Summary
極低温電子顕微鏡(クライオEM)グリッドに支持層を適用することで、粒子密度を高め、空気と水の界面との相互作用を制限し、ビーム誘起運動を低減し、粒子配向の分布を改善することができます。この論文では、クライオサンプル調製を改善するために、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの単層でコーティングするための堅牢なプロトコルについて説明します。
Abstract
極低温電子顕微鏡(クライオEM)では、精製された高分子を穴あき炭素箔を含有するグリッドに塗布します。次に、分子を吸い取って余分な液体を除去し、約20〜100 nmの厚さのガラス質氷の層で急速に凍結し、幅約1 μmの箔穴に懸濁させます。得られた試料は、極低温透過型電子顕微鏡を用いて画像化され、適切なソフトウェアを用いて画像処理を行った後、原子分解能に近い構造を決定することができる。クライオ電子顕微鏡は広く採用されていますが、サンプル調製は依然としてクライオ電子顕微鏡ワークフローにおける深刻なボトルネックであり、ユーザーは懸濁したガラス質の氷の中でサンプルの挙動が悪いという課題に遭遇することがよくあります。最近では、グラフェンの単一の連続した層でクライオ電子顕微鏡グリッドを修飾する方法が開発されており、グラフェンは支持面として機能し、多くの場合、画像領域内の粒子密度を高め、粒子と空気-水界面の間の相互作用を減らすことができます。ここでは、グラフェンをクライオ電子顕微鏡グリッドに適用し、得られたグリッドの相対的な親水性を迅速に評価するための詳細なプロトコルを提供します。さらに、グラフェンの特徴的な回折パターンを可視化することでグラフェンの存在を確認するEM法についても述べる。最後に、比較的低濃度の純粋なサンプルを用いて、Cas9複合体の2.7 Åの分解能密度マップを迅速に再構築することにより、これらのグラフェン担体の有用性を実証します。
Introduction
単粒子極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、生体高分子を可視化するために広く使用されている方法に進化しました1。直接電子検出 2,3,4、データ取得5、画像処理アルゴリズム 6,7,8,9,10 の進歩により、クライオ電子顕微鏡は、急速に増加する高分子の原子分解能に近い分解能の 3D 構造を生成できるようになりました 11.さらに、このアプローチの単一分子の性質を活用することにより、ユーザーは単一のサンプルから複数の構造を決定することができ12、13、14、15、生成されたデータを使用して不均一な構造アンサンブルを理解することの有望性を強調しています16、17。このような進歩にもかかわらず、クライオ試料グリッド調製のボトルネックは続いています。
クライオ電子顕微鏡による構造特性評価では、生体試料を水溶液に十分に分散させた後、ガラス固化と呼ばれるプロセスで瞬間凍結する必要があります18,19。目標は、通常はアモルファス炭素の層に切り込まれた等間隔の穴に懸濁したガラス化氷の均一な薄層に粒子を捕捉することです。このパターン化されたアモルファスカーボン箔は、銅または金の支持棒のメッシュを支持するTEMグリッドによって支持されています。標準的なワークフローでは、グリッドは、サンプルを塗布する前にグロー放電プラズマ処理を使用して親水性になります。余分な液体は濾紙で吸い取られ、タンパク質溶液が穴を横切って薄い液体膜を形成し、プランジ凍結中に容易にガラス化できます。一般的な課題には、空気水界面(AWI)への粒子の局在化とそれに続く変性20,21,22または好ましい配向の採用23,24,25、粒子の穴内への移動ではなく炭素箔への付着、および穴内の粒子のクラスタリングと凝集26が含まれます.不均一な氷の厚さも懸念事項です。厚い氷は、電子散乱の増加により顕微鏡写真のバックグラウンドノイズのレベルが高くなる可能性がありますが、極端に薄い氷はより大きな粒子を排除する可能性があります27。
これらの課題に対処するために、さまざまな薄いサポートフィルムを使用してグリッド表面をコーティングし、粒子をこれらのサポートに乗せ、理想的には空気と水の界面との相互作用を回避できるようにしています。グラフェン支持体は、部分的には、その高い機械的強度と、支持体層28によって付加されるバックグラウンド信号を低減する最小の散乱断面積と相まって、大きな有望性を示している。グラフェンは、バックグラウンドノイズへの寄与が最小限であることに加えて、顕著な電気伝導率と熱伝導率も示します29。グラフェンおよび酸化グラフェンでコーティングされたグリッドは、より高い粒子密度、より均一な粒子分布30、およびAWI22への局在の減少をもたらすことが示されている。さらに、グラフェンは、さらに次のように修飾することができる支持表面を提供する:1)官能基化31,32,33を通じてグリッド表面の物理化学的特性を調整する。または2)目的のタンパク質の親和性精製を促進する結合剤34,35,36。
