गए सबफ़ोल्डर विश्लेषण में सहेजें।
  2. Plates पर क्लिक करें और फिर Add plate पर। पेट्री डिश संसाधित किया जा का चयन करें. चयनित प्लेटों और नए मापदंडों के नाम के साथ एक नई विंडो दिखाई देती है। ब्लॉक आकार, ऑफ़सेट, न्यूनतम आकार और अधिकतम आकार सेट करें (पूरक चित्रा 2)।
  3. यह सत्यापित करने के लिए कि पता चला फेकल जमा सही हैं, प्लेट्स पर क्लिक करें, फिर चयनित प्लेटों का निरीक्षण करें, फिर ग्राफिक्स, और एनोटेट की गई छवियों को देखें (पूरक चित्रा 3)। ज़ूम इन करें और काउंट्स देखें। यदि केवल कुछ जमा हैं जिन्हें विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए, तो बाहर किए जाने वाले जमाओं को अचयनित करें (अनुपूरक चित्रा 4)।
  4. प्रत्येक नई छवि को संसाधित करने के लिए, चरण 6.3 से पुनरारंभ करें।
  5. T.U.R.D. सॉफ़्टवेयर के साथ प्लेटों का विश्लेषण करने के बाद, नहीं पर क्लिक करके मक्खियों की संख्या को संशोधित करें । मक्खियों (अनुपूरक चित्रा 5)।
  6. Plates > Edit groups > Add पर क्लिक करके Group Name को संशोधित करें, और फिर Group कॉलम पर, Group Name चुनें।
  7. विश्लेषण > वर्णनात्मक सांख्यिकी > समूह का चयन करें (अनुपूरक चित्रा 6) पर क्लिक करके अलग-अलग प्रतिकृति डेटा को अलग से निर्यात करें। सभी स्प्रेडशीट फ़ाइलों (.csv) को एक ही फ़ोल्डर में रखें।
  8. एक अद्वितीय स्प्रेडशीट में सभी फाइलों (चरण 6.7 में प्राप्त) को इकट्ठा करने के लिए, एप्लिकेशन Excel_merge-v4 (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) खोलें, निम्न वाक्य दिखाई देने तक प्रतीक्षा करें फ़ोल्डर के पथ का चयन करें (.csv फ़ाइलों के साथ):, और फिर उपरोक्त फ़ोल्डर पते को पेस्ट करें। उदाहरण के लिए, पथ C:\Experiment\Fecal जमा परीक्षण हो सकता है, फिर कीबोर्ड (चित्रा 2C) पर दो बार दर्ज करें पर क्लिक करें। उसके बाद, उसी फ़ोल्डर में एक नई स्प्रेडशीट फ़ाइल बनाई जाती है। नई स्प्रेडशीट फ़ाइल में विभिन्न शीट्स में सभी निर्यात की गई फ़ाइलें शामिल हैं।
  9. पिछली स्प्रेडशीट फ़ाइल में, सभी प्रतिकृतियों के प्रत्येक पैरामीटर का माध्य एकत्रित करने के लिए एक अन्य पत्रक जोड़ें (डेटा संसाधित करने के लिए VLOOKUP फ़ंक्शन का उपयोग करें). एक उदाहरण अनुपूरक तालिका 1 में दिया गया है।
  10. पी-वैल्यू का विश्लेषण करें।

Representative Results

यहां प्रस्तुत अध्ययन से पता चलता है कि डी. मेलानोगास्टर में दस्त की माप फेकल जमा परख के उपयोग के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है। फेनोटाइप (डायरिक या नहीं) के बीच महत्वपूर्ण अंतर विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण करके निर्धारित किया जा सकता है, जिसमें फेकल जमा की संख्या, जमा का कुल क्षेत्र, जमा का औसत क्षेत्र, औसत हल्कापन और कुल एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (आईओडी) शामिल है, जो जमा में मौजूद डाई की कुल मात्रा का एक उपाय है और कुल फेकल सामग्रीसामग्री 27 का प्रतिनिधित्व करता है।

