Summary
Aquí, se describe un método para alimentar a Drosophila melanogaster con medicamentos y extractos de plantas y evaluar su efecto en el tracto gastrointestinal mediante el análisis de los depósitos fecales de las moscas de la fruta. Las moscas tratadas con medicamentos se pueden utilizar como modelo para futuras investigaciones.
Abstract
Para estudiar la fisiología gastrointestinal humana, los científicos biomédicos se han basado en el uso de organismos modelo. Aunque muchos investigadores han utilizado ratones como modelo para estudiar la función intestinal, solo unos pocos informes se han centrado en Drosophila melanogaster (D. melanogaster). En comparación con los ratones, las moscas de la fruta presentan muchas ventajas, como un ciclo de vida corto, un mantenimiento rentable y sencillo, y sin problemas éticos. Además, la fisiología gastrointestinal, la anatomía y las vías de señalización de los mamíferos están altamente conservadas en D. melanogaster. Los extractos de plantas se han utilizado tradicionalmente para tratar la diarrea y el estreñimiento. Por ejemplo, Psidium guajava (P. guajava) es uno de los agentes antidiarreicos más conocidos en los trópicos. Sin embargo, ningún estudio ha evaluado el efecto de los fármacos antidiarreicos y laxantes y de los extractos de plantas en D. melanogaster, y se desconoce si pueden producirse efectos similares (p. ej., depósitos fecales más pequeños, más concentrados y menos abundantes en el caso de los fármacos antidiarreicos) en las moscas de la fruta en comparación con los mamíferos. En este estudio se demuestra un efecto antidiarreico inducido por P. guajava en una cepa de D. melanogaster que presenta un fenotipo diarreico. La toma de muestras fecales producidas por moscas se controla utilizando un alimento suplementado con colorantes. Este protocolo describe el método utilizado para preparar alimentos con medicamentos, evaluar los depósitos fecales de las moscas alimentadas con estas preparaciones alimenticias e interpretar los datos obtenidos.
Introduction
El tracto gastrointestinal (GI), también llamado tracto digestivo, es responsable de la digestión y absorción de nutrientes y la excreciónde productos no digeridos. El tracto gastrointestinal es vulnerable a una serie de trastornos que pueden causar molestias, dolor e interrupción de la vida diaria. Los trastornos gastrointestinales incluyen dolor y malestar abdominal, hinchazón, acidez estomacal, indigestión o dispepsia, náuseas, vómitos, diarrea y estreñimiento. La diarrea es el síntoma más común del trastorno gastrointestinal3, y se define como una enfermedad con al menos tres heces blandas y acuosas durante un período de 24 h4. La diarrea es causada por una amplia gama de patógenos, incluyendo bacterias, virus, parásitos, hongos, y también puede ser causada por medicamentos 5,6. A nivel mundial, la diarrea sigue siendo la segunda causa de mortalidad entre los niños menores de 5 años7. Aunque la diarrea puede resolverse por sí sola, también puede indicar una afección subyacente más grave si dura más de unos pocos días.
