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Biochemistry

Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66023
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

A aplicação de camadas de suporte a grades de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) pode aumentar a densidade de partículas, limitar as interações com a interface ar-água, reduzir o movimento induzido pelo feixe e melhorar a distribuição das orientações das partículas. Este artigo descreve um protocolo robusto para o revestimento de grades de crioEM com uma monocamada de grafeno para melhorar a preparação de amostras criogênicas.

Abstract

Na microscopia eletrônica criogênica (crioEM), macromoléculas purificadas são aplicadas a uma grade contendo uma folha de carbono holey; As moléculas são então borrifadas para remover o excesso de líquido e rapidamente congeladas em uma camada de gelo vítreo de aproximadamente 20-100 nm de espessura, suspensas em furos de folha de aproximadamente 1 μm de largura. A amostra resultante é imageada usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica e, após o processamento da imagem usando software adequado, estruturas de resolução quase atômica podem ser determinadas. Apesar da adoção generalizada do cryoEM, a preparação de amostras continua sendo um gargalo severo nos fluxos de trabalho do cryoEM, com os usuários frequentemente encontrando desafios relacionados ao comportamento inadequado das amostras no gelo vítreo em suspensão. Recentemente, métodos têm sido desenvolvidos para modificar grades crioEM com uma única camada contínua de grafeno, que atua como uma superfície de suporte que frequentemente aumenta a densidade de partículas na área fotografada e pode reduzir as interações entre partículas e a interface ar-água. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para a aplicação de grafeno em grades crioEM e para avaliar rapidamente a hidrofilicidade relativa das grades resultantes. Adicionalmente, descrevemos um método baseado em ME para confirmar a presença de grafeno visualizando seu padrão de difração característico. Finalmente, demonstramos a utilidade desses suportes de grafeno reconstruindo rapidamente um mapa de densidade de resolução de 2,7 Å de um complexo Cas9 usando uma amostra pura em uma concentração relativamente baixa.

Introduction

A microscopia eletrônica criogênica de partícula única (crioEM) evoluiu para um método amplamente utilizado para visualizar macromoléculas biológicas1. Alimentado pelos avanços na detecção direta de elétrons 2,3,4, aquisição de dados5 e algoritmos de processamento de imagens 6,7,8,9,10, o cryoEM é agora capaz de produzir estruturas 3D de resolução quase atômica de um número crescente de macromoléculas11. Além disso, aproveitando a natureza de molécula única da abordagem, os usuários podem determinar múltiplas estruturas a partir de uma única amostra 12,13,14,15, destacando a promessa de usar os dados gerados para entender conjuntos estruturais heterogêneos 16,17. Apesar desse progresso, persistem gargalos na preparação da grade de crio-espécimes.

Para a caracterização estrutural por crioEM, as amostras biológicas devem ser bem dispersas em solução aquosa e, em seguida, congeladas por meio de um processo denominado vitrificação18,19. O objetivo é capturar partículas em uma camada uniformemente fina de gelo vitrificado, suspensa em buracos regularmente espaçados que normalmente são cortados em uma camada de carbono amorfo. Esta folha de carbono amorfa padronizada é suportada por uma grade TEM com uma malha de barras de suporte de cobre ou ouro. Em fluxos de trabalho padrão, as grades são tornadas hidrofílicas usando um tratamento de plasma de descarga luminosa antes da aplicação da amostra. O excesso de líquido é borrado com papel de filtro, permitindo que a solução proteica forme uma fina película líquida através dos orifícios que pode ser facilmente vitrificada durante o congelamento por imersão. Desafios comuns incluem a localização das partículas para a interface ar-água (AWI) e subsequente desnaturação20,21,22 ou a adoção de orientações preferenciais 23,24,25, a aderência das partículas à folha de carbono em vez de migrar para os orifícios e o agrupamento e agregação das partículas dentro dos orifícios26. A espessura não uniforme do gelo é outra preocupação; gelo espesso pode resultar em níveis mais altos de ruído de fundo nas micrografias devido ao aumento do espalhamento de elétrons, enquanto gelo extremamente fino pode excluir partículas maiores27.

