Summary
Tillämpningen av stödskikt på kryogena elektronmikroskopinät (cryoEM) kan öka partikeltätheten, begränsa interaktioner med luft-vattengränssnittet, minska strålinducerad rörelse och förbättra fördelningen av partikelorienteringar. Denna artikel beskriver ett robust protokoll för att belägga kryoEM-rutnät med ett monolager av grafen för förbättrad kryoprovberedning.
Abstract
I kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) appliceras renade makromolekyler på ett rutnät med en hålig kolfolie; Molekylerna torkas sedan för att avlägsna överflödig vätska och fryses snabbt i ett cirka 20-100 nm tjockt lager av glasaktig is, upphängd i cirka 1 μm breda foliehål. Det resulterande provet avbildas med kryogen transmissionselektronmikroskopi, och efter bildbehandling med lämplig programvara kan strukturer med nära atomär upplösning bestämmas. Trots cryoEM:s utbredda användning är provberedning fortfarande en allvarlig flaskhals i cryoEM-arbetsflöden, med användare som ofta stöter på utmaningar relaterade till prover som beter sig dåligt i den suspenderade glasisen. Nyligen har metoder utvecklats för att modifiera kryoEM-rutnät med ett enda kontinuerligt lager av grafen, som fungerar som en stödyta som ofta ökar partikeldensiteten i det avbildade området och kan minska interaktioner mellan partiklar och gränsytan mellan luft och vatten. Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för applicering av grafen på kryoEM-nät och för att snabbt bedöma den relativa hydrofiliciteten hos de resulterande gallren. Dessutom beskriver vi en EM-baserad metod för att bekräfta närvaron av grafen genom att visualisera dess karakteristiska diffraktionsmönster. Slutligen demonstrerar vi användbarheten av dessa grafenbärare genom att snabbt rekonstruera en 2,7 Å upplösningstäthetskarta av ett Cas9-komplex med hjälp av ett rent prov vid en relativt låg koncentration.
Introduction
Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har utvecklats till en allmänt använd metod för att visualisera biologiska makromolekyler1. Med hjälp av framsteg inom direkt elektrondetektion 2,3,4, datainsamling5 och bildbehandlingsalgoritmer 6,7,8,9,10 kan cryoEM nu producera 3D-strukturer med nära atomär upplösning av ett snabbt växande antal makromolekyler11. Dessutom, genom att utnyttja metodens enmolekylkaraktär, kan användare bestämma flera strukturer från ett enda prov 12,13,14,15, vilket belyser löftet om att använda de data som genereras för att förstå heterogena strukturella ensembler16,17. Trots dessa framsteg kvarstår flaskhalsar i beredningen av kryoprover.
För strukturell karakterisering med kryoEM bör biologiska prover vara väl dispergerade i vattenlösning och sedan snabbfrysas genom en process som kallas vitrifikation 18,19. Målet är att fånga partiklar i ett jämnt tunt lager av förglasad is som är upphängd i regelbundet åtskilda hål som vanligtvis skärs i ett lager av amorft kol. Denna mönstrade amorfa kolfolie stöds av ett TEM-galler med ett nät av koppar- eller guldstödstänger. I standardarbetsflöden görs rutnät hydrofila med hjälp av en plasmabehandling med glödurladdning före applicering av provet. Överskottsvätska torkas med filterpapper, vilket gör att proteinlösningen kan bilda en tunn flytande film över hålen som lätt kan förglasas under djupfrysning. Vanliga utmaningar inkluderar partikellokalisering till luft-vattengränssnittet (AWI) och efterföljande denaturering20,21,22 eller antagande av föredragna orienteringar 23,24,25, partikelvidhäftning till kolfolien snarare än att migrera in i hålen, och kluster och aggregering av partiklarna i hålen26. Ojämn istjocklek är ett annat problem; Tjock is kan resultera i högre nivåer av bakgrundsbrus i mikrograferna på grund av ökad elektronspridning, medan extremt tunn is kan utesluta större partiklar27.
