Summary
Här beskrivs en metod för att mata Drosophila melanogaster med läkemedel och växtextrakt och bedöma deras effekt på mag-tarmkanalen genom att analysera bananflugornas avföringsavlagringar. De läkemedelsbehandlade flugorna kan användas som modell för vidare forskning.
Abstract
För att studera människans mag-tarmfysiologi har biomedicinska forskare förlitat sig på användningen av modellorganismer. Även om många forskare har använt möss som modell för att studera tarmfunktionen, har endast ett fåtal rapporter fokuserat på Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Jämfört med möss har bananflugor många fördelar, såsom en kort livscykel, kostnadseffektivt och enkelt underhåll och inga etiska problem. Dessutom är däggdjurens gastrointestinala fysiologi, anatomi och signalvägar mycket bevarade i D. melanogaster. Växtextrakt har traditionellt använts för att behandla diarré och förstoppning. Till exempel är Psidium guajava (P. guajava) ett av de mest kända antidiarrémedlen i tropikerna. Inga studier har dock utvärderat effekten av antidiarré och laxermedel och växtextrakt i D. melanogaster, och det är fortfarande okänt om liknande effekter (t.ex. mindre, mer koncentrerade och mindre rikliga avföringsavlagringar när det gäller läkemedel mot diarré) kan förekomma hos bananflugor jämfört med däggdjur. I denna studie demonstreras en antidiarréeffekt inducerad av P. guajava i en D. melanogaster-stam som uppvisar en diarréfenotyp. Avföringsprovtagningen som flugorna producerar följs upp med hjälp av ett foder som innehåller tillsats av färgämnen. Detta protokoll beskriver den metod som används för att tillaga mat med läkemedel, utvärdera avföringsavlagringarna hos flugor som matas med dessa matberedningar och tolka de erhållna uppgifterna.
Introduction
Mag-tarmkanalen (GI), även kallad matsmältningskanalen, ansvarar för matsmältningen och absorptionen av näringsämnen och utsöndringen av osmälta produkter1. Mag-tarmkanalen är sårbar för en rad sjukdomar som kan orsaka obehag, smärta och störningar i det dagliga livet. Gastrointestinala störningar inkluderar buksmärta och obehag, uppblåsthet, halsbränna, matsmältningsbesvär eller dyspepsi, illamående, kräkningar, diarré och förstoppning2. Diarré är det vanligaste symtomet på gastrointestinalsjukdom 3, och det definieras som en sjukdom med minst tre lösa och vattniga avföring under en 24-timmarsperiod4. Diarré orsakas av ett brett spektrum av patogener, inklusive bakterier, virus, parasiter, svampar, och kan också orsakas av läkemedel 5,6. Globalt sett fortsätter diarré att vara den näst vanligaste dödsorsaken bland barn under5 år. Även om diarré kan lösa sig själv, kan det också indikera ett allvarligare underliggande tillstånd om det varar i mer än några dagar.
För att studera tarmkanalen vänder sig forskarna till djurmodeller som möss, råttor och grisar 8,9. Användningen av dessa djur kan dock vara dyr och tidskrävande eftersom de kräver specialiserade faciliteter och etiska överväganden. Nyligen genomförda studier har visat att D. melanogaster kan användas som en modell för att studera mag-tarmkanalen och undersöka vissa mekanismer såsom upprätthållandet av regenerativ homeostas, utvecklingen av immunåldrande, förlusten av epitelbarriärfunktion och nedgången i metabolisk homeostas10,11. D. melanogaster, känd som bananflugan, delar en hög grad av genetisk homologi med människor; Cirka 75 % av människans sjukdomsgener tros ha en funktionell homolog hos fluga12. De har också ett enkelt matsmältningssystem som består av en framtarm, en mellantarm och en baktarm13. D. melanogaster är lätt att odla i laboratorium och kan genmodifieras på olika sätt14. Att använda D. melanogaster för in vivo-testning är därför ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för forskare att studera komplexa biologiska processer i en kontrollerad miljö.
Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) använder cirka 80 % av människorna som bor i utvecklingsländer traditionell medicin för sina primära hälsobehov15. Den höga användningen av medicinalväxter kan förklaras av att de är lättillgängliga, billiga och har fåbiverkningar. De viktigaste växtdelarna som används i örtterapi inkluderar blad, bark, rötter, frön17 medan de viktigaste beredningsmetoderna är infusion, avkok och maceration18. Dessa växtbaserade läkemedel innehåller fytokemiska ämnen som alkaloider, terpenoider, flavonoider, steroider, tanniner och kolhydrater19, som har terapeutiska effekter på människokroppen. Människor använder en mängd olika medicinalväxter för att behandla gastrointestinala störningar som diarré, magont och dysenteri20. Till exempel är Psidium guajava en av de mest använda växterna för att behandla diarré i världen. Olika farmakologiska och kliniska tester har redan visat dess säkerhet, vilket gör det till en bra antidiarrékandidat att studera21,22. De största begränsningarna med växtbaserade läkemedel är dock bristen på effektivitets- och säkerhetsbedömning, samt bristen på definitiv och fullständig information om sammansättningen av växtextrakt som används23. För att validera växtbaserade läkemedels effektivitet och säkerhet krävs ett systematiskt tillvägagångssätt som inbegriper experimentell och klinisk validering, och tillvägagångssättet bör stödjas av tillräckliga data från in vivo- och in vitro-studier.
För att utvärdera traditionella botemedel för deras effektivitet vid behandling av diarré har användningen av möss och råttor varit dominerande under de senaste decennierna24,25. På grund av de viktigaste fördelarna som nämnts tidigare, dvs användarvänlighet, prisvärda, replikerbara, bevarade absorptions- och matsmältningsfunktioner mellan flugor och däggdjur, föreslår vi att använda D. melanogaster som en modell för att utvärdera växternas antidiarréaktivitet. Den diarréiska fenotypen i D. melanogaster kan karakteriseras av flera egenskaper, inklusive ökat överflöd av fekala avlagringar, större avlagringar, en ljusare färgning (mindre koncentrerad) och högre fekalt material26. Denna fenotyp kan kvantifieras med hjälp av olika parametrar: antal fekala avlagringar, total yta av avlagringar, genomsnittlig ljushet och total integrerad optisk densitet (IOD). Total IOD definieras som det totala färgämnesinnehållet i avlagringen, vilket innebär det totala fekala materialet som utsöndras27. Tidigare har en analys utvecklats för att analysera fekala avlagringar av D. melanogaster27,28. I denna analys användes den ultimata avsaknaden (T.U.R.D.) som ett fekalt analysverktyg, vilket gör det möjligt att kontrollera antalet, storleken och lättheten hos avföringsavlagringar och därmed övervaka bananflugornas tarmfysiologi. Denna metod användes dock aldrig för att utvärdera den diarréiska fenotypen hos flugor. Ion Transport Peptide (ITP)-genen är en viktig endokrin regulator av törst och utsöndring och kombinerar vattenhomeostas med utfodring i D. melanogaster. I en nyligen genomförd studie visade det sig att hastigheten på mattransiteringen genom mag-tarmkanalen och frekvensen av avföringshändelser minskade av ITP-överuttryck och ökade av ITP-knockdown. Den senare fenotypen beskrevs som diarré av författarna till denna studie29.
I detta protokoll används en modifierad version av fekalavlagringsanalysen för att bedöma effekten av ett antidiarrémedel (dvs. guavabladsextrakt) på mag-tarmkanalen hos D. melanogaster genom att använda ITPi-stammen som en diarrémodell. Det övergripande målet med denna metod är: 1) att tillhandahålla en enkel och tillförlitlig metod för att utvärdera den antidiarréa effekten av läkemedel och växtextrakt, och 2) att möjliggöra upptäckten av bioaktiva föreningar som är ansvariga för antidiarréeffekten i växtextrakt genom att tillämpa ett bioaktivitetsstyrt tillvägagångssätt.