Para enfrentar esses desafios, uma variedade de filmes de suporte finos tem sido usada para revestir superfícies de grade, permitindo que as partículas descansem sobre esses suportes e, idealmente, evitem interações com a interface ar-água. Os suportes de grafeno têm se mostrado muito promissores, em parte devido à sua alta resistência mecânica aliada à sua seção transversal de dispersão mínima, o que reduz o sinal de fundo adicionado pela camada de suporte28. Além de sua mínima contribuição para o ruído de fundo, o grafeno também exibe notável condutividade elétrica e térmica29. Grades revestidas com grafeno e óxido de grafeno mostraram maior densidade de partículas, distribuição de partículas mais uniforme30 e localização reduzida para o AWI22. Além disso, o grafeno fornece uma superfície de suporte que pode ser modificada para: 1) sintonizar as propriedades físico-químicas da superfície da grade através da funcionalização 31,32,33; ou 2) agentes ligantes de casal que facilitam a purificação por afinidade de proteínas de interesse 34,35,36.

Neste artigo, modificamos um procedimento existente para o revestimento de grades crioEM com uma única camada uniforme de grafeno30. As modificações visam minimizar o manuseio da grade ao longo do protocolo, com o objetivo de aumentar o rendimento e a reprodutibilidade. Adicionalmente, discutimos nossa abordagem para avaliar a eficácia de vários tratamentos UV/ozônio em tornar as grades hidrofílicas antes do mergulho. Esta etapa na preparação de amostras de crioEM usando grades revestidas com grafeno é crítica, e achamos que nosso método simples para quantificar a hidrofilicidade relativa das grades resultantes é útil. Usando este protocolo, demonstramos a utilidade de empregar grades revestidas com grafeno para a determinação de estruturas, gerando uma reconstrução 3D de alta resolução de S. pyogenes Cas9 cataliticamente inativo em complexo com RNA guia e DNA-alvo.

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Protocol

1. Preparação do grafeno CVD

  1. Prepare a solução de corrosão de grafeno conforme descrito abaixo.
    1. Dissolver 4,6 g de persulfato de amônio (APS) em 20 mL de água de grau molecular em um copo de 50 mL para uma solução de 1 M e cobrir com papel alumínio. Permitir que a SAF se dissolva completamente enquanto prossegue para a etapa 1.2.
  2. Preparar uma seção de grafeno CVD para revestimento de metacrilato de metila (MMA). Corte cuidadosamente uma seção quadrada de grafeno CVD. Transfira o quadrado para uma lamínula (50 mm x 24 mm) dentro de uma placa de Petri limpa e cubra durante o transporte para o revestidor de spin.
    NOTA: Um quadrado de 18 mm x 18 mm deve produzir 25-36 grades revestidas de grafeno.

2. Revestimento de grafeno CVD com MMA

  1. Ajuste as configurações do revestidor de giro para um giro de alta velocidade de 60 s a 2.500 rpm. Coloque cuidadosamente o grafeno CVD sobre o mandril de tamanho adequado.
    NOTA: Idealmente, o grafeno CVD estenderá 1-2 mm sobre a borda do mandril selecionado para evitar a aspiração de MMA no sistema de vácuo.
  2. Pressione o botão Take/Absorb para acoplar a bomba de vácuo e afixar o grafeno CVD no mandril. Aplique o MMA no centro do quadrado de grafeno CVD, feche a tampa e pressione o botão Start/Stop imediatamente. Para um quadrado de 18 mm x 18 mm de grafeno CVD, 40 μL de MMA são suficientes.
  3. Uma vez que a rotação tenha parado, desengate a bomba de vácuo e recupere cuidadosamente o grafeno CVD revestido de MMA com uma pinça. Inverta o grafeno CVD de tal forma que o lado revestido MMA esteja virado para baixo e coloque-o de volta na tampa de vidro.

3. Corrosão a plasma da parte traseira do grafeno

  1. Transfira o grafeno CVD na lamínula para o descarregador de brilho e descarga de brilho por 30 s a 25 mA usando pinças de ponta plana.
  2. Devolva o grafeno CVD na lamínula para a placa de Petri e cubra durante o transporte para a área de corrosão de cobre. O revestimento MMA protegerá a camada de grafeno da parte superior da corrosão a plasma.

