Summary
Aqui, um método é descrito para alimentar Drosophila melanogaster com drogas e extratos de plantas e avaliar seu efeito no trato gastrointestinal através da análise dos depósitos fecais de moscas-das-frutas. As moscas tratadas com drogas podem ser usadas como modelo para futuras pesquisas.
Abstract
Para estudar a fisiologia gastrointestinal humana, os cientistas biomédicos confiaram no uso de organismos modelo. Embora muitos pesquisadores tenham usado camundongos como modelo para estudar a função intestinal, apenas alguns relatos se concentraram em Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Comparadas aos camundongos, as moscas-das-frutas apresentam muitas vantagens, como ciclo de vida curto, manutenção simples e econômica, e sem problemas éticos. Além disso, a fisiologia, anatomia e vias de sinalização gastrointestinais de mamíferos são altamente conservadas em D. melanogaster. Extratos de plantas têm sido usados tradicionalmente para tratar diarreia e constipação. Por exemplo, Psidium guajava (P. guajava) é um dos agentes antidiarreicos mais conhecidos nos trópicos. No entanto, nenhum estudo avaliou o efeito de drogas antidiarreicas, laxantes e extratos de plantas em D. melanogaster, e permanece desconhecido se efeitos semelhantes (por exemplo, depósitos fecais menores, mais concentrados e menos abundantes no caso de drogas antidiarreicas) podem ocorrer nas moscas-das-frutas em comparação com mamíferos. Neste estudo, um efeito antidiarreico induzido por P. guajava é demonstrado em uma cepa de D. melanogaster que apresenta fenótipo diarreico. A amostragem fecal produzida pelas moscas é monitorada usando um alimento suplementado com corante. Esse protocolo descreve o método utilizado para o preparo dos alimentos com medicamentos, avaliação dos depósitos fecais das moscas alimentadas com essas preparações alimentares e interpretação dos dados obtidos.
Introduction
O trato gastrointestinal (GI), também chamado de trato digestivo, é responsável pela digestão e absorção de nutrientes e excreção de produtos não digeridos1. O trato gastrointestinal é vulnerável a uma série de distúrbios que podem causar desconforto, dor e interrupção da vida diária. Os distúrbios gastrointestinais incluem dor e desconforto abdominal, distensão abdominal, azia, indigestão ou dispepsia, náuseas, vômitos, diarreia e constipação2. A diarreia é o sintoma mais comum do distúrbio gastrointestinal3 e é definida como uma doença com pelo menos três fezes soltas e aquosas durante um período de 24 h4. A diarreia é causada por uma ampla gama de patógenos, incluindo bactérias, vírus, parasitas, fungos, e também pode ser causada por drogas 5,6. No mundo, a diarreia continua sendo a segunda causa de mortalidade em crianças menores de 5anos7. Embora a diarreia possa se resolver, também pode indicar uma condição subjacente mais grave se durar mais do que alguns dias.
Para estudar o trato intestinal, os pesquisadores recorrem a modelos animais como camundongos, ratos e porcos 8,9. No entanto, o uso desses animais pode ser caro e demorado, pois requerem instalações especializadas e considerações éticas. Estudos recentes têm demonstrado que D. melanogaster pode ser utilizada como modelo para estudar o trato gastrointestinal e investigar alguns mecanismos, como a manutenção da homeostase regenerativa, o desenvolvimento da senescência imunológica, a perda da função de barreira epitelial e o declínio da homeostase metabólica10,11. D. melanogaster, conhecida como mosca-da-fruta, compartilha um alto grau de homologia genética com os seres humanos; Acredita-se que aproximadamente 75% dos genes de doenças humanas tenham um homólogo funcional na mosca12. Eles também têm um sistema digestivo simples composto por um intestino anterior, um intestino médio e um intestino posterior13. D. melanogaster é de fácil cultivo em laboratório e pode ser geneticamente modificada de diferentes maneiras14. Portanto, o uso de D. melanogaster para testes in vivo é uma ferramenta poderosa que permite aos pesquisadores estudar processos biológicos complexos em um ambiente controlado.