本稿では、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェン30の単一の均一な層でコーティングするための既存の手順を変更しました。この変更は、歩留まりと再現性の向上を目的として、プロトコル全体でグリッド処理を最小限に抑えることを目的としています。さらに、プランジング前にグリッドを親水性にする際のさまざまなUV/オゾン処理の有効性を評価するためのアプローチについても説明します。グラフェンでコーティングされたグリッドを用いたクライオ電子顕微鏡サンプル調製のこのステップは重要であり、得られたグリッドの相対的な親水性を定量化する簡単な方法が有用であることがわかりました。このプロトコルを用いて、ガイドRNAおよび標的DNAとの複合体において、触媒的に不活性な 化膿菌 Cas9の高解像度3D再構成を生成することにより、構造決定にグラフェンコーティングされたグリッドを採用することの有用性を実証します。
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Protocol
1. CVDグラフェンの作製
- グラフェンエッチング液を以下のように調製する。
- 4.6 gの過硫酸アンモニウム(APS)を20 mLの分子グレードの水に50 mLのビーカーに溶解して1 Mの溶液にし、アルミホイルで覆います。APSを完全に溶解させながら、手順1.2に進みます。
- メタクリル酸メチル(MMA)コーティング用のCVDグラフェンの切片を調製します。CVDグラフェンの正方形の断面を慎重に切断します。正方形を清潔なペトリ皿内のカバーガラス(50 mm x 24 mm)に移し、スピンコーターへの輸送中にカバーします。
注:18 mm x 18 mmの正方形は、25〜36個のグラフェンコーティングされたグリッドを生成する必要があります。
2. CVDグラフェンをMMAでコーティング
- スピンコーターの設定を、2,500rpmで60秒の高速スピンに設定します。CVDグラフェンを適切なサイズのチャックに慎重に配置します。
注:理想的には、CVDグラフェンは、MMAが真空システムに入るのを防ぐために、選択したチャックの端に1〜2mm伸びます。 - Take/Absorbボタンを押して真空ポンプを作動させ、CVDグラフェンをチャックに固定します。CVDグラフェンスクエアの中心にMMAを塗布し、蓋を閉め、すぐにスタート/ストップボタンを押します。18 mm x 18 mm角のCVDグラフェンの場合、40 μLのMMAで十分です。
- 回転が止まったら、真空ポンプを外し、ピンセットでMMAコーティングされたCVDグラフェンを慎重に回収します。MMAコーティング面が下を向くようにCVDグラフェンを反転させ、ガラスカバーガラスに戻します。
3. グラフェン裏面のプラズマエッチング
- カバーガラス上のCVDグラフェンをグローディスチャージャーに転写し、フラットチップピンセットを使用して25 mAで30秒間グロー放電します。
- カバーガラス上のCVDグラフェンをペトリ皿に戻し、銅エッチングエリアへの輸送中にカバーします。MMAコーティングは、上面のグラフェン層をプラズマエッチングから保護します。
4. 格子サイズのMMAコーティングCVDグラフェンスクエアの切断
- 2組のピンセットを使用して、CVDグラフェンスクエアを支えます。CVDグラフェンの正方形の向きに注意し、ピンセットに取り付けている間はMMA側を上にしてください(CRITICAL)。
- CVDグラフェンを約3 mm x 3 mmの正方形に切断します。このステップでは、2組の逆作用鉗子を使用して、CVDグラフェンの正方形を右側を上にして所定の位置に固定し、3 mm x 3 mmの正方形の端を正方形の残りの部分から切断した後に保持します。
5. MMA被覆CVDグラフェンからの銅基板の溶解
- 3 mm x 3 mmの正方形をAPSソリューションに慎重に浮かべます。各正方形を解放する前に、APSソリューションの表面に接触してください。ビーカーを傾けて、各正方形を浅い角度で溶液に入れることができるようにします。これにより、正方形が沈み込まなくなります。