4. Corte de quadrados de grafeno CVD revestidos de MMA

  1. Use dois pares de pinças para apoiar o quadrado de grafeno CVD. Anote a orientação do quadrado de grafeno CVD, mantenha o lado do MMA para cima enquanto estiver preso à pinça (CRÍTICO).
  2. Corte o grafeno CVD em quadrados de aproximadamente 3 mm x 3 mm. Use dois conjuntos de pinças de ação reversa para esta etapa para segurar o quadrado de grafeno CVD do lado direito para cima e fixá-lo na posição, e também para segurar a borda de um quadrado de 3 mm x 3 mm depois de cortá-lo para longe do resto do quadrado.

5. Dissolução do substrato de cobre do grafeno CVD revestido com MMA

  1. Flutue cuidadosamente cada quadrado de 3 mm x 3 mm na solução APS. Faça contato com a superfície da solução APS antes de liberar cada quadrado. Inclinar o copo de tal forma que cada quadrado possa ser colocado na solução em um ângulo raso; Isso garante que a praça não afunde.
  2. Cubra o copo com papel alumínio e incube durante a noite a 25 °C.

6. Remoção de filmes de MMA/grafeno da APS

  1. Use uma lamínula de vidro com dimensões 12 mm x 50 mm e extraia os quadrados MMA/grafeno da APS mergulhando suavemente a lamínula verticalmente na APS e, em seguida, movendo a lamínula lateralmente de tal forma que ela se encaixe em um quadrado MMA/grafeno flutuante.
  2. Remova cuidadosamente a lamínula e certifique-se de que o quadrado adere completamente ao lado da lamínula após a remoção.
  3. Transfira os quadrados de MMA/grafeno para um copo limpo de 50 mL preenchido com água de grau molecular por 20 min. Mergulhe suavemente a lamínula com um quadrado de MMA/grafeno preso à água verticalmente e certifique-se de que o quadrado se desloque da lamínula após a interação com a superfície da água. Repita para todos os quadrados MMA/grafeno.

7. Aderência do grafeno às grades

  1. Usando pinças de ação negativa, mergulhe suavemente uma grade verticalmente na água com o lado de carbono voltado para um quadrado de MMA/grafeno flutuante. Uma vez em contato com o quadrado, remova cuidadosamente a grade e certifique-se de que o quadrado adere completamente ao lado de carbono da grade após a remoção. Minimizar o movimento lateral da grade quando submersa na água para evitar danificar os quadrados da grade (CRÍTICO).
  2. Coloque grades em uma tampa limpa MMA/grafeno lado para cima e seque ao ar por 1 a 2 min. Transfira grades revestidas de grafeno/MMA para uma placa quente ajustada a 130 °C usando pinças de ponta plana.
  3. Cubra com a parte superior de uma placa de Petri de vidro e incube por 20 min. Retire do fogo e deixe esfriar até a temperatura ambiente por 1 a 2 min.
    CUIDADO: Tenha cuidado, pois a placa de Petri estará extremamente quente.

8. Dissolver MMA com acetona

  1. Transfira toda a tampa para uma placa de Petri preenchida com 15 mL de acetona. Incubar por 30 min.
  2. Usando uma pipeta sorológica de vidro limpa, transfira a acetona, na qual as grades foram incubadas, para um recipiente de resíduos. Adicione cuidadosamente 15 mL de acetona fresca à placa de Petri usando uma pipeta sorológica de vidro limpa. Incubar por 30 min.
  3. Repita estes passos de lavagem para um total de 3 lavagens de acetona.

9. Remoção da acetona residual com isopropanol

  1. Após 3 lavagens com acetona, remova a acetona e substitua por 15 mL de isopropanol usando uma pipeta sorológica de vidro limpa. Incubar por 20 min.
  2. Repita 3x para um total de 4 lavagens com isopropanol. Remova cuidadosamente as grades do isopropanol e seque ao ar em uma tampa limpa usando uma pinça.
    NOTA: O isopropanol residual pode dificultar a liberação de grades de pinças. Fazer contato entre a grade e a tampa limpa antes de liberar a grade da pinça pode aliviar esse problema.
  3. Evaporar os orgânicos residuais transferindo a lamínula com grades revestidas de grafeno para uma placa de aquecimento regulada para 100 °C por 10 min. Arrefecer até à temperatura ambiente e conservar sob vácuo até à utilização.