मक्खियों में आईटीपी जीन दस्तक एक डायरिया फेनोटाइप को प्रेरित कर सकता है, जो शौच की आवृत्ति में वृद्धि की विशेषता है, जिससे उन्हें दस्त29 का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल बना दिया जा सकता है। इस प्रयोग के संदर्भ में, ITPi स्ट्रेन (w1118; डॉटरलेस-जीनस्विच, UAS-ITPi /(CyO)) को एक मानक माध्यम पर नियोजित और पाला गया था। Psidium guajava पत्तियों के अर्क को एंटीडायरेहिल हस्तक्षेप के रूप में चुना गया था, दस्त का प्रबंधन करने के लिए उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में इस पौधे के व्यापक उपयोग को देखते हुए। क्रोफेलेमर, एक एंटीडायरेहियल एजेंट, अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी31 से गुजरने वाले एचआईवी / एड्स के साथ वयस्क रोगियों में गैर-संक्रामक दस्त के लिए रोगसूचक राहत प्रदान करने के लिए अनुमोदित किया गया था। Crofelemer Croton lechleri Müll.Arg के लेटेक्स से एक अर्क है। तने की छाल32. लोपरामाइड एक सिंथेटिक दवा है जिसका उपयोग दुनिया भर में दस्त33 के इलाज के लिए किया जाता है। क्रोफेलेमर और लोपरामाइड दोनों का उपयोग संभावित सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।

परिकल्पना यह थी कि पी. गुजावा अर्क, क्रोफेलेमर और लोपरामाइड के साथ मक्खियों को खिलाने से सामान्य भोजन से खिलाए गए लोगों की तुलना में डायरेरिक फेनोटाइप कम हो जाएगा। इस परिकल्पना की जांच करने के लिए, सामान्य भोजन के साथ खिलाया मक्खियों और पी. guajava निकालने के साथ खिलाया उन लोगों के बीच कई मापदंडों की तुलना करके डी. melanogaster में fecal जमा का एक माप प्रदर्शन किया गया था (1 ग्राम/100 एमएल), क्रोफेलेमर (1 ग्राम/100 एमएल), और लोपरामाइड (10 मिमी). प्रयोग सेटअप के लिए, 6-7 दिनों के कुंवारी महिलाओं या पुरुषों का उपयोग किया गया था। प्रत्येक पेट्री डिश में छह मक्खियाँ थीं, और छह प्रतिकृतियाँ की गईं। मक्खियों को 24 घंटे के लिए पाला गया था, और फिर प्रत्येक समूह का विश्लेषण किया गया था। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग परीक्षण समूह के बीच महत्वपूर्ण अंतर की तुलना करने के लिए किया गया था। परिणाम बताते हैं कि फेकल जमा की संख्या(चित्रा 3ए)जमा का कुल क्षेत्र(चित्रा 3बी)और कुल आईओडी(चित्रा 3सी)पी. गुजावा निकालने (1 ग्राम/100 एमएल) समूह की तुलना में सामान्य खाद्य समूह में काफी अधिक मूल्यों का प्रदर्शन किया, कुंवारी महिलाओं और पुरुषों दोनों में। दुर्भाग्य से, लोपरामाइड ने दोनों लिंगों में कोई प्रभाव नहीं दिखाया (लेकिन यह पहले से ही प्रदर्शित किया गया था कि यह डी. मेलानोगास्टर में एक एंटीस्पास्मोडिक एजेंट के रूप में कार्य करता है)34 जबकि क्रोफेलेमर का प्रभाव केवल महिलाओं पर था।