- ビーカーをアルミホイルで覆い、25°Cで一晩インキュベートします。
6. APSからのMMA/グラフェン膜の除去
- 寸法が12 mm x 50 mmのガラスカバーガラスを使用し、カバーガラスをAPSに垂直に静かに突っ込み、次にカバーガラスを横方向に動かして、浮遊するMMA/グラフェンスクエアに接するようにAPSからMMA/グラフェンスクエアを取り出します。
- カバーガラスを慎重に取り外し、取り外し時に正方形がカバーガラスの側面に完全に付着していることを確認してください。
- MMA/グラフェンスクエアを、分子グレードの水で満たされた清潔な50 mLビーカーに20分間移します。MMA/グラフェンの正方形を水に垂直に取り付けたカバーガラスを静かに沈め、水面との相互作用時に正方形がカバーガラスから外れるようにします。すべてのMMA/グラフェンスクエアについて繰り返します。
7. グラフェンのグリッドへの接着
- ネガティブアクションピンセットを使用して、カーボン側を浮遊するMMA/グラフェンの正方形に向けて、グリッドを垂直に水にそっと浸します。正方形に接触したら、グリッドを慎重に取り外し、取り外し時に正方形がグリッドのカーボン側に完全に付着していることを確認します。水に沈んだときのグリッドの横方向の動きを最小限に抑えて、グリッドの正方形の損傷を防ぎます(CRITICAL)。
- MMA /グラフェン面を上にしてきれいなカバーガラスにグリッドを置き、1〜2分間風乾します。カバーガラスグラフェン/MMAコーティングされたグリッドを、フラットチップピンセットを使用して130°Cに設定されたホットプレートに移します。
- ガラスペトリ皿の上部で覆い、20分間インキュベートします。火から下ろし、室温まで1〜2分間冷まします。
注意: ペトリ皿の上部は非常に高温になるので注意してください。
8.MMAをアセトンで溶解する
- カバーガラス全体を15 mLのアセトンで満たされたペトリ皿に移します。30分間インキュベートします。
- 清潔なガラス製血清ピペットを使用して、グリッドをインキュベートしたアセトンを廃液容器に移します。清潔なガラス製血清ピペットを使用して、15 mLの新鮮なアセトンをペトリ皿に慎重に加えます。30分間インキュベートします。
- これらの洗浄手順を繰り返して、合計3回のアセトン洗浄を行います。
9. イソプロパノールによる残留アセトンの除去
- アセトンを 3 回洗浄した後、アセトンを除去し、清潔なガラス製血清ピペットを使用して 15 mL のイソプロパノールと交換します。20分間インキュベートします。
- イソプロパノール洗浄を合計4回繰り返す。イソプロパノールからグリッドを慎重に取り除き、ピンセットを使用して清潔なカバーガラスで風乾します。
注意: イソプロパノールが残っていると、ピンセットからグリッドを解放するのが難しくなる可能性があります。グリッドをピンセットから外す前に、グリッドと清潔なカバーガラスを接触させることで、この問題を軽減できます。 - グラフェンでコーティングされたグリッドでカバーガラスを100°Cに設定されたホットプレートに10分間移し替えて、残留有機物を蒸発させます。室温まで冷却し、使用するまで真空下で保管してください。
10. グラフェン被覆グリッドのUV/オゾン処理
- 逆作用ピンセットを使用して、グラフェンでコーティングされた面を上にして、UV /オゾンクリーナーのクリーンな照明領域にグリッドをそっと配置します。
- 照明エリアをスライドさせて閉じ、マシンの電源を入れます。 タイムダイヤルを指定された処理時間まで回して、グリッドのUV /オゾン処理を開始します。
注:処理期間は調整可能なパラメータであり、過剰な処理はグリッドを損傷する可能性があります。Han et al.30 は10分間のUV/オゾン処理を推奨しており、10分間の治療で十分であることもわかっています。この治療時間の調整に関するガイダンスについては、手順12を参照してください。. - Koh et al.37 に記載されているプランジステップに従って、処理したグリッドにクライオ電子顕微鏡サンプルを直接プランジします。
注:大気中の炭化水素は、UV /オゾン処理後にグリッド表面に蓄積し、グラフェン表面の疎水性を高める可能性があります38,39。これを回避するには、UV /オゾン処理されたグリッドをすぐにプランジしてください。例えば、UV/オゾンが6つのグリッドを処理し、それらの6つのグリッドを直ちにプランジし、次にUV/オゾンがグリッドの2番目のバッチを処理し、続いて2番目のバッチをプランジするなど、UV/オゾンをバッチで処理することが有利な場合があります。