Para estudiar el tracto intestinal, los investigadores recurren a modelos animales como ratones, ratas y cerdos 8,9. Sin embargo, el uso de estos animales puede ser costoso y llevar mucho tiempo porque requieren instalaciones especializadas y consideraciones éticas. Estudios recientes han demostrado que D. melanogaster puede ser utilizado como modelo para estudiar el tracto gastrointestinal e investigar algunos mecanismos como el mantenimiento de la homeostasis regenerativa, el desarrollo de la senescencia inmune, la pérdida de la función de barrera epitelial y la disminución de la homeostasis metabólica10,11. D. melanogaster, conocida como la mosca de la fruta, comparte un alto grado de homología genética con los humanos; Se cree que aproximadamente el 75% de los genes de enfermedades humanas tienen un homólogo funcional en la mosca12. También tienen un sistema digestivo simple que consta de un intestino anterior, un intestino medio y un intestino posterior13. D. melanogaster es fácil de cultivar en el laboratorio y puede ser modificado genéticamente de diferentes maneras14. Por lo tanto, el uso de D. melanogaster para pruebas in vivo es una herramienta poderosa que permite a los investigadores estudiar procesos biológicos complejos en un entorno controlado.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), alrededor del 80% de las personas que viven en países en desarrollo utilizan la medicina tradicional para sus necesidades primarias de salud15. El alto uso de plantas medicinales puede explicarse por el hecho de que son fáciles de conseguir, baratas y tienen pocos efectos secundarios16. Las principales partes de la planta utilizadas en la fitoterapia son las hojas, la corteza, las raíces y las semillas17, mientras que los principales métodos de preparación son la infusión, la decocción y la maceración18. Estos remedios a base de hierbas contienen sustancias fitoquímicas como alcaloides, terpenoides, flavonoides, esteroides, taninos e hidratos de carbono19, que tienen efectos terapéuticos en el cuerpo humano. Las personas usan una variedad de plantas medicinales para tratar trastornos gastrointestinales como diarrea, dolor de estómago ydisentería. Por ejemplo, Psidium guajava es una de las plantas más utilizadas para tratar la diarrea en el mundo. Diversos ensayos farmacológicos y clínicos ya han demostrado su seguridad, lo que lo convierte en un buen candidato antidiarreico para el estudio21,22. Sin embargo, las principales limitaciones de los medicamentos a base de plantas son la falta de evaluación de la eficacia y la seguridad, así como la falta de información definitiva y completa sobre la composición de los extractos de plantas utilizados23. Para validar la eficacia y la seguridad de los medicamentos a base de plantas, se requiere un enfoque sistemático que implique la validación experimental y clínica, y el enfoque debe estar respaldado por suficientes datos procedentes de estudios in vivo e in vitro.
Para evaluar la eficacia de los remedios tradicionales en el tratamiento de la diarrea, el uso de ratones y ratas ha sido predominante en las últimas décadas24,25. Debido a las principales ventajas mencionadas anteriormente, es decir, facilidad de uso, asequible, replicable, conservada de las funciones absorbentes y digestivas entre moscas y mamíferos, se propone utilizar D. melanogaster como modelo para evaluar la actividad antidiarreica de las plantas. El fenotipo diarreico en D. melanogaster puede caracterizarse por varias características, incluyendo una mayor abundancia de depósitos fecales, mayores tamaños de depósito, una coloración más clara (menos concentrada) y mayor materia fecal26. Este fenotipo se puede cuantificar utilizando varios parámetros: número de depósitos fecales, área total de depósitos, luminosidad media y densidad óptica integrada total (YOD). La IOD total se define como el contenido total de colorante del depósito, es decir, el total de materia fecal excretada27. Previamente, se ha desarrollado un ensayo para analizar los depósitos fecales de D. melanogaster27,28. En este ensayo, se utilizó el lector final de estiércol (T.U.R.D.) como herramienta de análisis fecal, que permite verificar el número, tamaño y ligereza de los depósitos fecales y, por lo tanto, monitorear la fisiología intestinal de las moscas de la fruta. Sin embargo, este método nunca se aplicó para evaluar el fenotipo diarreico en moscas. El gen del péptido transportador de iones (ITP) es un importante regulador endocrino de la sed y la excreción y combina la homeostasis del agua con la alimentación en D. melanogaster. En un estudio reciente, se demostró que la velocidad del tránsito de los alimentos a través del tracto gastrointestinal y la frecuencia de los eventos de defecación disminuyeron por la sobreexpresión de ITP y aumentaron por la eliminación de ITP. Este último fenotipo fue descrito como diarreico por los autores de este estudio29.
En este protocolo, se emplea una versión modificada del ensayo de depósito fecal para evaluar el efecto de un agente antidiarreico (es decir, extracto de hoja de guayaba) en el tracto gastrointestinal de D. melanogaster mediante el uso de la cepa ITPi como modelo diarreico. El objetivo general de este método es: 1) proporcionar un método fácil y confiable para evaluar el efecto antidiarreico de medicamentos y extractos de plantas, y 2) permitir el descubrimiento de compuestos bioactivos responsables del efecto antidiarreico en extractos de plantas mediante la aplicación de un enfoque guiado por bioactividad.