För att ta itu med dessa utmaningar har en mängd olika tunna stödfilmer använts för att belägga gallerytor, vilket gör att partiklar kan vila på dessa stöd och helst undvika interaktioner med luft-vattengränssnittet. Grafenstöd har visat sig mycket lovande, delvis på grund av deras höga mekaniska hållfasthet i kombination med deras minimala spridningstvärsnitt, vilket minskar bakgrundssignalen som tillförs av stödskiktet28. Förutom sitt minimala bidrag till bakgrundsbrus uppvisar grafen också en anmärkningsvärd elektrisk och termisk ledningsförmåga29. Grafen och grafenoxidbelagda rutnät har visat sig ge högre partikeldensitet, mer enhetlig partikelfördelning30 och minskad lokalisering till AWI22. Dessutom ger grafen en stödyta som kan modifieras ytterligare för att: 1) finjustera rutnätsytans fysiokemiska egenskaper genom funktionalisering 31,32,33; eller 2) kopplingsmedel som underlättar affinitetsrening av proteiner av intresse 34,35,36.
I den här artikeln har vi modifierat en befintlig procedur för att belägga cryoEM-rutnät med ett enda enhetligt lager av grafen30. Ändringarna syftar till att minimera näthanteringen genom hela protokollet, med målet att öka avkastningen och reproducerbarheten. Dessutom diskuterar vi vårt tillvägagångssätt för att utvärdera effektiviteten av olika UV/ozonbehandlingar för att göra rutnät hydrofila före nedsänkning. Detta steg i kryoEM-provberedning med grafenbelagda rutnät är kritiskt, och vi har funnit att vår enkla metod för att kvantifiera den relativa hydrofiliciteten hos de resulterande rutnäten är användbar. Med hjälp av detta protokoll demonstrerar vi nyttan av att använda grafenbelagda rutnät för strukturbestämning genom att generera en högupplöst 3D-rekonstruktion av katalytiskt inaktiva S. pyogenes Cas9 i komplex med guide-RNA och mål-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av CVD-grafen
- Bered grafenetsningslösning enligt beskrivningen nedan.
- Lös 4,6 g ammoniumpersulfat (APS) i 20 ml vatten av molekylär kvalitet i en 50 ml bägare för en 1 M lösning och täck med aluminiumfolie. Låt APS lösas upp helt medan du fortsätter till steg 1.2.
- Bered en sektion av CVD-grafen för metylmetakrylatbeläggning (MMA). Skär försiktigt ut en fyrkantig sektion av CVD-grafen. Överför kvadraten till ett täckglas (50 mm x 24 mm) i en ren petriskål och täck över under transporten till centrifugeringen.
OBS: En kvadrat på 18 mm x 18 mm bör ge 25-36 grafenbelagda rutnät.
2. Beläggning av CVD-grafen med MMA
- Ställ in centrifugeringsinställningarna på en 60 s höghastighetscentrifugering vid 2 500 varv per minut. Placera försiktigt CVD-grafenet på chucken av lämplig storlek.
OBS: Helst kommer CVD-grafenet att sträcka sig 1-2 mm över kanten på den valda chucken för att förhindra aspiration av MMA in i vakuumsystemet. - Tryck på Take/Absorb-knappen för att koppla in vakuumpumpen och fäst CVD-grafenet på chucken. Applicera MMA på mitten av CVD-grafenrutan, stäng locket och tryck omedelbart på Start/Stopp-knappen . För en kvadrat på 18 mm x 18 mm CVD-grafen räcker det med 40 μL MMA.
- När centrifugeringen har slutat, koppla ur vakuumpumpen och ta försiktigt upp det MMA-belagda CVD-grafenet med en pincett. Vänd CVD-grafenet så att den MMA-belagda sidan är vänd nedåt och lägg tillbaka det på glastäcket.
3. Plasmaetsning av grafenets baksida
- Överför CVD-grafen på täckglaset till glödurladdningen och glödurladdning i 30 s vid 25 mA med en platt pincett.