11. 回折像の撮影
- 顕微鏡が平行照明を確立して適切に調整されていることを確認し、最終的な焦点ぼけを-0.2μmに設定します。
- 蛍光スクリーンを挿入すると、ビームが完全に停止します。回折モードに入ると、回折スポットがはっきりと可視化されます。
- CCDカメラで画像を取得し、画像解析ソフトで評価します。
注:グラフェン単分子膜によって生成される最も容易に観察され識別可能な回折スポットは、空間周波数2.13 Åに対応する6つのスポットです。測定ツールを使用して、回折ビームの中心からこれらの回折スポットの1つまでの距離を逆数単位で推定します。特に 2.13 Å
0.47 Å-1 である。
0.47 Å-1 である。12. グリッド親水性の評価
- イメージング設定を準備します。電話スタンド、卓上イメージング面、カメラ付き電話、ガラスカバーガラス、パラフィンフィルムを用意します。ここに示した画像は、提供された.stlファイルを使用して3Dプリントされた電話スタンドと卓上イメージング面を使用して取得され、より簡単に再現可能で定量化可能な接触角測定が得られました(補足図1A)。
- ガラスカバーガラスを平らな面に置き、1cm×1cm四方のパラフィンフィルムをカットして、ガラスカバーガラスの上に置きます。電話機を電話スタンドに置き、カメラがガラスのカバーガラスと面が合うように電話機の向きを合わせます。輪ゴムを使用して、電話機をこの位置に固定します(補足図1B)。サンプル写真を撮って、カメラがイメージング面に位置合わせされていることを確認します。
- グラフェンでコーティングされたグリッドのUV/オゾン処理の直後に、ガラスカバーガラスの正方形のパラフィンフィルムの上に単一のグリッドを配置します。グラフェン側が上を向いていることを確認します。2μLの水滴をピペットでグリッド面の中央に含め、すぐに撮影します。
注:この手順を次の後に繰り返します:i)十分な治療期間を決定するために、UV /オゾン処理の望ましい間隔。またはii)UV /オゾン処理後の所望の時間間隔で、処理後、グリッド表面が親水性を維持する期間を測定します。 - 写真をImageJ43 にインポートし、接触角プラグインを使用して、写真から接触角を計算します。
13. dCas9複合体データセットの単粒子解析
注:このプロトコルで記述されているすべての画像処理は、cryoSPARCバージョン4.2.1を使用して実行されました。
- Patch Motion Correction ジョブと Patch CTF Estimation ジョブを使用してムービーを前処理します。ブロブピッカージョブを使用して、直径115 Åから135 Åの範囲の球状ブロブを使用してパーティクルピッキングを実行します。
- 正規化相関係数(NCC)と検出力のしきい値を使用して、顕微鏡写真から抽出ジョブを使用して粒子を抽出し、顕微鏡写真あたり約200〜300個の粒子を生成します。適切な閾値と結果として生じる粒子数は異なる場合があり、ユーザーは適切な条件を特定するために、さまざまな顕微鏡写真でピック品質を検査する必要があることに注意してください。
- Ab-initio 再構成ジョブを使用して、3 つのクラスを必要とするマルチクラスの初期再構成を実行します。3 つのクラスのうち 2 つには、表面汚染物質を含む非 Cas9 粒子が含まれている可能性があります。さらに処理するには、dCas9 に似たクラスを選択します。
注:粒子スタックをさらに洗練させるために、マルチクラスAb-initio再構成または不均一次次性再構成の追加ラウンドを適用できます。 - 既定のパラメーターを選択する [不均一細分化] ジョブを使用して 3D 細分化を実行します。検証(FSC)ジョブとThreeDFSCジョブを使用して、最終的な3Dリファインメントのマップとマスクを使用して、再構成の解像度を推定します。
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Representative Results