10. Tratamento UV/ozônio de grades revestidas com grafeno

  1. Usando pinças de ação reversa, coloque delicadamente grades em uma área de iluminação limpa de um limpador UV/ozônio com o lado revestido de grafeno voltado para cima.
  2. Deslize a área de iluminação fechada e ligue a máquina. Ligue o mostrador de tempo para o tempo de tratamento designado para iniciar o tratamento UV/ozônio nas grades.
    NOTA: A duração do tratamento é um parâmetro ajustável, com o excesso de tratamento tendo o potencial de danificar a grade. Han et al.30 recomendam 10 min de tratamento UV/ozônio, e também achamos que 10 min de tratamento são suficientes. Consulte a etapa 12 para obter orientação sobre como ajustar esse tempo de tratamento.
  3. Proceder diretamente ao mergulho de uma amostra de crioEM nas grades tratadas seguindo os passos de imersão descritos em Koh et al.37.
    NOTA: Hidrocarbonetos atmosféricos podem se acumular na superfície da grade após tratamento UV/ozônio e aumentar a hidrofobicidade da superfície do grafeno38,39. Para evitar isso, mergulhe as grades tratadas com UV/ozônio imediatamente. Pode ser vantajoso tratar redes UV/ozônio em lotes, por exemplo, UV/ozônio tratando seis grades e imediatamente mergulhando essas seis grades, depois UV/ozônio tratando um segundo lote de grades, seguido de mergulhar o segundo lote.

11. Capturando uma imagem de difração

  1. Certifique-se de que o microscópio esteja bem ajustado com iluminação paralela estabelecida e ajuste o desfoco final para -0,2 μm.
  2. Insira a tela fluorescente e o feixe pare totalmente. Entre no modo de difração para visualizar claramente os pontos de difração.
  3. Adquira uma imagem usando uma câmera CCD e avalie-a usando um software de análise de imagem.
    NOTA: Os pontos de difração mais facilmente observados e identificáveis gerados por uma monocamada de grafeno são 6 pontos correspondentes a uma frequência espacial de 2,13 Å. Use uma ferramenta de medição para estimar a distância do centro do feixe difratado a um desses pontos de difração em unidades recíprocas. Notadamente 2,13 Å Equation 1 0,47 Å-1.

12. Avaliação da hidrofilicidade da rede

  1. Prepare a configuração da geração de imagens. Localize um suporte de telefone, superfície de imagem de mesa, telefone com câmera, tampa de vidro e filme de parafina. As imagens aqui mostradas foram obtidas usando um suporte de telefone e superfície de imagem de mesa que foram impressas em 3D usando os arquivos .stl fornecidos, resultando em medidas de ângulo de contato mais facilmente reprodutíveis e quantificáveis (Figura 1A Suplementar).
  2. Coloque uma tampa de vidro sobre a superfície plana, depois corte um quadrado de 1 cm por 1 cm de película de parafina e coloque-a sobre a lamínula de vidro. Coloque o telefone no suporte do telefone, orientando o telefone de tal forma que a câmera esteja no plano com a tampa de vidro. Fixe o telefone nesta posição usando elásticos (Figura 1B Suplementar). Tire uma foto de amostra para verificar se a câmera está alinhada com a superfície da imagem.
  3. Imediatamente após o tratamento UV/ozônio de grades revestidas com grafeno, coloque uma única grade no quadrado de filme de parafina na lamínula de vidro. Verifique se o lado do grafeno está voltado para cima. Adicione uma gota de água de 2 μL no centro da superfície da grade com uma pipeta e tire imediatamente uma foto.
    NOTA: Repita esta etapa após: i) intervalos desejados de tratamento UV/ozônio para determinar uma duração suficiente do tratamento; ou ii) intervalos de tempo desejados pós-tratamento UV/ozônio para medir quanto tempo após o tratamento a superfície da grade mantém seu caráter hidrofílico.
  4. Calcule os ângulos de contato das fotos importando-os para o ImageJ43 e usando o plug-in de ângulo de contato.

13. Análise de partículas únicas do conjunto de dados do complexo dCas9

NOTA: Todo o processamento das imagens descritas neste protocolo foi realizado utilizando o cryoSPARC versão 4.2.1.