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 80% das pessoas que vivem em países em desenvolvimento utilizam a medicina tradicional para suas necessidades primárias de saúde15. A alta utilização de plantas medicinais pode ser explicada pela facilidade de disponibilidade, baixo custo e poucos efeitos colaterais16. As principais partes da planta utilizadas na fitoterapia incluem folhas, cascas, raízes, sementes17, enquanto os principais métodos de preparo são a infusão, decocção e maceração18. Esses fitoterápicos contêm substâncias fitoquímicas como alcaloides, terpenóides, flavonoides, esteroides, taninos e carboidratos19, que têm efeitos terapêuticos no corpo humano. As pessoas utilizam uma variedade de plantas medicinais para tratar distúrbios gastrointestinais, como diarreia, dor de estômago e disenteria20. Por exemplo, Psidium guajava é uma das plantas mais usadas para tratar diarreia no mundo. Vários testes farmacológicos e clínicos já demonstraram sua segurança, o que o torna um bom candidato antidiarreico para estudo21,22. No entanto, as principais limitações dos fitoterápicos são a falta de avaliação de eficiência e segurança, bem como a falta de informações definitivas e completas sobre a composição dos extratos vegetais utilizados23. Para validar a eficácia e a segurança de fitoterápicos, é necessária uma abordagem sistemática envolvendo validação experimental e clínica e a abordagem deve ser apoiada por dados suficientes de estudos in vivo e in vitro.
Para avaliar a eficácia dos remédios tradicionais no tratamento da diarreia, o uso de camundongos e ratos tem sido predominante nas últimas décadas24,25. Devido às principais vantagens citadas anteriormente, ou seja, facilidade de uso, funções absortivas e digestivas acessíveis, replicáveis, conservadas entre moscas e mamíferos, propomos utilizar D. melanogaster como modelo para avaliar a atividade antidiarreica de plantas. O fenótipo diarreico em D. melanogaster pode ser caracterizado por várias características, incluindo maior abundância de depósitos fecais, maiores tamanhos de depósito, coloração mais clara (menos concentrada) e maior material fecal26. Esse fenótipo pode ser quantificado usando vários parâmetros: número de depósitos fecais, área total dos depósitos, luminosidade média e densidade óptica total integrada (DIO). O IOD total é definido como o conteúdo total de corante do depósito, ou seja, o material fecal total excretado27. Previamente, um ensaio foi desenvolvido para analisar depósitos fecais de D. melanogaster27,28. Neste ensaio, o leitor final de fezes (T.U.R.D.) foi utilizado como ferramenta de análise fecal, que permite verificar o número, tamanho e luminosidade dos depósitos fecais e, assim, monitorar a fisiologia intestinal das moscas-das-frutas. No entanto, este método nunca foi aplicado para avaliar o fenótipo diarreico em moscas. O gene Ion Transport Peptide (ITP) é um importante regulador endócrino da sede e excreção e combina a homeostase da água com a alimentação em D. melanogaster. Em um estudo recente, demonstrou-se que a velocidade do trânsito alimentar através do trato gastrointestinal e a frequência de eventos de defecação foram diminuídas pela superexpressão de PTI e aumentadas pelo knockdown de PTI. Este último fenótipo foi descrito como diarreico pelos autores deste estudo29.
Neste protocolo, uma versão modificada do ensaio de depósito fecal é empregada para avaliar o efeito de um agente antidiarreico (i.e., extrato de folha de goiaba) sobre o trato gastrintestinal de D. melanogaster usando a cepa ITPi como modelo diarreico. O objetivo geral deste método é: 1) fornecer um método fácil e confiável para avaliar o efeito antidiarreico de drogas e extratos vegetais, e 2) permitir a descoberta de compostos bioativos responsáveis pelo efeito antidiarreico em extratos de plantas através da aplicação de uma abordagem guiada por bioatividade.