Protocol
1. Preparación de extracto de plantas
- Recoja las hojas de Psidium guajava L.30 de un árbol adulto y procese de la siguiente manera: seque las hojas en un horno a 40 °C durante 6 días, luego seque al aire durante 6 días, luego seque nuevamente en el horno a 40 °C durante 4 días y finalmente prepare el polvo de hojas moliendo las hojas secas en un molino o un molinillo de café.
- Macerar 100 g del polvo seco en 1 L de etanol al 96% durante 24 h, con agitación continua mediante agitador. Someter el residuo vegetal al mismo proceso una vez más y evaporar los filtrados resultantes hasta la sequedad utilizando un evaporador rotativo de vacío a presión reducida (175 mbar) a 40 °C.
- Disolver el extracto de la planta en etanol para obtener la concentración deseada. Determine la concentración óptima (utilizando el protocolo descrito aquí) probando una serie de concentraciones.
- Para los extractos de plantas, pruebe un rango de concentración de 100 μg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL y use aquellos que no afecten la tasa de supervivencia de la mosca. En el caso de compuestos puros, ensaye el siguiente rango de concentraciones: 0,05, 0,5, 5 y 50 mM12.
2. Preparación del medio alimenticio
- Mida 100 ml de agua destilada y vierta en el vaso de precipitados con 4 g de azúcar y 0,8 g de agar (consulte la tabla de materiales). Calentar a 100 °C (sin dejar de remover) y mantener durante 10 min.
- Bajar la temperatura a 80 °C, añadir 7,4 g de harina y 2,8 g de levadura sin dejar de remover. Calentar durante al menos 20 minutos, sin dejar de remover y controlando la temperatura, que debe estar en torno a los 80 °C.
- Añadir la solución de moldex-ácido propiónico (1 ml de moldex y 0,3 g de ácido propiónico mezclar bien). Espere a que la temperatura baje a unos 50 °C, agregue la solución de extracto de planta (1 mg/ml) y 0,5 g de polvo de azul de bromofenol.
NOTA: Consulte la sección 1.3.1 para obtener más detalles sobre las demás concentraciones que se someterán a ensayo. - Vierta la comida en las placas de Petri y deténgase cuando la placa de Petri esté llena (Figura 1A). Deje que las placas de Petri se enfríen a temperatura ambiente (aproximadamente 3 h), luego cierre la tapa y guárdelas en el refrigerador a 4 ° C.
NOTA: Las placas de Petri deben almacenarse en el refrigerador durante no más de 2 semanas para evitar la evaporación del agua.
Figura 1: Demostración del proceso experimental para la prueba de depósito fecal. (A) Imagen que muestra placas de Petri llenas de medio alimenticio. Asegúrate de tener suficiente comida en la placa de Petri, para que ningún espacio atrape a las moscas y les impida moverse. Sin embargo, no sobrecargue la placa de Petri con alimentos para que la superficie pueda cubrirse uniformemente. (B) Imagen de la espátula como se describe en el protocolo. (C) Imagen de la prueba de depósito fecal como se describe en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Preparación de moscas
- Prepare los tanques de CO2 , la pistola de cerbatana de CO2 con agujas, la almohadilla para moscas, el pincel y el microscopio. La estación de mosca suministra CO2 tanto a la almohadilla como a la pistola de soplado. La almohadilla para moscas se emplea para clasificar moscas, mientras que la pistola de aire comprimido deCO2 se utiliza para anestesiar moscas en viales, botellas y placas de Petri.
- Estandarice la edad de las moscas seleccionando viales que contengan pupas (al menos 10) y deseche las moscas adultas del tubo utilizando el siguiente método. Uno por uno, voltee los viales boca abajo e inserte la aguja entre el tapón de algodón y la pared lateral del vial. Anestesiar a las moscas adultas con la pistola de CO2 hasta que todas las moscas estén dormidas en el tapón de algodón (se necesitan unos segundos para anestesiarlas, y la acción anestésica durará unos segundos después de soltar la pistola de cerbatana). Abra el frasco sobre una botella de vidrio que contenga etanol al 70% y deje caer las moscas en él. Cerrar el vial con el tapón de algodón y mantenerlo en una incubadora a 25 °C con un 60% de humedad. Ajuste el ciclo de luz de la incubadora a 12 h de luz/12 h de oscuridad.