Protocol
1. Beredning av växtextrakt
- Samla in blad av Psidium guajava L.30 från ett fullvuxet träd och bearbeta enligt följande: torka bladen i ugn vid 40 °C i 6 dagar, lufttorka sedan i 6 dagar, torka sedan igen i ugnen vid 40 °C i 4 dagar och förbered slutligen bladpulvret genom att mala de torra bladen i en kvarn eller en kaffekvarn.
- Laka 100 g av det torkade pulvret i 1 l 96 % etanol i 24 timmar under kontinuerlig omrörning med hjälp av en shaker. Behandla växtresterna på samma sätt en gång till och indunsta filtraten så att de blir torra med hjälp av en roterande vakuumindunstare under reducerat tryck (175 mbar) vid 40 °C.
- Lös upp växtextraktet i etanol för att få önskad koncentration. Bestäm den optimala koncentrationen (med hjälp av protokollet som beskrivs här) genom att testa en serie koncentrationer.
- För växtextrakt, testa ett koncentrationsintervall på 100 μg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 100 mg/ml och använd de som inte påverkar flugans överlevnadsgrad. För rena föreningar, testa följande koncentrationsintervall: 0,05, 0,5, 5 och 50 mM12.
2. Förbereda matmedium
- Mät upp 100 ml destillerat vatten och häll i bägaren med 4 g socker och 0,8 g agar (se materialtabell). Värm till 100 °C (under omrörning) och låt verka i 10 min.
- Sänk temperaturen till 80 °C, tillsätt 7,4 g mjöl och 2,8 g jäst under omrörning. Värm i minst 20 minuter, rör om och kontrollera temperaturen som ska ligga runt 80 °C.
- Tillsätt moldex-propionsyralösningen (1 ml moldex och 0,3 g propionsyra blandas väl). Vänta tills temperaturen sjunker till cirka 50 °C, tillsätt växtextraktlösningen (1 mg/ml) och 0,5 g bromfenolblått pulver.
OBS: Se avsnitt 1.3.1 för mer information om de andra koncentrationer som ska testas. - Häll maten i petriskålarna och sluta när petriskålen är full (Figur 1A). Låt petriskålarna svalna till rumstemperatur (ca 3 h), stäng sedan locket och förvara i kylskåp vid 4 °C.
OBS: Petriskålar bör förvaras i kylen i högst 2 veckor för att undvika vattenavdunstning.
Figur 1: Demonstration av den experimentella processen för avföringstestet. (A) Bild som visar petriskålar fulla med matmedium. Se till att ha tillräckligt med mat i petriskålen, så att inga luckor fångar flugorna och hindrar dem från att röra sig. Överbelasta dock inte petriskålen med mat så att ytan kan täckas jämnt. (B) Bild av spateln enligt beskrivningen i protokollet. C) Bild av avföringstestet enligt beskrivningen i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Förbereda flugor
- Förbered CO2 -tankarna, CO2 blåspistolen med nålar, flugdyna, pensel och mikroskop. Flugstationen levererar CO2 till både flugdynan och blåspistolen. Flugdynan används för att sortera flugor, medan CO 2-blåspistolen används för att bedöva flugor i flaskor, flaskor och petriskålar.
- Standardisera åldern på flugorna genom att välja flaskor som innehåller puppor (minst 10) och kassera de vuxna flugorna från röret med följande metod. Vänd injektionsflaskorna upp och ner en efter en och för in nålen mellan bomullspluggen och injektionsflaskans sidovägg. Bedöva vuxna flugor med CO2 blåspistolen tills alla flugor sover på bomullspluggen (några sekunder behövs för att bedöva dem, och bedövningsåtgärden kommer att pågå i några sekunder efter att blåspistolen släppts). Öppna injektionsflaskan ovanför en glasflaska som innehåller 70 % etanol och släpp ner flugorna i den. Stäng injektionsflaskan med bomullspluggen och förvara den i en inkubator vid 25 °C med 60 % luftfuktighet. Ställ in inkubatorns ljuscykel på 12 timmar ljust/12 timmar mörkt.
- Efter ruvningen (max 8 timmar) sorterar du dem i jungfruliga honor och hanar under mikroskopet och flugdynan genom att vända dem på rygg och titta på deras könsorgan.