  1. Pré-processe filmes usando trabalhos de Correção de movimento de patch e Estimativa de CTF de patch. Execute a coleta de partículas usando o trabalho de seletor de Blobs, usando um blob esférico que varia em diâmetro de 115 Å a 135 Å.
  2. Extrair partículas usando o trabalho Extract from micrographs, usando coeficiente de correlação normalizado (NCC) e limiares de potência, resultando em aproximadamente 200-300 partículas por micrografia. Observe que os limiares apropriados e a contagem de partículas resultante podem variar, e os usuários devem inspecionar a qualidade da seleção em uma variedade de micrografias para identificar as condições adequadas.
  3. Realizar reconstruções iniciais multiclasse usando o trabalho de reconstrução Ab-initio, exigindo três classes. Duas das três classes provavelmente conterão partículas não-Cas9, incluindo contaminantes superficiais. Selecione a classe semelhante a dCas9 para processamento posterior.
    NOTA: Rodadas adicionais de reconstrução Ab-initio multiclasse ou refinamento heterogêneo podem ser aplicadas para refinar ainda mais a pilha de partículas.
  4. Execute o refinamento 3D usando o trabalho Refinamento não uniforme selecionando os parâmetros padrão. Estimar a resolução da reconstrução usando os trabalhos de Validação (FSC) e ThreeDFSC, empregando os mapas e a máscara do refinamento 3D final.

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Representative Results

A fabricação bem-sucedida de grades crioEM revestidas com grafeno usando o equipamento (Figura 1) e o protocolo (Figura 2) aqui descritos resultará em uma monocamada de grafeno cobrindo os orifícios da folha, o que pode ser confirmado pelo seu padrão de difração característico. Para promover a adsorção de proteínas na superfície do grafeno, o tratamento UV/ozônio pode ser usado para tornar a superfície hidrofílica através da instalação de grupos funcionais contendo oxigênio. No entanto, contaminantes de hidrocarbonetos no ar podem adsorver na superfície do grafeno já 5 min após o tratamento UV/ozônio e neutralizar esse efeito38,39. É importante ressaltar que tanto a duração do tratamento com UV/ozônio quanto o tempo decorrido entre o tratamento e o mergulho podem afetar a qualidade da amostra. Demonstramos esses efeitos usando um método simples para avaliar o caráter hidrofílico da grade revestida com base no ângulo de contato da superfície (Figura 3; ver passo 12).

Para demonstrar o uso de suportes de grafeno em crioME de partícula única, aplicamos uma endonuclease de DNA guiada por RNA cataliticamente inativa S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 em complexo com sgRNA e DNA-alvo para grades revestidas com grafeno, coletou um conjunto de dados crioEM dessas grades e realizou análise de partícula única7. Grades revestidas com grafeno continham consistentemente ~300 partículas por micrografia em aumento de 0,654 Å/pix usando um microscópio de 300 keV equipado com um detector direto de elétrons K3 (Figura 4A-E). Uma sessão de coleta de dados de 8 h com uma inclinação de estágio de +18° produziu 2.963 filmes e 324.439 partículas em uma pilha final selecionada. Usando essas partículas, geramos uma reconstrução 3D que, após refinamento, resultou em um mapa de densidade com resolução estimada de 2,7 Å e amostragem angular adequada para evitar artefatos anisotrópicos (Figura 5). Um modelo atômico (PDB 6o0z)41 foi acoplado a esse mapa e refinado com o ISOLDE42. Os resíduos R63-L82 deste modelo atômico ajustado são exibidos com o refinado mapa de densidade crioEM, destacando a densidade da cadeia lateral resolvida (Figura 5B). Ao comparar a mesma amostra e concentração (250 ng/μL) aplicada a grades idênticas que não possuíam grafeno, não foram observadas partículas (Figura 4F,G). Esta observação destaca a eficácia do suporte de grafeno em permitir a visualização de partículas de amostras de baixa concentração.