- Después de la incubación (máximo 8 h), clasifíquelos en hembras y machos vírgenes bajo el microscopio y la almohadilla para moscas girándolos boca arriba y mirando sus genitales.
- Los genitales femeninos son pálidos en comparación con los genitales masculinos, que son de color rojizo. Los machos también pueden identificarse por la presencia de cerdas oscuras, llamadas peines sexuales, en el par de patas delanteras. Divida las moscas en dos tubos frescos (uno para machos y otro para hembras) e incube durante 6-8 días a 25 °C.
NOTA: A 25 °C, las hembras permanecen vírgenes durante aproximadamente 8 h después de la eclosión.
- Los genitales femeninos son pálidos en comparación con los genitales masculinos, que son de color rojizo. Los machos también pueden identificarse por la presencia de cerdas oscuras, llamadas peines sexuales, en el par de patas delanteras. Divida las moscas en dos tubos frescos (uno para machos y otro para hembras) e incube durante 6-8 días a 25 °C.
4. Prueba de depósito fecal
- Etiquete las placas de Petri con la cepa, el sexo y el medicamento correspondientes para evitar confusiones entre las placas de Petri. Apila las placas de Petri una encima de la otra.
- Toma las placas de Petri que contienen los alimentos teñidos e inviértelas en el papel secante para absorber el líquido extra. Con una espátula (Figura 1B), corte la comida en 12 partes iguales y luego use la espátula para poner una rebanada en una placa de Petri vacía.
NOTA: Dependiendo del número de réplicas, el número de rodajas a cortar puede aumentarse hasta 20 por placa de Petri. Cada rebanada debe ser del mismo tamaño. - Anestesiar a las moscas con CO2 hasta que todas las moscas estén dormidas en el tapón de algodón. Transfiera seis moscas sanas en cada placa de Petri (Figura 1C) y cierre la tapa inmediatamente, luego colóquelas en la incubadora (25 ° C, 60% de humedad, 12 h de luz / 12 h de oscuridad).
- Para asegurarse de que las moscas no escapen de la placa de Petri durante el experimento, fije las cubiertas superior e inferior de la placa de Petri con una cinta adhesiva. Para cada grupo de prueba, prepare seis placas de Petri replicadas (al menos).
- Después de permitir que las moscas se encabriten durante 24 horas, use CO2 para anestesiarlas, transfiera las moscas a un recipiente lleno de etanol al 70% y deseche cualquier alimento restante.
- Guarde las placas de Petri y continúe con el paso 5.
5. Cuantificación de placas de Petri
- Establezca una carpeta en la computadora y cámbiele el nombre, incluyendo el nombre de la cepa del experimento, el sexo de las moscas y el tipo de drogas utilizadas. Dentro de esta carpeta, cree subcarpetas denominadas Original, Cut y Analysis.
- Escanee las placas de Petri utilizando un escáner de alta resolución con una resolución óptica de 6.400 píxeles por pulgada (ppi). Escanee las cubiertas superior e inferior de cada placa de Petri por separado colocándolas individualmente en el centro del campo del escáner.
- Abra la aplicación instalada en la computadora. Se abrirá una ventana de bienvenida en la pantalla de la computadora con todas las configuraciones generales (Figura 2A).
NOTA: No modifique la configuración avanzada. Este paso solo es válido para los usuarios que tienen el mismo escáner que se propone en la Tabla de materiales. Consulte las pautas si utiliza otro software.- Nombra la placa de Petri en la solicitud, incluyendo el número de secuencia, la cubierta superior o inferior, el sexo y el tipo de alimento utilizado. Seleccione el conjunto original de la subcarpeta en el paso 5.1.
- Obtenga una vista previa de la placa de Petri. Haga clic en Vista previa en la parte inferior de la ventana, espere unos segundos para que el escáner escanee previamente, luego aparecerá una ventana en la pantalla de la computadora. Mueva el cuadrado que se muestra en la pantalla para rodear la placa de Petri.
- Haga clic en Escanear en la parte inferior derecha de la ventana en la pantalla de la computadora, el escaneo se guarda automáticamente como una imagen en la carpeta de su elección.