Figure 3
चित्रा 3: आईटीपीआई तनाव विश्लेषण। ITPi तनाव का विश्लेषण चार स्थितियों के तहत किया गया था: सामान्य भोजन पर खिला, 1 ग्राम / 100 एमएल पी गुजावा निकालने, 1 ग्राम / 100 एमएल क्रोफेलेमर, और 10 मिमी लोपरामाइड के साथ पूरक भोजन। डेटा दोनों महिलाओं और पुरुषों (एक पेट्री डिश के दो पक्षों के छह प्रतिकृतियों के लिए) में प्रत्येक हालत के एसडी मतलब ± के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण दो समूहों की तुलना में एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। पी-मान निम्नानुसार दिखाए जाते हैं: *: पी < 0.05; **: पी < 0.01; : पी < 0.001, ****: पी < 0.0001। (ए) आईटीपीआई स्ट्रेन के फेकल जमा की संख्या की तुलना 1 ग्राम/100 एमएल क्रोफेलेमर, 10 एमएम लोपरामाइड, 1 ग्राम/100 एमएल पी गुजावा निकालने और सामान्य भोजन के साथ खिलाए गए मक्खियों में की गई थी। इसके अतिरिक्त, कुंवारी महिलाओं और पुरुषों के बीच फेकल जमा की संख्या में अंतर का भी विश्लेषण किया गया था। दोनों समूहों में, 1 ग्राम / 100 एमएल पी गुजावा निकालने के साथ खिलाए गए लोगों की तुलना में सामान्य भोजन के साथ खिलाए गए मक्खियों में फेकल जमा की संख्या काफी अधिक थी। (बी) आईटीपीआई स्ट्रेन के फेकल जमा के कुल क्षेत्र की तुलना सामान्य भोजन के साथ खिलाए गए मक्खियों में और 1 ग्राम / 100 एमएल पी गुजावा निकालने, 1 ग्राम / 100 एमएल क्रोफेलेमर, और 10 एमएम लोपरामाइड के साथ पूरक भोजन के साथ खिलाए गए मक्खियों में की गई थी। पुरुषों और महिलाओं में, फेकल जमा का कुल क्षेत्र 1 ग्राम / 100 एमएल पी गुजावा निकालने के साथ खिलाए गए लोगों की तुलना में सामान्य भोजन के साथ खिलाए गए मक्खियों में काफी अधिक था। (सी) आईटीपीआई तनाव के कुल आईओडी में अंतर का विश्लेषण सामान्य भोजन पर खिलाई गई मक्खियों और 1 ग्राम / 100 एमएल पी गुजावा निकालने, 1 ग्राम / 100 एमएल क्रोफेलेमर, और 10 मिमी लोपरामाइड के साथ पूरक भोजन पर खिलाए गए मक्खियों के बीच किया गया था। पुरुषों और महिलाओं में, कुल आईओडी 1 ग्राम / 100 एमएल पी के साथ खिलाए गए मक्खियों की तुलना में सामान्य भोजन के साथ खिलाए गए मक्खियों में काफी अधिक था। संक्षिप्ताक्षर: F = महिला; एम = पुरुष; क्रोफ = क्रोफेलर; लोप = लोपरामाइड; न ही भोजन = सामान्य भोजन; P. gua ext = Psidium guajava अर्क। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यह प्रदर्शित करने के लिए कि पी में मनाया कम उत्सर्जन guajava निकालने समूह निकालने के निरोधात्मक प्रभाव के कारण है और नहीं एक कम भोजन की खपत के लिए, हम प्रत्यक्ष सेवन अनुमान और ठोस खाद्य खपत की ट्रैकिंग प्रदर्शन (DIETS) विधि35. परिणामों से पता चला कि पुरुषों में लोपरामाइड को छोड़कर, दवा-आपूर्ति समूहों और दवाओं के बिना भोजन की खपत में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जिसके कारण मक्खियों ने सामान्य से कम भोजन का उपभोग किया (चित्र 4)।