Figure 1
Figura 1: Equipamento necessário. Equipamentos e ferramentas de laboratório necessários para a fabricação de grades de grafeno utilizando o protocolo detalhado neste artigo. Os itens e sua quantidade são mostrados e rotulados de acordo. Os reagentes necessários que não são mostrados incluem: grafeno CVD, metilmetacrilato EL-6 (MMA), persulfato de amônio (APS), acetona, isopropanol, etanol, água de grau molecular. Os instrumentos necessários que não são mostrados incluem: revestidor de spin, descarregador de brilho, placa quente, dessecador de vácuo e termômetro. Todos os itens necessários estão detalhados na Tabela de Materiais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema do processo de fabricação da grade de grafeno. O grafeno é revestido com uma fina camada de metilmetacrilato EL-6 (MMA) usando um revestidor de spin (passo 2). O grafeno no lado oposto da folha de cobre é removido através de condicionamento por plasma (passo 3). O persulfato de amônio (APS) é então usado para gravar o cobre (passos 4-5). O filme MMA-grafeno é colocado sobre a superfície da grade (passo 6-7). Por fim, o MMA é dissolvido durante uma série de lavagens com solventes orgânicos (passos 8-9). As etapas indicadas acima das setas correspondem às etapas numeradas descritas na seção protocolos. Esse método foi adaptado de Han et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação da hidrofilicidade da superfície da rede em função da duração do tratamento UV/ozônio e do tempo decorrido após o tratamento. (A) Ângulos de contato medidos plotados em função da duração do tratamento. A diminuição dos ângulos de contato é consistente com o aumento da hidrofilicidade (malha não tratada: 78°; 20 min: 37°). Ângulos de contato medidos usando ImageJ43. (B) Ângulos de contato medidos plotados em função do tempo, pós-tratamento (0 min: 45°; 60 min: 74°). A grade medida no curso do tempo pós-tratamento foi UV/ozônio tratado por 12 min, conforme indicado pelo asterisco. Cada medida pós-tratamento foi realizada na mesma grade, com a amostra removida por meio de perva entre as medidas. Espera-se que os ângulos de contato específicos medidos variem em função das condições ambientais do laboratório, e recomendamos que os usuários realizem experimentos semelhantes em seus laboratórios para identificar condições adequadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagens representativas de grades revestidas com grafeno e grades de controle não revestidas. (A-C) Atlas representativo, quadrado de grade e imagens de furo de folha de grades de carbono holey revestidas de grafeno tiradas em um microscópio de 300 keV equipado com um detector de elétrons direto K3. (D) Micrografia crioEM de S. pyogenes dCas9 em complexo com sgRNA e DNA-alvo (complexo na concentração de 250 ng/μL) em grade de carbono holey revestida com grafeno. (E) Imagem de difração da grade fotografada em painéis (A-D). A seta laranja indica uma posição correspondente a uma frequência espacial de 2,13 Å. Uma amostra idêntica à do painel (D) foi aplicada ao tratamento com (F) UV/ozônio e (G) grades de carbono holey descarregadas por brilho sem grafeno. As micrografias CryoEM exibidas são representativas de cada grade e não mostram partículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Reconstrução crioEM de um complexo Cas9 a partir de grades revestidas com grafeno. (A) Mapa de densidade de crioEM a partir da reconstrução 3D do complexo dCas9 de S. pyogenes com sgRNA e DNA-alvo. (B) Os resíduos R63-L82 de um modelo ajustado são representados dentro da densidade crioEM semitransparente, com um subconjunto de cadeias laterais visíveis rotuladas. (C) Curvas de Correlação da Concha de Fourier (FSC) dos mapas desmascarados, frouxos e bem mascarados. (D) Histograma e gráfico direcional FSC baseado no método 3DFSC23. Consulte a Figura 2 e a etapa 13 suplementares para obter mais informações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Suporte de imagem com ângulo de contato. (A) Um suporte de câmera impresso em 3D e um suporte de imagem de mesa para fixar a câmera em uma posição que alinha a câmera no plano com a tampa. (B) A grade é colocada na lamínula sobre um pedaço quadrado de 1 cm x 1 cm de filme de parafina. A montagem de imagem descrita foi impressa em 3D usando os arquivos .stl fornecidos (Arquivo de Codificação Suplementar 1 e Arquivo de Codificação Suplementar 2) e pode ser prontamente modificada para acomodar a maioria dos dispositivos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Fluxo de trabalho de processamento de imagens. Fluxo de trabalho de processamento para o complexo dCas9. Nomes de trabalho, detalhes de trabalho e parâmetros não padrão (itálico) são indicados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: Arquivos CAD de estereolitografia no formato STL são fornecidos para facilitar a impressão 3D do suporte da câmera (camera_stand_v1.stl). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: Arquivos CAD de estereolitografia no formato STL são fornecidos para facilitar a impressão 3D do suporte de imagem de mesa (slide_mount_v1.stl) e Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A preparação de amostras CryoEM envolve uma série de desafios técnicos, com a maioria dos fluxos de trabalho exigindo que os pesquisadores manipulem manualmente grades frágeis com extremo cuidado para evitar danificá-las. Além disso, a possibilidade de qualquer amostra ser vitrificação é imprevisível; As partículas frequentemente interagem com a interface ar-água ou com a folha de suporte sólida que sobrepõe as grades, o que pode levar as partículas a adotarem orientações preferenciais ou a não entrarem nos orifícios de imagem, a menos que concentrações muito altas de proteínas sejam aplicadas24. A sobreposição de grades crioEM holey com uma monocamada contínua de grafeno tem mostrado uma tremenda promessa em melhorar a distribuição de partículas em micrografias, aumentar o número de partículas em baixas concentrações e reduzir as orientações preferidas impulsionadas por interações na interface ar-água30.