Protocol
1. Preparação do extrato vegetal
- Coletar folhas de Psidium guajava L.30 de uma árvore adulta e processar da seguinte forma: secar as folhas em estufa a 40 °C por 6 dias, depois secar ao ar por 6 dias, depois secar novamente na estufa a 40 °C por 4 dias e, finalmente, preparar o pó da folha moendo as folhas secas em um moinho ou moedor de café.
- Macerar 100 g do pó seco em 1 L de etanol 96% por 24 h, com agitação contínua com agitação. Submeter novamente o resíduo vegetal ao mesmo processo e evaporar os filtrados resultantes à secura utilizando um evaporador rotativo a vácuo sob pressão reduzida (175 mbar) a 40 °C.
- Dissolva o extrato vegetal em etanol para obter a concentração desejada. Determinar a concentração ótima (usando o protocolo descrito aqui) testando uma série de concentrações.
- Para extratos vegetais, testar uma faixa de concentração de 100 μg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL e usar aqueles que não afetam a taxa de sobrevivência da mosca. Para os compostos puros, testar a seguinte gama de concentrações: 0,05, 0,5, 5 e 50 mM12.
2. Preparação do meio alimentar
- Medir 100 ml de água destilada e deitar no copo com 4 g de açúcar e 0,8 g de ágar (ver Tabela de Materiais). Aqueça a 100 °C (mexendo) e segure por 10 min.
- Abaixe a temperatura para 80 °C, adicione 7,4 g de farinha e 2,8 g de fermento enquanto agita. Aqueça por pelo menos 20 min, ainda mexendo e controlando a temperatura que deve ficar em torno de 80 °C.
- Adicionar a solução de ácido moldex-propiónico (1 ml de moldex e 0,3 g de ácido propiónico misturar bem). Aguarde a temperatura baixar para cerca de 50 °C, adicione a solução de extrato vegetal (1 mg/mL) e 0,5 g de azul de bromofenol em pó.
NOTA: Consulte o ponto 1.3.1 para obter mais informações sobre as outras concentrações a ensaiar. - Despeje o alimento nas placas de Petri e pare quando a placa de Petri estiver cheia (Figura 1A). Deixe as placas de Petri arrefecer até à temperatura ambiente (cerca de 3 h), feche a tampa e guarde no frigorífico a 4 °C.
NOTA: As placas de Petri devem ser armazenadas na geladeira por no máximo 2 semanas para evitar a evaporação da água.
Figura 1: Demonstração do processo experimental para o teste de depósito fecal. (A) Imagem mostrando placas de Petri cheias de meio alimentício. Certifique-se de ter comida suficiente na placa de Petri, para que nenhuma lacuna irá prender as moscas e impedi-las de se mover. No entanto, não sobrecarregue a placa de Petri com alimentos para que a superfície possa ser coberta uniformemente. (B) Imagem da espátula conforme descrito no protocolo. (C) Imagem do teste de depósito fecal conforme descrito no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Preparação das moscas
- Prepare os tanques CO2 , pistola de sopro CO2 com agulhas, almofada de mosca, pincel e microscópio. A estação de mosca fornece CO2 tanto para a almofada de mosca quanto para a pistola de avarpro. A almofada de mosca é empregada para classificar moscas, enquanto a zarabatana CO2 é utilizada para anestesiar moscas em frascos, garrafas e placas de Petri.
- Padronize a idade das moscas selecionando frascos que contenham pupas (pelo menos 10) e descarte as moscas adultas do tubo usando o seguinte método. Um a um, vire os frascos para injetáveis de cabeça para baixo e introduza a agulha entre o tampão de algodão e a parede lateral do frasco. Anestesiar moscas adultas com a zarabatana CO2 até que todas as moscas estejam dormindo no tampão de algodão (alguns segundos são necessários para anestesia-las, e a ação anestésica durará alguns segundos após a liberação da zarabatana). Abra o frasco para injetáveis acima de um frasco de vidro contendo etanol a 70% e coloque as moscas nele. Feche o frasco para injetáveis com o tampão de algodão e mantenha-o numa incubadora a 25 °C com 60% de humidade. Ajuste o ciclo de luz da incubadora para 12 h claro/12 h escuro.