- Recorte la imagen utilizando una aplicación (por ejemplo, la aplicación Fiji de código abierto), de modo que ningún artefacto o residuo de comida se considere depósito.
NOTA: Los siguientes pasos son válidos solo para los usuarios que tienen la aplicación Fiji. Consulte las pautas si utiliza otro software.- Abra la aplicación Fiji, espere unos segundos hasta que aparezca una barra de herramientas en la pantalla.
- Arrastre la imagen que desea recortar a la barra de herramientas. Seleccione el 3er icono Selecciones de polígonos en la barra de herramientas, recorte la parte no deseada de la foto (el gráfico circular de color) haciendo clic en la pantalla para marcar un ángulo alrededor del gráfico circular (Figuras 2B-1,2).
NOTA: Al delinear la región de recorte dentro de una imagen, es imperativo que los fotogramas elegidos estén perfectamente conectados de extremo a extremo. - Haga clic en Editar en la parte superior izquierda de la barra y luego en Relleno/Borrar fuera (Figura 2B-3).
- Para guardar la foto, haga clic en Archivo en la parte superior izquierda de la barra, luego en Guardar como y finalmente en Tiff. Elija el conjunto de subcarpetas Cortar en el paso 5.1.
NOTA: Al guardar la imagen recortada, asegúrese de que no haya caracteres especiales (por ejemplo, !, &, $, #, _,-,...) o demasiados caracteres presentes en el nombre del archivo.
Figura 2: Pasos clave en el proceso de análisis de los datos de la prueba de depósito fecal. (A) Captura de pantalla que muestra la información de configuración de la aplicación de escaneo. (B) Imágenes recortadas con la aplicación Fiji. Asegúrese de que ningún artefacto o residuo de comida se considere depósito. (C) Captura de pantalla que muestra cómo se ve al abrir la aplicación Excel_merge-v4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Identificación de depósitos fecales utilizando el lector definitivo de software de código abierto de estiércol
NOTA: La introducción y el uso del software de lectura definitiva de estiércol se pueden encontrar en el Archivo Suplementario 1.
- Primero, abra el software T.U.R.D. (Figura complementaria 1). Cree un nuevo experimento y asigne un nombre al documento y, a continuación, guárdelo en la subcarpeta Análisis establecida en el paso 5.1.
- Haga clic en Platos y luego en Agregar plato. Seleccione la placa de Petri que se va a procesar. Aparece una nueva ventana con los nombres de las placas seleccionadas y los nuevos parámetros. Establezca el tamaño del bloque, el desplazamiento, el tamaño mínimo y el tamaño máximo (Figura complementaria 2).
- Para verificar que los depósitos fecales detectados son los correctos, haga clic en Placas, luego en Inspeccionar placas seleccionadas, luego en Gráficos y Ver imágenes anotadas (Figura complementaria 3). Acérquese y mire los recuentos. Si solo hay unos pocos depósitos que no deben incluirse en el análisis, anule la selección de los depósitos que se excluirán (Figura complementaria 4).
- Para cada nueva imagen que se procese, reinicie desde el paso 6.3.
- Después de analizar las placas con el software T.U.R.D., modifique el número de moscas haciendo clic en No. Moscas (Figura suplementaria 5).
- Modifique el nombre del grupo haciendo clic en Placas > Editar grupos > Agregar y, a continuación, en la columna Grupo , elija el nombre del grupo.
- Exporte los diferentes datos replicados por separado haciendo clic en Analizar > Estadísticas descriptivas > Seleccionar grupo (Figura complementaria 6). Mantenga todos los archivos de hoja de cálculo (.csv) en la misma carpeta.
- Para reunir todos los archivos (obtenidos en el paso 6.7) en una hoja de cálculo única, abra la aplicación Excel_merge-v4 (Archivo de codificación suplementaria 1), espere hasta que aparezca la siguiente oración Seleccione la ruta de la carpeta (con .csv archivos):, y luego pegue la dirección de la carpeta anterior. Por ejemplo, la ruta podría ser C:\Experimento\Prueba de depósito fecal\ y, a continuación, haga clic en Intro dos veces en el teclado (Figura 2C). Después de eso, se crea un nuevo archivo de hoja de cálculo en la misma carpeta. El nuevo archivo de hoja de cálculo incluye todos los archivos exportados en diferentes hojas.