Uma limitação dos protocolos de revestimento de grafeno existentes para grades crioEM são as extensas manipulações manuais necessárias para o processo de revestimento, que podem comprometer a qualidade e aumentar a variabilidade grade-a-grade. Neste trabalho descrevemos pequenas modificações em um protocolo existente para revestimento de grades crioEM com uma monocamada de grafeno30.

Etapas críticas dentro deste protocolo incluem o revestimento do grafeno CVD com MMA, a dissolução do substrato de cobre de grafeno CVD em APS e a aplicação de grafeno em grades crioEM. Modificamos o protocolo original para minimizar as manipulações manuais das grades revestidas através da troca de solventes dentro da mesma placa de Petri, em vez de manusear e transferir individualmente as grades para um novo recipiente de solvente para cada etapa de lavagem, visando assim aumentar o rendimento de grades intactas e revestidas com grafeno de alta qualidade. Embora tenhamos nos esforçado para reduzir ao mínimo as manipulações de grades revestidas de grafeno, reconhecemos que a aplicação manual de quadrados de grafeno individuais a grades crioEM é inerentemente desafiadora, e que alguma variabilidade de grade para grade é esperada.

Grades revestidas com grafeno normalmente requerem tratamento UV/ozônio para tornar a superfície hidrofílica para aplicação de amostras. A duração do tratamento com UV/ozônio e o tempo decorrido após o tratamento e antes do mergulho podem afetar a hidrofilicidade da rede e, em última análise, a qualidade da amostra. Além do protocolo de fabricação da grade, descrevemos uma técnica para avaliar a hidrofilicidade da grade após tratamento UV/ozônio. No procedimento, o ângulo de contato superficial de uma amostra aplicada é utilizado como indicador do caráter hidrofílico da grade revestida20,44. Os projetos são fornecidos para imprimir em 3D de baixo custo uma montagem de imagem de grade personalizada que utiliza uma câmera de telefone celular simples para estimar o ângulo de contato da superfície.

Finalmente, descrevemos os resultados obtidos empregando este protocolo para determinar a estrutura crioEM de 2,7 Å da endonuclease de DNA guiada por RNA cataliticamente inativo, S. pyogenes Cas9 em complexo com sgRNA e DNA alvo40. Na ausência de grafeno, não foram observadas partículas em furos de folha nas concentrações complexas utilizadas (250 ng/μL). Em contraste, grades revestidas de grafeno perfuram partículas em alta densidade, permitindo a reconstrução fácil em 3D de um mapa de alta resolução a partir de 2.961 micrografias. Em conjunto, esses dados destacam o valor da aplicação de monocamadas de grafeno em grades crioEM para análise de partículas únicas.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos a revelar.

Acknowledgments

Os espécimes foram preparados e fotografados no CryoEM Facility em MIT.nano em microscópios adquiridos graças à Fundação Arnold e Mabel Beckman. Dispositivos de imagem de ângulo de contato foram impressos no MIT Metropolis Maker Space. Agradecemos aos laboratórios de Nieng Yan e Yimo Han, e à equipe do MIT.nano por seu apoio durante toda a adoção deste método. Em particular, estendemos nossos agradecimentos aos Drs. Guanhui Gao e Sarah Sterling por suas discussões perspicazes e feedback. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e 2046778 de bolsas NSF-CAREER. A pesquisa no laboratório Davis é apoiada pela Fundação Alfred P. Sloan, pelo James H. Ferry Fund, pelo MIT J-Clinic e pela Família Whitehead.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216

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References

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Bioquímica Edição 201
Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução
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Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, … More

Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).

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