- Após a incubação (máximo de 8 h), classifique-os em fêmeas e machos virgens sob o microscópio e mosca, virando-os de costas e olhando para seus órgãos genitais.
- A genitália feminina é pálida em comparação com a genitália masculina, que são de cor avermelhada. Os machos também podem ser identificados pela presença de cerdas escuras, chamadas de pentes sexuais, em seu par de patas dianteiras. Divida as moscas em dois tubos frescos (um para machos e outro para fêmeas) e incube-as por 6-8 dias a 25 °C.
NOTA: A 25 °C, as fêmeas permanecem virgens por aproximadamente 8 h após a eclosão.
- A genitália feminina é pálida em comparação com a genitália masculina, que são de cor avermelhada. Os machos também podem ser identificados pela presença de cerdas escuras, chamadas de pentes sexuais, em seu par de patas dianteiras. Divida as moscas em dois tubos frescos (um para machos e outro para fêmeas) e incube-as por 6-8 dias a 25 °C.
4. Teste de depósito fecal
- Rotule as placas de Petri com a cepa, sexo e droga correspondentes para evitar confusão entre as placas de Petri. Empilhe as placas de Petri umas sobre as outras.
- Pegue as placas de Petri contendo o alimento tingido e reverta-as no papel mata-borrão para absorver o líquido extra. Usando uma espátula (Figura 1B), corte o alimento em 12 partes iguais e, em seguida, use a espátula para colocar uma fatia em uma placa de Petri vazia.
NOTA: Dependendo do número de repetições, o número de fatias a serem cortadas pode ser aumentado até 20 por placa de Petri. Cada fatia deve ser do mesmo tamanho. - Anestesiar as moscas com CO2 até que todas as moscas estejam dormindo no tampão de algodão. Transfira seis moscas saudáveis em cada placa de Petri (Figura 1C), feche imediatamente a tampa e coloque-as na incubadora (25°C, 60% de umidade, 12 h claro/ 12 h escuro).
- Para garantir que as moscas não escapem da placa de Petri durante o experimento, prenda as tampas superior e inferior da placa de Petri com uma fita. Para cada grupo de teste, prepare seis placas de Petri repetidas (pelo menos).
- Depois de permitir que as moscas criem por 24 h, use CO2 para anestesia-las, transfira as moscas para um recipiente cheio de etanol 70% e descarte qualquer alimento restante.
- Guarde as placas de Petri e prossiga para o passo 5.
5. Quantificação de placas de Petri
- Defina uma pasta no computador e renomeie-a, incluindo o nome da cepa do experimento, o sexo das moscas e o tipo de drogas usadas. Dentro dessa pasta, crie subpastas denominadas Original, Recorte e Análise.
- Digitalize as placas de Petri usando um scanner de alta resolução com uma resolução óptica de 6.400 pixels por polegada (ppi). Digitalize as tampas superior e inferior de cada placa de Petri separadamente, colocando-as individualmente no meio do campo do scanner.
- Abra o aplicativo instalado no computador. Uma janela de boas-vindas será aberta na tela do computador com todas as configurações gerais (Figura 2A).
Observação : não modifique as configurações avançadas. Esta etapa é válida apenas para usuários que possuem o mesmo scanner proposto na Tabela de Materiais. Consulte as diretrizes se estiver usando outro software.- Nomeie a placa de Petri na aplicação, incluindo número de sequência, tampa superior ou inferior, sexo e tipo de alimento usado. Selecione a subpasta original definida na etapa 5.1.
- Visualize a placa de Petri. Clique em Visualizar na parte inferior da janela, aguarde alguns segundos para que o scanner faça a pré-varredura e, em seguida, uma janela aparecerá na tela do computador. Mova o quadrado exibido na tela para cercar a placa de Petri.
- Clique em Digitalizar no canto inferior direito da janela na tela do computador, a digitalização é salva automaticamente como uma imagem na pasta de escolha.