- Kvinnliga könsorgan är bleka jämfört med manliga könsorgan, som är rödaktiga. Hanar kan också identifieras genom närvaron av mörka borst, så kallade könskammar, på deras främre benpar. Dela flugorna i två färska rör (ett för hanar och ett för honor) och ruva dem i 6-8 dagar vid 25 °C.
OBS: Vid 25 °C förblir honorna ogifta i cirka 8 timmar efter kläckningen.
- Kvinnliga könsorgan är bleka jämfört med manliga könsorgan, som är rödaktiga. Hanar kan också identifieras genom närvaron av mörka borst, så kallade könskammar, på deras främre benpar. Dela flugorna i två färska rör (ett för hanar och ett för honor) och ruva dem i 6-8 dagar vid 25 °C.
4. Test av avföring
- Märk petriskålarna med motsvarande stam, kön och läkemedel för att undvika förväxling mellan petriskålarna. Stapla petriskålarna på varandra.
- Ta petriskålarna som innehåller den färgade maten och vänd dem på läskpapperet för att absorbera den extra vätskan. Använd en spatel (Figur 1B), skär maten i 12 lika stora delar och använd sedan spateln för att lägga en skiva i en tom petriskål.
OBS: Beroende på antalet replikat kan antalet skivor som ska skäras ökas upp till 20 per petriskål. Varje skiva ska vara lika stor. - Bedöva flugorna med CO2 tills alla flugor sover på bomullspluggen. Överför sex friska flugor i varje petriskål (Figur 1C) och stäng locket omedelbart och placera dem sedan i inkubatorn (25°C, 60 % luftfuktighet, 12 timmar ljust/12 timmar mörkt).
- För att se till att flugorna inte rymmer från petriskålen under experimentet kan du fästa petriskålens övre och nedre lock med en tejp. För varje testgrupp förbereder du (minst) sex replikerade petriskålar.
- Efter att ha låtit flugorna växa i 24 timmar, använd CO2 för att bedöva dem, överför flugorna till en behållare fylld med 70 % etanol och kassera eventuell kvarvarande mat.
- Behåll petriskålarna och fortsätt till steg 5.
5. Kvantifiering av petriskålar
- Ställ in en mapp på datorn och byt namn på den genom att inkludera experimentstammens namn, flugornas kön och vilken typ av läkemedel som används. I den här mappen skapar du undermappar med namnen Original, Klipp ut och Analys.
- Skanna petriskålarna med hjälp av en högupplöst skanner med en optisk upplösning på 6 400 pixlar per tum (ppi). Skanna de övre och nedre luckorna på varje petriskål separat genom att placera dem individuellt i mitten av skannerfältet.
- Öppna programmet som är installerat på datorn. Ett välkomstfönster öppnas på datorskärmen med alla allmänna inställningar (Figur 2A).
OBS: Ändra inte de avancerade inställningarna. Detta steg är endast giltigt för användare som har samma skanner som föreslås i materialtabellen. Se riktlinjerna om du använder en annan programvara.- Namnge petriskålen i ansökan genom att ange sekvensnummer, topp- eller bottenlock, kön och typ av mat som används. Välj den ursprungliga undermappen i steg 5.1.
- Förhandsgranska petriskålen. Klicka på Förhandsgranska längst ner i fönstret, vänta några sekunder tills skannern förskannar, sedan visas ett fönster på datorskärmen. Flytta fyrkanten som visas på skärmen för att omge petriskålen.
- Klicka på Skanna längst ner till höger i fönstret på datorskärmen, skanningen sparas automatiskt som en bild i den valda mappen.
- Beskär bilden med hjälp av ett program (t.ex. Fiji-programmet med öppen källkod), så att inga artefakter och matrester betraktas som avlagringar.
OBS: Följande steg är endast giltiga för användare som har Fiji-applikationen. Se riktlinjerna om du använder en annan programvara.- Öppna Fiji-applikationen, vänta några sekunder tills ett verktygsfält visas på skärmen.