- En el archivo de hoja de cálculo anterior, agregue otra hoja para recopilar la media de cada parámetro de todas las réplicas (use la función BUSCARV para procesar los datos). En el Cuadro Suplementario 1 se da un ejemplo.
- Analice el valor p.
Representative Results
El estudio que aquí se presenta muestra que la medición de la diarrea en D. melanogaster se puede lograr mediante el uso del ensayo de depósito fecal. Las diferencias significativas entre los fenotipos (diarreicos o no) pueden determinarse mediante el análisis de diversos parámetros, incluyendo el número de depósitos fecales, el área total de los depósitos, el área media de los depósitos, la ligereza media y la densidad óptica integrada total (DIO), que es una medida de la cantidad total de colorante presente en el depósito y representa el contenido total de materia fecal excretada27.
La eliminación del gen ITP en moscas puede inducir un fenotipo diarreico, caracterizado por una mayor frecuencia de defecación, lo que las convierte en un modelo adecuado para el estudio de la diarrea29. En el contexto de este experimento, se empleó la cepa ITPi (w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) y se crió en un medio estándar. Se seleccionó el extracto de hojas de Psidium guajava como intervención antidiarreica, dado el uso generalizado de esta planta en las regiones tropicales para controlar la diarrea. El crofelemer, un agente antidiarreico, fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para proporcionar alivio sintomático de la diarrea no infecciosa en pacientes adultos con VIH/SIDA sometidos a terapia antirretroviral31. Crofelemer es un extracto del látex de Croton lechleri Müll.Arg. corteza del tallo32. La loperamida es una droga sintética utilizada en todo el mundo para tratar la diarrea33. Tanto Crofelemer como loperamida se utilizaron como posibles controles positivos.
La hipótesis era que alimentar a las moscas con extracto de P. guajava , Crofelemer y loperamida reduciría el fenotipo diarreico en comparación con las alimentadas con alimentos normales. Para examinar esta hipótesis, se realizó una medición de depósitos fecales en D. melanogaster comparando varios parámetros entre moscas alimentadas con alimento normal y aquellas alimentadas con extracto de P. guajava (1 g/100 mL), Crofelemer (1 g/100 mL) y loperamida (10 mM). Para la configuración del experimento, se utilizaron hembras o machos vírgenes de 6-7 días de edad. Cada placa de Petri contenía seis moscas y se realizaron seis réplicas. Las moscas se criaron durante 24 h, y luego se analizó cada grupo. Se utilizó la prueba t de student para comparar la diferencia significativa entre los grupos de prueba. Los resultados demuestran que el número de depósitos fecales (Figura 3A), el área total de depósitos (Figura 3B) y el IOD total (Figura 3C) exhibieron valores significativamente más altos en el grupo de alimento normal en comparación con el grupo de extracto de P. guajava (1 g/ 100 mL), tanto en hembras como en machos vírgenes. Desafortunadamente, la loperamida no mostró ningún efecto en ambos sexos (pero ya se demostró que actúa como agente antiespasmódico en D. melanogaster)34 mientras que Crofelemer tuvo un efecto solo en las hembras.