- Recorte a imagem usando um aplicativo (por exemplo, o aplicativo de código aberto de Fiji), para que nenhum artefato e resíduo de alimento sejam considerados como depósitos.
Observação : as etapas a seguir são válidas somente para usuários que têm o aplicativo Fiji. Consulte as diretrizes se estiver usando outro software.- Abra o aplicativo Fiji, aguarde alguns segundos até que uma barra de ferramentas apareça na tela.
- Arraste a imagem a ser cortada para a barra de ferramentas. Selecione as seleções do polígono do 3º ícone na barra de ferramentas, corte a parte indesejada da foto (o gráfico de pizza colorido) clicando na tela para marcar um ângulo ao redor do gráfico de pizza (Figuras 2B-1,2).
NOTA: Ao delinear a região de recorte dentro de uma imagem, é imperativo que os quadros escolhidos estejam perfeitamente conectados de ponta a ponta. - Clique em Editar no canto superior esquerdo da barra e, em seguida, em Preencher/Limpar fora (Figura 2B-3).
- Para salvar a foto, clique em Arquivo no canto superior esquerdo da barra, depois em Salvar como e, finalmente, em Tiff. Escolha a subpasta Cut definida na etapa 5.1.
Observação : ao salvar a imagem cortada, certifique-se de que nenhum caractere especial (por exemplo, !, &, $, #, _,-,...) ou muitos caracteres estão presentes no nome do arquivo .
Figura 2: Principais etapas no processo de análise dos dados do teste de depósito fecal. (A) Captura de tela mostrando as informações de configuração do aplicativo de verificação. (B) Imagens recortadas usando o aplicativo Fiji. Certifique-se de que nenhum artefato e resíduo de alimento sejam considerados depósitos. (C) Captura de tela mostrando como ele se parece ao abrir o aplicativo Excel_merge-v4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Identificação de depósitos fecais usando o leitor final de esterco software de código aberto
NOTA: A introdução e o uso do leitor final de software de esterco podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1.
- Primeiro, abra o software T.U.R.D. (Figura 1 Suplementar). Crie um novo experimento e dê um nome ao documento e, em seguida, salve-o na subpasta Analysis definida na etapa 5.1.
- Clique em Placas e, em seguida, em Adicionar placa. Selecione a placa de Petri a ser processada. Uma nova janela aparece com os nomes das placas selecionadas e novos parâmetros. Defina o tamanho do bloco, o deslocamento, o tamanho mínimo e o tamanho máximo (Figura 2 suplementar).
- Para verificar se os depósitos fecais detectados são os corretos, clique em Placas, depois em Inspecionar Placas Selecionadas, depois em Gráficos e Exibir imagens anotadas (Figura 3 Suplementar). Aumente o zoom e veja as contagens. Se houver apenas alguns depósitos que não devem ser incluídos na análise, desmarque os depósitos a serem excluídos (Figura Suplementar 4).
- Para cada nova imagem a ser processada, reinicie a partir da etapa 6.3.
- Após analisar as placas com o software T.U.R.D., modifique o número de moscas clicando em Não. Moscas (Figura 5 Suplementar).
- Modifique o nome do grupo clicando em Placas > Editar grupos > Adicionar e, em seguida, na coluna Grupo , escolha o nome do grupo.
- Exporte os diferentes dados de replicação separadamente clicando em Analisar > Estatísticas Descritivas > Selecionar Grupo (Figura 6 Suplementar). Mantenha todos os arquivos de planilha (.csv) na mesma pasta.
- Para reunir todos os arquivos (obtidos na etapa 6.7) em uma planilha exclusiva, abra o aplicativo Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), aguarde até que a seguinte frase apareça Selecione o caminho da pasta (com .csv arquivos):, e cole o endereço da pasta acima. Por exemplo, o caminho pode ser C:\Experiment\Fecal deposit test\ e clicar em Enter duas vezes no teclado (Figura 2C). Depois disso, um novo arquivo de planilha é criado na mesma pasta. O novo arquivo de planilha inclui todos os arquivos exportados em planilhas diferentes.