ここで概説した装置(図1)とプロトコール(図2)を用いてグラフェン被覆クライオ電子顕微鏡グリッドの作製に成功すると、箔穴を覆うグラフェンの単層が得られ、その特徴的な回折パターンによって確認することができます。グラフェン表面へのタンパク質吸着を促進するために、UV/オゾン処理を使用して、酸素含有官能基を取り付けることで表面を親水性にすることができます。しかし、空気中の炭化水素汚染物質は、UV/オゾン処理後5分という早い時間でグラフェン表面に吸着し、この影響を打ち消す可能性があります38,39。重要なのは、UV/オゾン処理の期間と、処理からプランジまでの経過時間の両方がサンプルの品質に影響を与える可能性があることです。表面接触角に基づいてコーティングされたグリッドの親水性を評価する簡単な方法を使用して、これらの効果を実証します(図3、ステップ12を参照)。
単粒子クライオ電子顕微鏡におけるグラフェン担体の使用を実証するために、触媒的に不活性なRNA誘導DNAエンドヌクレアーゼS. pyogenes Cas9(H10A;C80Sです。C574Sです。H840A)40は、グラフェンでコーティングされたグリッドにsgRNAおよび標的DNAとの複合体を形成し、これらのグリッドからクライオ電子顕微鏡データセットを収集し、単粒子解析を行った7。グラフェンでコーティングされたグリッドは、K3直接電子検出器を搭載した300 keV顕微鏡を使用して、0.654 Å/pixの倍率で顕微鏡写真あたり一貫して~300個の粒子を含んでいました(図4A-E)。+18°のステージ傾斜で8時間のデータ収集セッションを行い、最終的にキュレーションされたスタックで2,963本の映画と324,439個の粒子が得られました。これらの粒子を使用して3D再構成を生成し、精緻化の結果、推定分解能2.7 Åの密度マップと、異方性アーチファクトを回避するための適切な角度サンプリングが得られました(図5)。原子モデル(PDB 6o0z)41をこのマップにドッキングし、ISOLDE42を用いて精緻化した。この適合原子モデルの残基 R63-L82 は、精緻化されたクライオ電子顕微鏡密度マップとともに表示され、分離された側鎖密度が強調表示されます(図 5B)。同じサンプルと濃度(250 ng/μL)をグラフェンを含まない同一のグリッドに適用した場合、粒子は観察されませんでした(図4F、G)。この観察結果は、低濃度サンプルからの粒子の可視化を可能にするグラフェン支持体の有効性を浮き彫りにしています。
図1:必要な機器。 本稿で詳述するプロトコルを用いたグラフェングリッドの製造に必要な実験装置およびツール。アイテムとその数量が表示され、それに応じてラベルが付けられます。ここに記載されていない必須試薬には、CVDグラフェン、メタクリル酸メチルEL-6(MMA)、過硫酸アンモニウム(APS)、アセトン、イソプロパノール、エタノール、分子グレードの水などがあります。ここに記載されていない必須機器には、スピンコーター、グローディスチャージャー、ホットプレート、真空デシケーター、温度計などがあります。必要なすべての項目は、 材料表に詳述されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:グラフェングリッド製造プロセスの概略図。 グラフェンは、スピンコーターを使用してメチルメタクリレートEL-6(MMA)の薄層でコーティングされます(ステップ2)。銅箔の反対側のグラフェンは、プラズマエッチングによって除去されます(ステップ3)。次に、過硫酸アンモニウム(APS)を使用して銅をエッチングします(ステップ4〜5)。MMA-グラフェン膜を格子表面に配置する(ステップ6〜7)。最後に、MMAは有機溶媒による一連の洗浄中に溶解される(ステップ8〜9)。上記の矢印に示されているステップは、プロトコルの項で説明されている番号付きのステップに対応しています。この方法は、Han et al.30 から採用されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:UV/オゾン処理の期間と処理後の経過時間の関数としてのグリッド表面の親水性の評価。 (A)測定された接触角は、処理時間の関数としてプロットされています。接触角の減少は、親水性の増加と一致します(未処理グリッド:78°、20分:37°)。接触角はImageJ43を用いて測定した。(B)測定された接触角は、処理後の時間の関数としてプロットされています(0分:45°、60分:74°)。処理後の時間経過で測定されたグリッドは、アスタリスクで示されているように、12分間UV/オゾン処理されました。各後処理測定は同じグリッド上で行い、測定と測定の間にウィッキングによってサンプルを除去しました。