- Lägg tillbaka CVD-grafenet på täckglaset i petriskålen och täck över under transporten till kopparetsningsområdet. MMA-beläggning skyddar grafenskiktet på ovansidan från plasmaetsning.
4. Skärning av MMA-belagda CVD-grafenrutor i rutnätsstorlek
- Använd två par pincetter för att stödja CVD-grafenkvadraten. Notera orienteringen av CVD-grafenkvadraten, håll MMA-sidan uppåt medan den är fäst vid pincetten (CRITICAL).
- Skär CVD-grafen i ca 3 mm x 3 mm stora rutor. Använd två uppsättningar omvänd pincett för detta steg för att hålla CVD-grafenkvadraten rättvänd och förankra den på plats, och även för att hålla kanten på en 3 mm x 3 mm fyrkant efter att ha klippt bort den från resten av kvadraten.
5. Upplösning av kopparsubstrat från MMA-belagd CVD-grafen
- Flyt försiktigt varje 3 mm x 3 mm fyrkant i APS-lösningen. Ha kontakt med ytan på APS-lösningen innan du släpper varje ruta. Luta bägaren så att varje kvadrat kan placeras i lösningen i en grund vinkel; Detta säkerställer att kvadraten inte sjunker.
- Täck bägaren med aluminiumfolie och inkubera över natten vid 25 °C.
6. Ta bort MMA/grafenfilmer från APS
- Använd ett täckglas med måtten 12 mm x 50 mm och extrahera MMA/grafenrutorna från APS genom att försiktigt kasta täckglaset vertikalt in i APS och sedan flytta täckglaset i sidled så att det angränsar till en flytande MMA/grafenkvadrat.
- Ta försiktigt bort täckglaset och se till att vinkelhaken fäster helt på sidan av täckglaset när det tas bort.
- Överför MMA-/grafenrutorna till en ren 50 ml bägare fylld med vatten av molekylär kvalitet i 20 minuter. Doppa försiktigt täckglaset med en MMA/grafenfyrkant fäst i vattnet vertikalt och se till att kvadraten lossnar från täckglaset vid interaktion med vattenytan. Upprepa för alla MMA/grafenrutor.
7. Vidhäftning av grafen till rutnät
- Använd en pincett med negativ verkan och doppa försiktigt ett rutnät vertikalt i vattnet med kolsidan vänd mot en flytande MMA/grafenfyrkant. När den är i kontakt med fyrkanten, ta försiktigt bort gallret och se till att kvadraten fäster helt på kolsidan av gallret när den tas bort. Minimera gallrets rörelse i sidled när det är nedsänkt i vatten för att förhindra att rutnätsrutor skadas (CRITICAL).
- Lägg gallren på en ren täckglas, MMA/grafensidan uppåt och lufttorka i 1 till 2 min. Överför täckglaset grafen/MMA-belagda galler till en värmeplatta inställd på 130 °C med en platt pincett.
- Täck med toppen av en petriskål av glas och inkubera i 20 min. Ta bort från värmen och låt svalna till rumstemperatur i 1 till 2 minuter.
VARNING: Var försiktig eftersom petriskålen blir extremt varm.
8. Upplösning av MMA med aceton
- Lägg hela täckglaset i en petriskål fylld med 15 ml aceton. Inkubera i 30 min.
- Använd en ren serologisk glaspipett för att överföra aceton, i vilken gallren var inkuberade, till en avfallsbehållare. Tillsätt försiktigt 15 ml färsk aceton i petriskålen med hjälp av en ren serologisk glaspipett. Inkubera i 30 min.
- Upprepa dessa tvättsteg för totalt 3 acetontvättar.
9. Ta bort acetonrester med isopropanol
- Efter 3 acetontvättar, ta bort aceton och ersätt med 15 ml isopropanol med en ren serologisk glaspipett. Inkubera i 20 min.
- Upprepa 3 gånger för totalt 4 isopropanoltvättar. Ta försiktigt bort gallren från isopropanol och lufttorka på ett rent täckglas med en pincett.