- No arquivo de planilha anterior, adicione outra planilha para coletar a média de cada parâmetro de todas as replicações (use a função PROCV para processar os dados). Um exemplo é dado na Tabela Suplementar 1.
- Analise o valor de p.
Representative Results
O estudo aqui apresentado mostra que a mensuração da diarreia em D. melanogaster pode ser realizada através do ensaio de depósito fecal. Diferenças significativas entre os fenótipos (diarreicos ou não) podem ser determinadas pela análise de vários parâmetros, incluindo o número de depósitos fecais, a área total dos depósitos, a área média dos depósitos, a luminosidade média e a densidade óptica total integrada (DIO), que é uma medida da quantidade total de corante presente no depósito e representa o conteúdo total de material fecal excretado27.
O knockdown do gene ITP em moscas pode induzir um fenótipo diarreico, caracterizado pelo aumento da frequência de defecação, tornando-os um modelo adequado para o estudo da diarreia29. No contexto deste experimento, a linhagem ITPi (w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) foi empregada e criada em meio padrão. O extrato das folhas de Psidium guajava foi selecionado como intervenção antidiarreica, dado o amplo uso desta planta em regiões tropicais para o manejo da diarreia. O crofelemer, um agente antidiarreico, foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para proporcionar alívio sintomático da diarreia não infecciosa em pacientes adultos com HIV/AIDS submetidos à terapia antirretroviral31. Crofelemer é um extrato do látex de Croton lechleri Müll.Arg. casca do caule32. A loperamida é uma droga sintética utilizada mundialmente no tratamento da diarreia33. Crofelemer e Loperamida foram utilizados como potenciais controles positivos.
A hipótese foi que a alimentação de moscas com extrato de P. guajava , Crofelemer e Loperamida reduziria o fenótipo diarreico em comparação com aquelas alimentadas com alimento normal. Para examinar essa hipótese, uma medida dos depósitos fecais foi realizada em D. melanogaster comparando vários parâmetros entre moscas alimentadas com alimento normal e aquelas alimentadas com extrato de P. guajava (1 g/100 mL), Crofelemer (1 g/100 mL) e Loperamida (10 mM). Para a montagem do experimento, foram utilizadas fêmeas virgens ou machos com 6-7 dias de idade. Cada placa de Petri continha seis moscas, e seis repetições foram realizadas. As moscas foram criadas por 24 h e, em seguida, cada grupo foi analisado. O teste t de Student foi utilizado para comparar a diferença significativa entre os grupos teste. Os resultados demonstram que o número de depósitos fecais (Figura 3A), a área total dos depósitos (Figura 3B) e o DO total (Figura 3C) apresentaram valores significativamente maiores no grupo alimento normal em relação ao grupo extrato de P. guajava (1 g/ 100 mL), tanto em fêmeas virgens quanto em machos. Infelizmente, a loperamida não mostrou efeito em ambos os sexos (mas já foi demonstrado que atua como agente antiespasmódico em D. melanogaster)34 , enquanto Crofelemer teve efeito apenas no sexo feminino.