Figure 4
चित्रा 4: फीडिंग परख। खिला परख मक्खियों में ठोस भोजन की खपत को मापा। मक्खियों को चार अलग-अलग माध्यमों से खिलाया गया: 1 ग्राम/100 एमएल पी. गुजावा अर्क, 1 ग्राम/100 एमएल क्रोफेलेमर, 10 एमएम लोपरामाइड और सामान्य भोजन। प्रत्येक समूह में पांच प्रतिकृतियों के साथ 20 मक्खियाँ शामिल थीं। डेटा को महिलाओं और पुरुषों दोनों में प्रत्येक स्थिति के एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण दो समूहों की तुलना में एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। पी-मान निम्नानुसार दिखाए जाते हैं: *: पी < 0.05; **: पी < 0.01; : पी < 0.001, ****: पी < 0.0001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फेकल जमा और खिला परख के परिणामों से पता चला है कि पी. गुजावा का अर्क फल मक्खियों में दस्त के इलाज के लिए एक विश्वसनीय औषधीय पौधा है।

अनुपूरक चित्र 1: T.U.R.D. ओपनिंग विंडो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2: समायोजित की जाने वाली सेटिंग्स के साथ T.UR.D. विंडो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: एक एनोटेट छवि के साथ टीयूआरडी विंडो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: टीयूआरडी विंडो पहले से संसाधित छवि से प्रत्येक पता लगाया स्पॉट प्रस्तुत करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: टीयूआरडी विंडो प्रत्येक संसाधित छवि पेश करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 6: टीयूआरडी विंडो प्रत्येक समूह के लिए डेटा निर्यात करने की प्रक्रिया दिखा रही है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: T.U.R.D. सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए त्वरित दिशानिर्देश। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: विश्लेषण के लिए तैयार अंतिम स्प्रेडशीट का उदाहरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: स्प्रेडशीट मर्ज करने के लिए आवेदन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

डी. मेलानोगास्टर को व्यापक रूप से विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के लिए एक मॉडल के रूप में स्वीकार किया गया है क्योंकि डी. मेलानोगास्टर और मनुष्यों के बीच जीन में समानता के कारण36. आंत्र पथ का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में डी. मेलानोगास्टर का उपयोग प्रचलित है और टीयूआरडी के आवेदन का उपयोग फेकल जमा की संख्या, क्षेत्र और मात्रा का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। हालांकि, फल मक्खियों में दस्त का आकलन करने के लिए फेनोटाइपिक डिटेक्शन विधि का उपयोग नहीं किया गया है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल फेकल जमा का पता लगाकर दस्त की उपस्थिति का मोटे तौर पर आकलन करने के लिए एक नई विधि का परिचय देता है।

फेकल जमा आंत्र पथ समारोह और स्वास्थ्य37 का एक आवश्यक संकेतक हैं. इस संदर्भ में, फेकल जमा के विभिन्न मापदंडों की जांच करने के लिए दवा-निहित माध्यम पर डी. मेलानोगास्टर को पालने के लिए एक विधि प्रस्तावित है। जमा की संख्या की निगरानी करके, शौच की आवृत्ति निर्धारित करना और यह आकलन करना संभव है कि किसी दवा का आंतों के संक्रमण पर कोई प्रभाव पड़ता है या नहीं। जमा के कुल क्षेत्र को फेकल पदार्थ की एकाग्रता और कमजोर पड़ने का मूल्यांकन करने के लिए मापा जा सकता है, जो आंत्र पथ के समग्र स्वास्थ्य को निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। इसके अलावा, कुल एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (आईओडी) का उपयोग जमा में मौजूद फेकल सामग्री की कुल मात्रा का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल दवाओं के साथ-साथ आंतों के मार्ग को प्रभावित करने वाले पौधों के अर्क की जांच और मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करता है। जब डी. मेलानोगास्टर का उपयोग एक मॉडल जीव के रूप में किया जाता है, तो संभावित दवाओं की प्रभावकारिता का आकलन करना संभव है, जो दवा की खोज प्रक्रिया में तेजी लाने में मदद कर सकता है। पौधों के अर्क पर इस पद्धति को लागू करके, शोधकर्ता एंटीडायरेहिल एजेंटों के रूप में उनके उपयोग को मान्य करने में मदद कर सकते हैं।

वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कर रहे हैं में fecal जमा का अध्ययन करने के लिए डी. मेलानोगास्टर. सबसे पहले, माध्यम में दवा की वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक द्रव्यमान की गणना करना आवश्यक है। इसके अलावा, दवा को माध्यम में जोड़ते समय अच्छी तैयारी की स्थिति सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि उच्च तापमान दवा को नीचा दिखा सकता है और इसकी शक्ति को प्रभावित कर सकता है। दूसरा, मादा मक्खियों का चयन इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण है. कुंवारी और संभोग मादाओं के बीच फेकल उत्पादन में अंतर से बचने के लिए कुंवारी मादा मक्खियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, कुंवारी महिलाओं द्वारा उत्पादित धब्बे संभोग मादाओं की तुलना में अधिक गोलाकार होते हैं, और संभोग मादाएं कुंवारी महिलाओं की तुलना में अधिक फेकल सामग्री का उत्सर्जन करती हैं27,28. इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी एकत्र महिलाओं कुंवारी हैं बाड़े के 8 घंटे से पहले मक्खियों को इकट्ठा करने की सिफारिश की है. इसके अतिरिक्त, परीक्षण की गई मक्खियों को मजबूत और स्वस्थ होना चाहिए, क्योंकि उनका स्वास्थ्य भोजन का सेवन और फेकल उत्पादन को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, पंखों के असामान्य आकार वाली मक्खियों को भोजन प्राप्त करने में कठिनाई हो सकती है। अंत में, T.U.R.D. का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए, ब्लॉक आकार (पिक्सेल) और ऑफ़सेट सेटिंग्स महत्वपूर्ण हैं। छवियों के प्रकाश विपरीत में अंतर के कारण, फेकल जमा की सर्वोत्तम संभव पहचान प्राप्त करने के लिए विभिन्न सेटिंग्स का प्रयास करना आवश्यक हो सकता है।