OBS: Kvarvarande isopropanol kan göra det svårt att lossa galler från pincett. Att komma i kontakt mellan gallret och den rena täckglaset innan du släpper gallret från pincetten kan lindra detta problem. - Indunsta organiska ämnen genom att överföra täckglaset med grafenbelagda galler till en kokplatta inställd på 100 °C i 10 minuter. Kyl till rumstemperatur och förvara under vakuum tills den ska användas.
10. UV/ozonbehandling av grafenbelagda nät
- Använd en omvänd pincett och placera försiktigt galler i ett rent belysningsområde på en UV/ozonrengörare med den grafenbelagda sidan uppåt.
- Stäng belysningsområdet och slå PÅ maskinen. Vrid tidsratten till den angivna behandlingstiden för att börja UV/ozonbehandla gallren.
OBS: Behandlingstiden är en justerbar parameter, där överdriven behandling kan skada nätet. Han et al.30 rekommenderar 10 min UV/ozonbehandling, och vi har också funnit att en 10 min behandling räcker. Se steg 12 för vägledning om hur du ställer in denna behandlingstid. - Fortsätt direkt till att sänka ett cryoEM-prov på de behandlade gallren genom att följa dykstegen som beskrivs i Koh et al.37.
OBS: Atmosfäriska kolväten kan ackumuleras på gallrets yta efter UV/ozonbehandling och öka grafenytans hydrofobicitet 38,39. För att undvika detta, doppa de UV/ozonbehandlade gallren omedelbart. Det kan vara fördelaktigt att UV/ozonbehandla galler i omgångar, t.ex. UV/ozonbehandling av sex galler och omedelbart sänkning av dessa sex galler, sedan UV/ozonbehandling av en andra omgång galler, följt av sänkning av den andra satsen.
11. Ta en diffraktionsbild
- Se till att mikroskopet är väl inställt med parallell belysning etablerad och ställ in slutlig oskärpa till -0.2 μm.
- Sätt i den fluorescerande skärmen och strålen stannar helt. Gå in i diffraktionsläge för att tydligt visualisera diffraktionspunkter.
- Ta en bild med hjälp av en CCD-kamera och utvärdera den med hjälp av bildanalysprogram.
OBS: De lättast observerade och identifierbara diffraktionspunkterna som genereras av ett grafenmonolager är 6 fläckar som motsvarar en rumslig frekvens på 2,13 Å. Använd ett mätverktyg för att uppskatta avståndet från mitten av den diffrakterade strålen till en av dessa diffraktionspunkter i reciproka enheter. Noterbart 2,13 Å
0,47 Å-1.
0,47 Å-1.12. Bedömning av hydrofilicitet i nätet
- Förbered bildinställningen. Leta reda på ett telefonstativ, en bildyta på en bordsskiva, en telefon med kamera, ett täckglas och en paraffinfilm. Bilderna som visas här erhölls med hjälp av ett telefonstativ och en bildyta på en bordsskiva som 3D-printades med hjälp av de medföljande .stl-filerna, vilket resulterade i lättare reproducerbara och kvantifierbara kontaktvinkelmätningar (tilläggsfigur 1A).
- Lägg ett glastäcke på den plana ytan, skär sedan en 1 cm x 1 cm stor fyrkant av paraffinfilm och placera den på glastäcket. Placera telefonen på telefonstativet och orientera telefonen så att kameran är i plan med glastäcket. Fäst telefonen i detta läge med gummiband (kompletterande figur 1B). Ta ett provfoto för att kontrollera att kameran är i linje med bildytan.
- Direkt efter UV/ozonbehandling av grafenbelagda galler, placera ett enda galler på kvadraten av paraffinfilm på glastäcket. Se till att grafensidan är vänd uppåt. Tillsätt en 2 μL vattendroppe på mitten av gallerytan med en pipett och ta omedelbart ett foto.
OBS: Upprepa detta steg efter: i) önskade intervall av UV/ozonbehandling för att bestämma en tillräcklig behandlingslängd; eller ii) önskade tidsintervall efter UV/ozonbehandling för att mäta hur lång tid efter behandling gallerytan behåller sin hydrofila karaktär. - Beräkna kontaktvinklar från foton genom att importera dem till ImageJ43 och använda kontaktvinkelpluginet.