- Dra bilden som ska beskäras till verktygsfältet. Välj den 3:e ikonen Polygonval i verktygsfältet, beskär den oönskade delen av fotot (det färgade cirkeldiagrammet) genom att klicka på skärmen för att markera en vinkel runt cirkeldiagrammet (Figur 2B-1,2).
OBS: När du avgränsar beskärningsområdet i en bild är det absolut nödvändigt att de valda ramarna är sömlöst anslutna från början till slut. - Klicka på Redigera längst upp till vänster i fältet och sedan på Fyll i/Rensa utanför (Figur 2B-3).
- För att spara fotot, klicka på Arkiv längst upp till vänster i fältet, sedan på Spara som och slutligen på Tiff. Välj undermappen Klippset i steg 5.1.
OBS: När du sparar den beskurna bilden, se till att inga specialtecken (t.ex. !, &, $, #, _,-,...) eller för många tecken finns i filnamnet.
Figur 2: Viktiga steg i processen att analysera data från avföringstestet. (A) Skärmdump som visar inställningsinformationen för skanningsapplikationen. (B) Bilder som beskurits med Fiji-applikationen. Se till att inga artefakter och matrester betraktas som avlagringar. (C) Skärmbild som visar hur det ser ut när du öppnar Excel_merge-v4-programmet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Identifiering av fekala avlagringar med hjälp av den ultimata läsaren av dyngprogramvara med öppen källkod
OBS: Introduktionen och användningen av den ultimata läsaren av dyngprogramvara finns i Tilläggsfil 1.
- Öppna först T.U.R.D.-programvaran (kompletterande figur 1). Skapa ett nytt experiment och ge dokumentet ett namn och spara det sedan i undermappen Analys som anges i steg 5.1.
- Klicka på Plattor och sedan på Lägg till platta. Välj den petriskål som ska bearbetas. Ett nytt fönster visas med namnen på de valda plattorna och nya parametrar. Ställ in blockstorlek, offset, minstorlek och maxstorlek (kompletterande figur 2).
- För att verifiera att de fekala avlagringarna som upptäckts är de rätta, klicka på Plattor, sedan Inspektera valda plattor, sedan Grafik och Visa kommenterade bilder (Kompletterande figur 3). Zooma in och titta på räkningarna. Om det bara finns ett fåtal fyndigheter som inte ska ingå i analysen, avmarkera de fyndigheter som ska undantas (tilläggsfigur 4).
- Starta om från steg 6.3 för varje ny avbildning som ska bearbetas.
- Efter att ha analyserat plattorna med T.U.R.D.-programvaran, ändra antalet flugor genom att klicka på Nej. Flugor (tilläggsfigur 5).
- Ändra gruppnamnet genom att klicka på Plattor > Redigera grupper > Lägg till och sedan välja gruppnamnet i kolumnen Grupp .
- Exportera de olika replikeringsdata separat genom att klicka på Analysera > beskrivande statistik > Välj grupp (tilläggsfigur 6). Behåll alla kalkylbladsfiler (.csv) i samma mapp.
- För att samla alla filer (erhållna i steg 6.7) i ett unikt kalkylblad, öppna programmet Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), vänta tills följande mening visas Välj sökvägen till mappen (med .csv filer):, och klistra sedan in mappadressen ovan. Sökvägen kan till exempel vara C:\Experiment\Fecal deposit test\ och klicka sedan på Enter två gånger på tangentbordet (bild 2C). Därefter skapas en ny kalkylbladsfil i samma mapp. Den nya kalkylarksfilen innehåller alla exporterade filer i olika ark.
- I föregående kalkylbladsfil lägger du till ytterligare ett blad för att samla in medelvärdet av varje parameter för alla replikat (använd funktionen LETARAD för att bearbeta data). Ett exempel ges i tilläggstabell 1.
- Analysera p-värdet.