測定される特定の接触角は、実験室の環境条件の関数として変化することが予想されるため、適切な条件を特定するために、ユーザーが実験室で同様の実験を行うことをお勧めします。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:グラフェンでコーティングされたグリッドとコーティングされていないコントロールグリッドの代表的な画像。 (A-C) K3直接電子検出器を搭載した300keV顕微鏡で撮影したグラフェン被覆穴穴カーボングリッドの代表的なアトラス、グリッドスクエア、フォイルホール画像。(D)グラフェン被覆穴穴場カーボングリッド上のsgRNAおよび標的DNA(濃度250 ng/μLの複合体)との複合体における 化膿菌 dCas9のクライオ電子顕微鏡写真。(E)パネル(A-D)で撮像したグリッドからの回折像。オレンジ色の矢印は、空間周波数 2.13 Å に対応する位置を示します。パネル(D)と同じサンプルを、 (F) UV/オゾン処理と (G) グラフェンを含まないグロー放電穴場カーボングリッドに適用しました。表示されるクライオ電子顕微鏡写真は、各グリッドを代表するものであり、粒子は見られません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:グラフェンでコーティングされたグリッドからのCas9複合体のクライオ電子顕微鏡再構成。 (A)sgRNAおよび標的DNAとの複合体における 化膿菌 dCas9の3D再構成からのクライオ電子顕微鏡密度マップ。(B)フィッティングモデルの残基 R63-L82 は、半透明のクライオ電子顕微鏡密度内に示され、目に見える側鎖のサブセットが標識されています。(C) フーリエシェル相関 (FSC) 曲線は、マスクされていないマップ、緩やかにマスクされたマップ、および厳密にマスクされたマップです。(D)3DFSC法23に基づくヒストグラムと方向性FSCプロット。詳しくは、 補足図 2 およびステップ 13 を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:接触角イメージングスタンド。 (A)3Dプリントされたカメラスタンドと卓上イメージングマウントで、カメラをカバーガラスに面内で位置合わせする位置にカメラを固定します。(B)グリッドは、1cm×1cmの正方形のパラフィンフィルムの上にカバーガラスの上に置かれます。描かれたイメージングマウントは、付属の.stlファイル(Supplementary Coding File 1およびSupplementary Coding File 2)を使用して3Dプリントされており、ほとんどのデバイスに対応するように簡単に変更できます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:画像処理ワークフロー。 dCas9複合体の処理ワークフロー。ジョブ名、ジョブの詳細、およびデフォルト以外のパラメーター (イタリック体) が示されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1: カメラスタンド(camera_stand_v1.stl)の3Dプリントを容易にするために、STL形式のステレオリソグラフィーCADファイルが提供されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル2: 卓上イメージングマウント(slide_mount_v1.stl)の3Dプリントを容易にするために、STL形式のステレオリソグラフィーCADファイルが提供されており、 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
クライオ電子顕微鏡によるサンプル調製には多くの技術的課題が伴い、ほとんどのワークフローでは、脆弱なグリッドを損傷しないように細心の注意を払って手動で操作する必要があります。さらに、ガラス化に対するサンプルの適応性は予測不可能です。粒子は、空気と水の界面やグリッドを覆う固体支持箔と相互作用することが多く、非常に高いタンパク質濃度を適用しない限り、粒子が好ましい方向を向いたり、イメージングホールに入らなかったりする可能性があります24。穴の開いたクライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの連続単層で重ね合わせることは、顕微鏡写真上の粒子分布の改善、低濃度での粒子数の増加、および空気-水界面での相互作用によって引き起こされる好ましい配向の減少において非常に有望であることが示されている30。