Figura 3: Análise das deformações ITPi . A cepa ITPi foi analisada em quatro condições: alimentação com alimento normal, suplementação alimentar com 1 g/100 mL de extrato de P. guajava , 1 g/100 mL de Crofelômer e 10 mM de Loperamida. Os dados são apresentados como média ± DP de cada condição em fêmeas e machos (para seis repetições de dois lados de uma placa de Petri). A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student comparando dois grupos. Os valores de p são apresentados da seguinte forma: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) O número de depósitos fecais da cepa ITPi foi comparado em moscas alimentadas com ração suplementada com 1 g/100 mL de Crofelemer, 10 mM de Loperamida, 1 g/100 mL de extrato de P. guajava e em moscas alimentadas com ração normal. Adicionalmente, a diferença no número de depósitos fecais entre fêmeas virgens e machos também foi analisada. Em ambos os grupos, o número de depósitos fecais foi significativamente maior em moscas alimentadas com alimento normal do que naquelas alimentadas com 1 g/100 mL de extrato de P. guajava . (B) A área total dos depósitos fecais da cepa ITPi foi comparada em moscas alimentadas com alimento normal e em moscas alimentadas com alimento suplementado com 1 g/100 mL de extrato de P. guajava , 1 g/100 mL de Crofelemer e 10 mM de Loperamida. Em machos e fêmeas, a área total de depósitos fecais foi significativamente maior em moscas alimentadas com alimento normal do que naquelas alimentadas com 1 g/100 mL de extrato de P. guajava . (C) A diferença no IOD total da cepa ITPi foi analisada entre moscas alimentadas com alimento normal e moscas alimentadas com alimento suplementado com 1 g/100 mL de extrato de P. guajava , 1 g/100 mL de Crofelemer e 10 mM de Loperamida. Em machos e fêmeas, o DO total foi significativamente maior em moscas alimentadas com alimento normal do que naquelas alimentadas com 1 g/100 mL de extrato de P. guajava . Abreviações: F = Feminino; M = Masculino; Crofe = Crofelemer; Lope = Loperamida; Nem comida = Alimentação normal; P. gua ext = extrato de Psidium guajava . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para demonstrar que a redução da excreção observada no grupo do extrato de P. guajava é devida ao efeito inibitório do extrato e não à redução do consumo alimentar, foi realizado o método de estimativa da ingestão direta e rastreamento do consumo de alimentos sólidos (DIETS)35. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas no consumo alimentar entre os grupos com e sem medicamentos, com exceção da loperamida no sexo masculino, que fez com que as moscas consumissem menos alimentos do que o normal (Figura 4).
Figura 4: Ensaio de alimentação. O ensaio alimentar mediu o consumo de alimento sólido em moscas. As moscas foram alimentadas com quatro diferentes meios: 1 g/100 mL de extrato de P. guajava , 1 g/100 mL Crofelemer, 10 mM de loperamida e ração normal. Cada grupo consistiu de 20 moscas com cinco repetições. Os dados são apresentados como média ± DP de cada condição em ambos os sexos. A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student comparando dois grupos. Os valores de p são apresentados da seguinte forma: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os depósitos fecais e os resultados do ensaio alimentar mostraram que o extrato de P. guajava é uma planta medicinal confiável para o tratamento da diarreia em moscas-das-frutas.
Figura suplementar 1: janela de abertura T.U.R.D. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Janela T.UR.D. com configurações a serem ajustadas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 3: Janela T.U.R.D. com uma imagem anotada. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 4: Janela T.U.R.D. apresentando cada ponto detectado a partir de uma imagem já processada. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 5: Janela T.U.R.D. apresentando cada imagem processada. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 6: Janela T.U.R.D. mostrando o processo de exportação dos dados para cada grupo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Guia rápida para o uso do software T.U.R.D. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Complementar 1: Exemplo das planilhas finais prontas para análise. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 1: Aplicativo para mesclar planilhas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
D. melanogaster tem sido amplamente aceita como modelo para vários processos biológicos devido à semelhança de genes entre D. melanogaster e humanos36. O uso de D. melanogaster como modelo para estudar o trato intestinal é prevalente e a aplicação de T.U.R.D. tem sido utilizada para estimar o número, a área e a quantidade de depósitos fecais. Entretanto, o método de detecção fenotípica não tem sido utilizado para avaliar a diarreia em moscas-das-frutas. Portanto, este protocolo introduz um novo método para avaliar grosseiramente a presença de diarreia através da detecção dos depósitos fecais.