Representative Results
Studien som presenteras här visar att mätningen av diarré hos D. melanogaster kan uppnås genom användning av fekal depositionsanalys. Signifikanta skillnader mellan fenotyperna (diarré eller inte) kan bestämmas genom att analysera olika parametrar, inklusive antalet fekala avlagringar, den totala arean av avlagringar, medelarean av avlagringar, den genomsnittliga ljusheten och den totala integrerade optiska densiteten (IOD), som är ett mått på den totala mängden färgämne som finns i avlagringen och representerar det totala fekala materialinnehållet som utsöndras27.
ITP-genknockdown hos flugor kan inducera en diarréfenotyp, kännetecknad av ökad avföringsfrekvens, vilket gör dem till en lämplig modell för att studera diarré29. I samband med detta experiment användes ITPi-stammen (w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) och odlades på ett standardmedium. Psidium guajava bladextrakt valdes som antidiarréintervention, med tanke på den utbredda användningen av denna växt i tropiska regioner för att hantera diarré. Crofelemer, ett medel mot diarré, godkändes av US Food and Drug Administration (FDA) för att ge symtomatisk lindring av icke-infektiös diarré hos vuxna patienter med HIV/AIDS som genomgår antiretroviral behandling31. Crofelemer är ett extrakt från latex av Croton lechleri Müll.Arg. Stambark32. Loperamid är ett syntetiskt läkemedel som används över hela världen för att behandla diarré33. Både Crofelemer och Loperamid användes som potentiella positiva kontroller.
Hypotesen var att utfodring av flugor med P. guajava-extrakt , Crofelemer och Loperamid skulle minska diarréfenotypen jämfört med de som matades med vanlig föda. För att undersöka denna hypotes utfördes en mätning av fekala avlagringar i D. melanogaster genom att jämföra flera parametrar mellan flugor som matats med normal föda och de som matats med P. guajava-extrakt (1 g/100 ml), Crofelemer (1 g/100 ml) och Loperamid (10 mM). För experimentet användes 6-7 dagar gamla jungfruliga honor eller hanar. Varje petriskål innehöll sex flugor, och sex replikat genomfördes. Flugorna föddes upp i 24 timmar och sedan analyserades varje grupp. Studenternas t-test användes för att jämföra den signifikanta skillnaden mellan testgruppen. Resultaten visar att antalet fekala avlagringar (Figur 3A), den totala ytan av avlagringar (Figur 3B) och den totala IOD (Figur 3C) uppvisade signifikant högre värden i den normala livsmedelsgruppen jämfört med P. guajava-extraktgruppen (1 g/100 ml), hos både jungfruliga honor och hanar. Tyvärr visade Loperamid ingen effekt hos båda könen (men det har redan visats att det fungerar som ett kramplösande medel hos D. melanogaster)34 medan Crofelemer endast hade effekt på kvinnor.
Figur 3: ITPi-stamanalys . ITPi-stammen analyserades under fyra förhållanden: utfodring av vanlig mat, mat kompletterad med 1 g/100 ml P. guajava-extrakt , 1 g/100 ml Crofelemer och 10 mM Loperamid. Data presenteras som medelvärde ± SD för varje tillstånd hos både honor och hanar (för sex replikat av två sidor av en petriskål). Statistisk analys utfördes med hjälp av en elevs t-test som jämförde två grupper. p-värden visas enligt följande: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Antalet fekala avlagringar av ITPi-stammen jämfördes hos flugor som utfodrades med foder som kompletterats med 1 g/100 ml Crofelemer, 10 mM Lopermid, 1 g/100 ml P. guajava-extrakt och hos flugor som utfodrades med normal föda. Dessutom analyserades skillnaden i antalet avföringsavlagringar mellan jungfruliga honor och hanar. I båda grupperna var antalet fekala avlagringar signifikant högre hos flugor som utfodrades med normal föda än hos de som utfodrades med 1 g/100 ml P. guajava-extrakt . (B) Den totala arean av fekala avlagringar av ITPi-stammen jämfördes hos flugor som utfodrats med normal föda och hos flugor som matats med foder som tillförts 1 g/100 ml P. guajava-extrakt , 1 g/100 ml Crofelemer och 10 mM loperamid. Hos hanar och honor var den totala ytan av fekala avlagringar signifikant högre hos flugor som utfodrades med normal föda än de som utfodrades med 1 g/100 ml P. guajava-extrakt . (C) Skillnaden i den totala IOD för ITPi-stammen analyserades mellan flugor som utfodrades med normal föda och flugor som utfodrades med foder som kompletterats med 1 g/100 ml P. guajava-extrakt , 1 g/100 ml Crofelemer och 