Figura 3: Análisis de deformación ITPi . La cepa ITPi se analizó bajo cuatro condiciones: alimentación con alimentos normales, alimentos suplementados con 1 g/100 mL de extracto de P. guajava , 1 g/100 mL de Crofelemer y 10 mM de Loperamida. Los datos se presentan como media ± DE de cada condición tanto en mujeres como en hombres (para seis réplicas de dos lados de una placa de Petri). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t de student comparando dos grupos. Los valores p se muestran de la siguiente manera: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Se comparó el número de depósitos fecales de la cepa ITPi en moscas alimentadas con alimentos suplementados con 1 g/100 mL de Crofelemer, 10 mM de Loperamida, 1 g/100 mL de extracto de P. guajava y en moscas alimentadas con alimentos normales. Además, también se analizó la diferencia en el número de depósitos fecales entre hembras y machos vírgenes. En ambos grupos, el número de depósitos fecales fue significativamente mayor en las moscas alimentadas con alimento normal que en las alimentadas con 1 g/100 mL de extracto de P. guajava . (B) Se comparó el área total de depósitos fecales de la cepa ITPi en moscas alimentadas con alimentos normales y en moscas alimentadas con alimentos suplementados con 1 g/100 mL de extracto de P. guajava , 1 g/100 mL de Crofelemer y 10 mM de Loperamida. En machos y hembras, el área total de depósitos fecales fue significativamente mayor en las moscas alimentadas con alimento normal que en las alimentadas con 1 g/100 mL de extracto de P. guajava . (C) Se analizó la diferencia en la IOD total de la cepa ITPi entre moscas alimentadas con alimentos normales y moscas alimentadas con alimentos suplementados con 1 g/100 mL de extracto de P. guajava , 1 g/100 mL de Crofelemer y 10 mM de Loperamida. En machos y hembras, la IOD total fue significativamente mayor en las moscas alimentadas con alimento normal que en las alimentadas con 1 g/100 mL de extracto de P. guajava . Abreviaturas: F = Mujer; M = Hombre; Crofe = Crofelemer; Lope = Loperamida; Ni comida = Comida normal; P. gua ext = Extracto de Psidium guajava . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para demostrar que la reducción de la excreción observada en el grupo de extracto de P. guajava se debe al efecto inhibidor del extracto y no a un menor consumo de alimentos, se realizó el método de estimación de la ingesta directa y seguimiento del consumo de alimentos sólidos (DIETS)35. Los resultados mostraron que no hubo diferencias significativas en el consumo de alimentos entre los grupos con fármacos suministrados y los que no los tuvieron, a excepción de la loperamida en los machos, lo que provocó que las moscas consumieran menos alimento de lo normal (Figura 4).
Figura 4: Ensayo de alimentación. El ensayo de alimentación midió el consumo de alimentos sólidos en moscas. Las moscas fueron alimentadas con cuatro medios diferentes: 1 g/100 mL de extracto de P. guajava , 1 g/100 mL de Crofelemer, 10 mM de loperamida y alimento normal. Cada grupo estaba formado por 20 moscas con cinco réplicas. Los datos se presentan como media ± DE de cada condición tanto en mujeres como en hombres. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t de student comparando dos grupos. Los valores de p se muestran de la siguiente manera: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los depósitos fecales y los resultados de los ensayos de alimentación mostraron que el extracto de P. guajava es una planta medicinal confiable para tratar la diarrea en moscas de la fruta.
Figura complementaria 1:Ventana de apertura de T.U.R.D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Ventana T.UR.D. con la configuración a ajustar. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Ventana T.U.R.D. con una imagen anotada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 4: Ventana T.U.R.D. que presenta cada punto detectado a partir de una imagen ya procesada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 5: Ventana T.U.R.D. que presenta cada imagen procesada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 6: Ventana T.U.R.D. que muestra el proceso de exportación de los datos de cada grupo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 1: Guía rápida para el uso del software T.U.R.D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 1: Ejemplo de las hojas de cálculo finales listas para su análisis. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 1: Solicitud de fusión de hojas de cálculo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
D. melanogaster ha sido ampliamente aceptado como modelo para diversos procesos biológicos debido a la similitud en los genes entre D. melanogaster y los humanos36. El uso de D. melanogaster como modelo para estudiar el tracto intestinal es prevalente y la aplicación de T.U.R.D. se ha utilizado para estimar el número, área y cantidad de depósitos fecales. Sin embargo, el método de detección fenotípica no se ha utilizado para evaluar la diarrea en moscas de la fruta. Por lo tanto, este protocolo introduce un nuevo método para evaluar de forma aproximada la presencia de diarrea mediante la detección de los depósitos fecales.
Los depósitos fecales son un indicador esencial de la función y la salud del tracto intestinal37. En este contexto, se propone un método para la cría de D. melanogaster en un medio que contiene drogas para investigar varios parámetros de los depósitos fecales. Mediante el control del número de depósitos, es posible determinar la frecuencia de defecación y evaluar si un fármaco tiene algún impacto en el tránsito intestinal. El área total de los depósitos se puede medir para evaluar la concentración y dilución de materia fecal, que es un factor importante para determinar la salud general del tracto intestinal. Además, la densidad óptica integrada total (IOD) se puede utilizar para detectar la cantidad total de materia fecal presente en los depósitos. Este protocolo proporciona un método eficaz para detectar y evaluar los fármacos, así como los extractos de plantas que afectan al tracto intestinal. Cuando se utiliza D. melanogaster como organismo modelo, es posible evaluar la eficacia de posibles fármacos, lo que puede ayudar a acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos. Al aplicar este método en extractos de plantas, los investigadores pueden ayudar a validar su uso como agentes antidiarreicos.