Os depósitos fecais são um indicador essencial da função e da saúde do trato intestinal37. Neste contexto, um método é proposto para a criação de D. melanogaster em meio contendo fármaco para investigar vários parâmetros de depósitos fecais. Ao monitorar o número de depósitos, é possível determinar a frequência de defecação e avaliar se uma droga tem algum impacto no trânsito intestinal. A área total dos depósitos pode ser medida para avaliar a concentração e diluição da matéria fecal, que é um fator importante na determinação da saúde geral do trato intestinal. Além disso, a densidade óptica integrada total (DIO) pode ser usada para detectar a quantidade total de material fecal presente nos depósitos. Este protocolo fornece um método eficiente para triagem e avaliação de drogas, bem como extratos de plantas que afetam o trato intestinal. Quando D. melanogaster é utilizada como organismo modelo, é possível avaliar a eficácia de potenciais fármacos, o que pode ajudar a acelerar o processo de descoberta de fármacos. Ao aplicar este método em extratos de plantas, os pesquisadores podem ajudar a validar seu uso como agentes antidiarreicos.
Existem vários passos críticos a serem considerados ao usar este protocolo para estudar depósitos fecais em D. melanogaster. Em primeiro lugar, é essencial calcular a massa necessária para atingir a concentração desejada do fármaco no meio. Além disso, é importante garantir boas condições de preparação ao adicionar o medicamento ao meio, pois altas temperaturas podem degradar o medicamento e afetar sua potência. Em segundo lugar, a seleção de moscas fêmeas é importante neste protocolo. É importante usar moscas virgens para evitar as diferenças na produção fecal entre fêmeas virgens e acasaladas. Por exemplo, as manchas produzidas por fêmeas virgens são mais circulares do que fêmeas acasaladas, e fêmeas acasaladas tendem a excretar mais material fecal do que fêmeas virgens27,28. Portanto, recomenda-se coletar moscas antes de 8 h de eclosão para garantir que todas as fêmeas coletadas sejam virgens. Além disso, as moscas testadas devem ser fortes e saudáveis, pois sua saúde pode influenciar a ingestão de alimentos e a produção fecal. Por exemplo, moscas com uma forma anormal de asas podem ter dificuldade em obter o alimento. Finalmente, para usar o T.U.R.D. com sucesso, o tamanho do bloco (pixels) e as configurações de deslocamento são cruciais. Devido à diferença no contraste de luz das imagens, pode ser necessário tentar diferentes ajustes para obter a melhor identificação possível dos depósitos fecais.
Embora o método apresentado seja eficaz, existem várias limitações. Uma delas é a precisão da concentração da droga no meio. Como o meio é aquecido durante a preparação, um pouco de água pode evaporar, o que pode afetar a concentração da droga. Outra limitação é a varredura das placas de Petri. Algumas partes das placas de Petri (ou seja, bordas) não são escaneadas, e isso pode resultar em um erro de cálculo dos depósitos fecais totais. Além disso, as moscas não produzem a mesma quantidade de depósitos fecais nas tampas superior e inferior das placas de Petri. Como tendem a produzir mais depósitos na tampa inferior, o desvio padrão da análise entre a tampa superior e inferior pode ser alto, o que pode afetar a precisão dos resultados.
Usando este protocolo, os pesquisadores podem estudar a diarreia em D. melanogaster. Ao modificar o meio contendo drogas, este método pode ser usado para rastrear plantas antidiarreicas, o que fornece uma nova abordagem para a descoberta de drogas. A medicina tradicional e os produtos naturais têm sido usados há séculos para tratar diferentes doenças, incluindo distúrbios gastrointestinais. Com o uso deste protocolo para avaliar a eficácia de extratos vegetais sobre depósitos fecais, novos tratamentos potenciais para doenças do trato intestinal podem ser identificados e uma justificativa científica para seu uso como agentes antidiarreicos pode ser fornecida. Essa abordagem pode fornecer uma valiosa contribuição para o campo da descoberta de drogas e etnofarmacologia.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos à Dra. Martina Gáliková por nos fornecer as cepas de Drosophila . Somos gratos à equipe de Michelle Crozatier-Borde e Marc Haenlin por dar feedback sobre nosso estudo e nos ajudar a melhorar nosso modelo. Gostaríamos de agradecer à Napo Pharmaceuticals Company por nos fornecer o medicamento Crofelemer. Os autores também agradecem ao editor convidado Dr. Hugues Petitjean por nos proporcionar a oportunidade de publicar este protocolo. O presente estudo foi financiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR) no âmbito do projeto ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
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