10 mM Loperamide. Hos hanar och honor var det totala IOD signifikant högre hos flugor som utfodrades med normal föda än hos de som utfodrades med 1 g/100 ml P. guajava-extrakt . Förkortningar: F = kvinna; M = Hane; Crofe = Crofelemer; Lope = Loperamid; Inte heller mat = Vanlig mat; P. gua ext = Psidium guajava extrakt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att visa att den minskade utsöndringen som observerats i P. guajava-extraktgruppen beror på extraktets hämmande effekt och inte på en minskad livsmedelskonsumtion, utförde vi metoden för uppskattning och spårning av direkt intag och spårning av fast föda (DIETS) metod35. Resultaten visade att det inte fanns några signifikanta skillnader i födointag mellan de läkemedelsförsörjande grupperna och de som inte hade läkemedel, förutom loperamid hos hanarna, som gjorde att flugorna åt mindre mat än normalt (Figur 4).
Figur 4: Utfodringsanalys. Utfodringsanalysen mätte flugornas konsumtion av fast föda. Flugorna utfodrades med fyra olika medier: 1 g/100 ml P. guajava-extrakt , 1 g/100 ml Crofelemer, 10 mM Loperamid och vanligt foder. Varje grupp bestod av 20 flugor med fem replikat. Data presenteras som medelvärde ± SD för varje tillstånd hos både kvinnor och män. Statistisk analys utfördes med hjälp av en elevs t-test som jämförde två grupper. p-värden visas enligt följande: *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001, ****: p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Avföringsavlagringarna och resultaten från utfodringsanalysen visade att P. guajava-extrakt är en pålitlig medicinalväxt för att behandla diarré hos bananflugor.
Kompletterande figur 1: T.U.R.D. öppningsfönster. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: T.UR.D.-fönster med inställningar som ska justeras. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: T.U.R.D.-fönster med en kommenterad bild. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: T.U.R.D.-fönster som visar varje upptäckt punkt från en bild som redan har bearbetats. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 5: T.U.R.D.-fönster som visar varje bearbetad bild. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 6: T.U.R.D.-fönster som visar processen för att exportera data för varje grupp. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: Snabbguide för användning av T.U.R.D.-programvaran. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Exempel på de slutliga kalkylbladen som är klara för analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: Applikation för sammanslagning av kalkylblad. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
D. melanogaster har blivit allmänt accepterad som en modell för olika biologiska processer på grund av likheten i gener mellan D. melanogaster och människor36. Användningen av D. melanogaster som en modell för att studera tarmkanalen är utbredd och tillämpningen av T.U.R.D. har använts för att uppskatta antalet, arean och mängden avföringsavlagringar. Den fenotypiska detektionsmetoden har dock inte använts för att bedöma diarré hos bananflugor. Därför introducerar detta protokoll en ny metod för att grovt bedöma förekomsten av diarré genom att upptäcka avföringsavlagringarna.
Avföringsavlagringar är en viktig indikator på tarmkanalens funktion och hälsa37. I detta sammanhang föreslås en metod för uppfödning av D. melanogaster på läkemedelsinnehållande medium för att undersöka olika parametrar för fekala avlagringar. Genom att övervaka antalet avlagringar är det möjligt att bestämma avföringsfrekvensen och bedöma om ett läkemedel har någon inverkan på tarmtransiteringen. Den totala ytan av avlagringarna kan mätas för att utvärdera koncentrationen och utspädningen av fekalt material, vilket är en viktig faktor för att bestämma tarmkanalens allmänna hälsa. Dessutom kan den totala integrerade optiska densiteten (IOD) användas för att detektera den totala mängden fekalt material som finns i avlagringarna. Detta protokoll ger en effektiv metod för att screena och utvärdera läkemedel samt växtextrakt som påverkar tarmkanalen. När D. melanogaster används som modellorganism är det möjligt att bedöma effekten av potentiella läkemedel, vilket kan bidra till att påskynda läkemedelsupptäcktsprocessen. Genom att tillämpa denna metod på växtextrakt kan forskare hjälpa till att validera deras användning som medel mot diarré.