クライオ電子顕微鏡グリッド用の既存のグラフェンコーティングプロトコルの限界は、コーティングプロセスに必要な広範な手動操作であり、品質を損ない、グリッド間のばらつきを増加させる可能性があります。この研究では、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェン30の単層でコーティングするための既存のプロトコルに若干の変更を加えることについて説明します。
このプロトコルの重要なステップには、CVDグラフェンをMMAでコーティングすること、CVDグラフェン銅基板をAPSに溶解すること、およびクライオ電子顕微鏡グリッドへのグラフェンの適用が含まれます。洗浄ステップごとにグリッドを個別に処理して新しい溶媒容器に移すのではなく、同じペトリ皿内で溶媒を交換することで、コーティングされたグリッドの手動操作を最小限に抑えるように元のプロトコルを変更し、無傷で高品質のグラフェンコーティンググリッドの収率を高めることを目指しました。グラフェンでコーティングされたグリッドの操作を最小限にとどめるよう努めましたが、個々のグラフェンの正方形をクライオ電子顕微鏡グリッドに手動で適用することは本質的に困難であり、グリッド間のばらつきが予想されることを認識しています。
グラフェンでコーティングされたグリッドは、通常、サンプル塗布のために表面を親水性にするためにUV/オゾン処理を必要とします。UV/オゾン処理の期間と、処理後およびプランジング前の経過時間は、グリッドの親水性、ひいてはサンプルの品質に影響を与える可能性があります。グリッド製造プロトコルに加えて、UV/オゾン処理後のグリッド親水性を評価するための技術について説明します。手順では、塗布されたサンプルの表面接触角が、コーティングされたグリッド20、44の親水性特性の指標として使用される。シンプルな携帯電話のカメラを利用して表面接触角を推定するカスタムグリッドイメージングマウントを安価に3Dプリントするための設計が提供されています。
最後に、このプロトコルを用いて得られた結果について、触媒的に不活性なRNA誘導DNAエンドヌクレアーゼである 化膿菌 Cas9とsgRNAおよび標的DNAとの複合体40の2.7 Åクライオ電子顕微鏡構造を決定した結果について説明します。グラフェン非存在下では、使用した錯体濃度(250 ng/μL)の粒子は箔孔に観察されませんでした。対照的に、グラフェンでコーティングされたグリッドは高密度で粒子を掘り下げ、2,961枚の顕微鏡写真から高解像度のマップを簡単に3D再構成することができました。まとめると、これらのデータは、単粒子分析のためにグラフェン単分子膜をクライオ電子顕微鏡グリッドに適用することの価値を浮き彫りにしています。
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Disclosures
著者らに開示すべき矛盾はない。
Acknowledgments
標本は、MIT.nanoのクライオ電子顕微鏡施設で、Arnold and Mabel Beckman Foundationのおかげで得られた顕微鏡で準備され、画像化されました。接触角イメージングデバイスは、MIT Metropolis Maker Spaceでプリントされました。Nieng Yan氏とYimo Han氏の研究室、そしてMIT.nanoのスタッフには、この手法の採用を通じてサポートしてくださったことに感謝します。特に、Guanhui Gao博士とSarah Sterling博士の洞察に満ちた議論とフィードバックに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01-GM144542、5T32-GM007287、およびNSF-CAREER助成金2046778の支援を受けました。デイビス研究室での研究は、アルフレッド・P・スローン財団、ジェームズ・H・フェリー基金、MIT J-Clinic、ホワイトヘッド・ファミリーの支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Dubochet, J.
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S.
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