Hay varios pasos críticos a tener en cuenta cuando se utiliza este protocolo para estudiar los depósitos fecales en D. melanogaster. En primer lugar, es fundamental calcular la masa necesaria para alcanzar la concentración deseada del fármaco en el medio. Además, es importante garantizar un buen estado de preparación al agregar el medicamento al medio, ya que las altas temperaturas pueden degradar el medicamento y afectar su potencia. En segundo lugar, la selección de moscas hembras es importante en este protocolo. Es importante utilizar moscas hembras vírgenes para evitar las diferencias en la producción fecal entre las hembras vírgenes y las apareadas. Por ejemplo, las manchas producidas por las hembras vírgenes son más circulares que las hembras apareadas, y las hembras apareadas tienden a excretar más materia fecal que las hembras vírgenes27,28. Por lo tanto, se recomienda recolectar moscas antes de las 8 h de eclosión para asegurarse de que todas las hembras recolectadas sean vírgenes. Además, las moscas analizadas deben ser fuertes y saludables, ya que su salud puede influir en la ingesta de alimentos y la producción fecal. Por ejemplo, las moscas que tienen una forma anormal de las alas pueden tener dificultades para obtener la comida. Por último, para utilizar T.U.R.D. con éxito, el tamaño del bloque (píxeles) y los ajustes de desplazamiento son cruciales. Debido a la diferencia en el contraste de luz de las imágenes, puede ser necesario probar diferentes configuraciones para lograr la mejor identificación posible de los depósitos fecales.
Aunque el método presentado es efectivo, existen varias limitaciones. Una de ellas es la precisión de la concentración del fármaco en el medio. A medida que el medio se calienta durante la preparación, parte del agua puede evaporarse, lo que puede afectar la concentración del medicamento. Otra limitación es el escaneo de las placas de Petri. Algunas partes de las placas de Petri (es decir, los bordes) no se escanean, y esto podría resultar en un cálculo erróneo de los depósitos fecales totales. Además, las moscas no producen la misma cantidad de depósitos fecales en las cubiertas superior e inferior de las placas de Petri. Debido a que tienden a producir más depósitos en la cubierta inferior, la desviación estándar del análisis entre la cubierta superior e inferior puede ser alta, lo que puede afectar la precisión de los resultados.
Con este protocolo, los investigadores pueden estudiar la diarrea en D. melanogaster. Al modificar el medio que contiene el fármaco, este método se puede utilizar para detectar plantas antidiarreicas, lo que proporciona un enfoque novedoso para el descubrimiento de fármacos. La medicina tradicional y los productos naturales se han utilizado durante siglos para tratar diferentes enfermedades, incluidos los trastornos gastrointestinales. Al utilizar este protocolo para evaluar la eficacia de los extractos de plantas en los depósitos fecales, se pueden identificar nuevos tratamientos potenciales para los trastornos del tracto intestinal y se puede proporcionar una justificación científica para su uso como agentes antidiarreicos. Este enfoque puede proporcionar una valiosa contribución al campo del descubrimiento de fármacos y la etnofarmacología.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Dra. Martina Gáliková por proporcionarnos las cepas de Drosophila . Agradecemos al equipo de Michelle Crozatier-Borde y Marc Haenlin por dar su opinión sobre nuestro estudio y ayudarnos a mejorar nuestro modelo. Nos gustaría agradecer a Napo Pharmaceuticals Company por proporcionarnos el medicamento Crofelemer. Los autores también agradecen al editor invitado, el Dr. Hugues Petitjean, por brindarnos la oportunidad de publicar este protocolo. Este estudio fue financiado por la Agence Nationale de la Recherche (ANR) en el marco del proyecto ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
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