यद्यपि प्रस्तुत विधि प्रभावी है, कई सीमाएँ हैं। एक माध्यम में दवा एकाग्रता की सटीकता है। चूंकि तैयारी के दौरान माध्यम को गर्म किया जाता है, कुछ पानी वाष्पित हो सकता है, जो दवा की एकाग्रता को प्रभावित कर सकता है। एक और सीमा पेट्री व्यंजन की स्कैनिंग है. पेट्री व्यंजन (यानी, किनारों) के कुछ हिस्सों को स्कैन नहीं किया जाता है, और इसके परिणामस्वरूप कुल फेकल जमा का गलत अनुमान हो सकता है। इसके अलावा, मक्खियों पेट्री व्यंजन के ऊपर और नीचे कवर पर fecal जमा की एक ही राशि का उत्पादन नहीं करते. क्योंकि वे नीचे के कवर पर अधिक जमा का उत्पादन करते हैं, ऊपर और नीचे के कवर के बीच विश्लेषण का मानक विचलन अधिक हो सकता है, जो परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, शोधकर्ताओं में दस्त का अध्ययन कर सकते हैं डी. मेलानोगास्टर. दवा युक्त माध्यम को संशोधित करके, इस विधि का उपयोग एंटीडायरेहिल पौधों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, जो दवा की खोज के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है। गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों सहित विभिन्न बीमारियों के इलाज के लिए सदियों से पारंपरिक चिकित्सा और प्राकृतिक उत्पादों का उपयोग किया जाता रहा है। फेकल जमा पर पौधे के अर्क की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आंतों के पथ के विकारों के लिए संभावित नए उपचार की पहचान की जा सकती है और एंटीडायरेहिल एजेंटों के रूप में उनके उपयोग के लिए एक वैज्ञानिक तर्क प्रदान किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण दवा की खोज और नृवंशविज्ञान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण योगदान प्रदान कर सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम ड्रोसोफिला उपभेदों के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ मार्टिना गैलिकोवा धन्यवाद. हम अपने अध्ययन पर प्रतिक्रिया देने और हमारे मॉडल को बेहतर बनाने में हमारी मदद करने के लिए मिशेल क्रोज़ेटियर-बोर्डे और मार्क हेनलिन टीम के आभारी हैं। हम दवा क्रोफेलेमर प्रदान करने के लिए नापो फार्मास्यूटिकल्स कंपनी को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक इस प्रोटोकॉल को प्रकाशित करने का अवसर प्रदान करने के लिए अतिथि संपादक डॉ ह्यूजेस पेटिटजेन के भी आभारी हैं। इस अध्ययन को परियोजना ANR-22-CE03-0001-01 के तहत एजेंस नेशनेल डे ला रिचर्चे (ANR) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical & Food medium
Agar Sigma Aldrich A7002 5 Kg bucket
Bromophenol blue Sigma Aldrich 34725-61-6 B5525-25G
Corn flour Nature et Cie *910007 25 Kg bag
Crofelemer Napo pharmaceuticals - -
Ethanol 96% - - -
Loperamide Sigma Aldrich L4762 5 grams
Moldex VWR 1.06757.5000 5 Kg bag
Propionic acid Dutscher 409553-CER 1 Liter bottle
Sugar Pomona EpiSaveurs 52705 1 Kg bag
Yeast Dutscher 789195 10 Kg bag
Materials
Beaker DWK LIFE SCIENCE - 250 mL
Centrifugation tube Eppendorf 30119401 Eppendorf tubes  5.0 mL
CO2 tank - - -
Erlen Meyer flask - - 500 mL (for extraction)
Filter paper grade Whatman - 3 mm chr.
Flowbuddy socle Genesis - -
Flugs Narrow Plastic vials Genesis 49-102 -
Flystuff Blow gun Genesis - -
Flystuff Ultimate Flypad Genesis - -
Flystuff Foot pedal Genesis - -
Forceps Dumostar 11295-51 -
Graduated cylinder - - 100 mL
Inox spatula - - -
Micropipette Eppendorf 4924000088 Eppendorf Reference 2
Micropipette tip Eppendorf 30000919 epT.I.P.S. Standard
Narrow Drosophila vials Genesis 32-120 -
Paintbrush - - -
Petri dish Greiner 628162 Size: 60 x 15mm
Round-bottom flask - - 500 mL (for evaporation)
Thermometer Avantor 620-0916
Whisk - - -
Equipments
Chiller HUBER Minichiller -
Heating bath BÜCHI B-490 -
Heating plate BIOBLOCK SCIENTIFIC - Magnetic stirrer hot plate
Incubator Memmert - HPP110eco
Rotary evaporator BÜCHI R-200 -
Scanner Epson V850 pro -
Shaker Edmund Bühle KS 10 -
Stereomicroscope binocular Zeiss Stemi 305 -
Vacuum pump VACUUBRAND PC500 series -
Vortex mixer Sigma Aldrich CLS6776-1EA Corning LSE vortex mixers
Weighing scale OHAUS Scout SKX622 -

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References

  1. Cheng, L. K., et al. Gastrointestinal system. WIREs Sys Bio Med. 2 (1), 65-79 (2010).
  2. Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D. Gastrointestinal physiology and function. Handb Exp Pharmacol. 239, 1-16 (2017).
  3. Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
  4. Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
  5. Abraham, B., Sellin, J. H. Drug-induced diarrhea. Curr Gastroenterol Rep. 9 (5), 365-372 (2007).
  6. Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
  7. Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
  8. Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
  9. Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
  10. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  11. Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
  12. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  13. Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
  14. Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  15. Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
  16. Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
  17. Perveen, S., Al-Taweel, A. Pharmacognosy: Medicinal Plants. IntechOpen. , (2019).
  18. Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
  19. Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
  20. Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
  21. Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
  22. van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
  23. Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
  24. Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
  25. Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
  26. Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
  27. Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
  28. Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
  29. Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
  30. Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
  31. Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
  32. Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
  33. Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
  34. Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
  35. Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
  36. Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
  37. Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).

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<em>ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> पर एंटीडायरेहिल ड्रग्स और प्लांट एक्सट्रैक्ट्स के प्रभाव का आकलन
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Liu, C., Chassagne, F. Assessment of … More

Liu, C., Chassagne, F. Assessment of The Effect of Antidiarrheal Drugs and Plant Extracts on Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (201), e65877, doi:10.3791/65877 (2023).

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