Det finns flera viktiga steg att tänka på när du använder detta protokoll för att studera fekala avlagringar i D. melanogaster. För det första är det viktigt att beräkna den massa som krävs för att uppnå önskad koncentration av läkemedlet i mediet. Dessutom är det viktigt att säkerställa god förberedelse när du tillsätter läkemedlet till mediet, eftersom höga temperaturer kan försämra läkemedlet och påverka dess styrka. För det andra är urvalet av honflugor viktigt i detta protokoll. Det är viktigt att använda jungfruliga honflugor för att undvika skillnaderna i avföring mellan jungfruliga och parade honor. Till exempel är fläckarna som produceras av jungfruliga honor mer cirkulära än parade honor, och parade honor tenderar att utsöndra mer avföringsmaterial än jungfruliga honor27,28. Därför rekommenderas det att samla flugor före 8 timmars stängning för att säkerställa att alla honor som samlas in är jungfrur. Dessutom bör de testade flugorna vara starka och friska, eftersom deras hälsa kan påverka födointag och avföringsproduktion. Till exempel kan flugor med en normal form av vingar ha svårt att få maten. Slutligen, för att använda T.U.R.D. framgångsrikt, är blockstorleken (pixlar) och offsetinställningarna avgörande. På grund av skillnaden i ljuskontrasten i bilderna kan det vara nödvändigt att prova olika inställningar för att uppnå bästa möjliga identifiering av fekala avlagringar.
Även om den metod som presenteras är effektiv finns det flera begränsningar. En är noggrannheten i läkemedelskoncentrationen i mediet. Eftersom mediet värms upp under beredningen kan en del vatten avdunsta, vilket kan påverka koncentrationen av läkemedlet. En annan begränsning är skanningen av petriskålarna. Vissa delar av petriskålarna (t.ex. kanterna) skannas inte, och detta kan resultera i en felberäkning av de totala avlagringarna. Dessutom producerar flugorna inte samma mängd avföring på de övre och nedre locken på petriskålarna. Eftersom de tenderar att producera mer avlagringar på bottenlocket kan standardavvikelsen för analysen mellan topp- och bottenlocket vara hög, vilket kan påverka resultatens noggrannhet.
Med hjälp av detta protokoll kan forskare studera diarré hos D. melanogaster. Genom att modifiera det läkemedelsinnehållande mediet kan denna metod användas för att screena antidiarréväxter, vilket ger ett nytt tillvägagångssätt för läkemedelsupptäckt. Traditionell medicin och naturprodukter har använts i århundraden för att behandla olika sjukdomar, inklusive gastrointestinala störningar. Genom att använda detta protokoll för att utvärdera effekten av växtextrakt på fekala avlagringar kan potentiella nya behandlingar för tarmsjukdomar identifieras och en vetenskaplig grund för deras användning som antidiarrémedel kan tillhandahållas. Detta tillvägagångssätt kan ge ett värdefullt bidrag till området läkemedelsupptäckt och etnofarmakologi.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Martina Gáliková för att ha försett oss med Drosophila-stammarna . Vi är tacksamma för att Michelle Crozatier-Borde och Marc Haenlin har gett feedback på vår studie och hjälpt oss att förbättra vår modell. Vi vill tacka Napo Pharmaceuticals Company för att de har försett oss med läkemedlet Crofelemer. Författarna är också tacksamma mot gästredaktören Dr. Hugues Petitjean för att ha gett oss möjligheten att publicera detta protokoll. Denna studie finansierades av Agence Nationale de la Recherche (ANR) inom ramen för projektet ANR-22-CE03-0001-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
- Cheng, L. K., et al.
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D.
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H.
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A.
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