13. Analys av enskilda partiklar av det komplexa dCas9-datasetet
OBS: All bildbehandling som beskrivs i detta protokoll utfördes med cryoSPARC version 4.2.1.
- Förbearbeta filmer med hjälp av korrigerings- och CTF-uppskattningsjobb för korrigering. Utför partikelplockning med hjälp av blobväljarjobbet med hjälp av en sfärisk blob med en diameter från 115 Å till 135 Å.
- Extrahera partiklar med hjälp av jobbet Extrahera från mikrografer, med hjälp av normaliserad korrelationskoefficient (NCC) och effekttrösklar vilket resulterar i cirka 200-300 partiklar per mikrograf. Observera att lämpliga tröskelvärden och resulterande partikelantal kan variera, och användare bör inspektera plockkvaliteten över en rad mikrobilder för att identifiera lämpliga förhållanden.
- Utför inledande rekonstruktioner med flera klasser med hjälp av Ab-initio-rekonstruktionsjobbet, vilket kräver tre klasser. Två av de tre klasserna kommer sannolikt att innehålla icke-Cas9-partiklar, inklusive ytföroreningar. Välj den klass som liknar dCas9 för vidare bearbetning.
OBS: Ytterligare omgångar av multiklass Ab-initio-rekonstruktion eller heterogen förfining kan tillämpas för att ytterligare förfina partikelstacken. - Utför 3D-förfining med hjälp av jobbet Icke-enhetlig förfining genom att välja standardparametrar. Uppskatta upplösningen av rekonstruktionen med hjälp av validerings- (FSC) och ThreeDFSC-jobb, med hjälp av kartorna och masken från den slutliga 3D-förfiningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik tillverkning av grafenbelagda cryoEM-rutnät med hjälp av utrustningen (figur 1) och protokollet (figur 2) som beskrivs här kommer att resultera i ett monolager av grafen som täcker foliehålen som kan bekräftas av dess karakteristiska diffraktionsmönster. För att främja proteinadsorption till grafenytan kan UV/ozonbehandling användas för att göra ytan hydrofil genom att installera syreinnehållande funktionella grupper. Kolväteföroreningar i luften kan dock adsorbera på grafenytan så tidigt som 5 min efter UV/ozonbehandling och motverka denna effekt38,39. Det är viktigt att både UV/ozonbehandlingens varaktighet och den tid som förflutit mellan behandling och nedsänkning kan påverka provkvaliteten. Vi demonstrerar dessa effekter med hjälp av en enkel metod för att bedöma den hydrofila karaktären hos det belagda gallret baserat på ytans kontaktvinkel (figur 3; se steg 12).
För att demonstrera användningen av grafenstöd i kryoEM med en partikel applicerade vi ett katalytiskt inaktivt RNA-styrt DNA-endonukleas S. pyogenes Cas9 (H10A; C80-TALET; C574S; H840A)40 i komplex med sgRNA och mål-DNA till grafenbelagda rutnät, samlade in ett cryoEM-dataset från dessa rutnät och utförde singelpartikelanalys7. Grafenbelagda rutnät innehöll konsekvent ~300 partiklar per mikrograf vid 0,654 Å/pix förstoring med ett 300 keV-mikroskop utrustat med en K3-direktelektrondetektor (Figur 4A-E). En 8 timmar lång datainsamlingssession med en steglutning på +18° gav 2 963 filmer och 324 439 partiklar i en slutlig utvald stapel. Med hjälp av dessa partiklar genererade vi en 3D-rekonstruktion som, efter förfining, gav en densitetskarta med en uppskattad upplösning på 2,7 Å och adekvat vinkelprovtagning för att undvika anisotropa artefakter (Figur 5). En atommodell (PDB 6o0z)41 dockades in i denna karta och förfinades med hjälp av ISOLDE42. Rester R63-L82 av denna anpassade atommodell visas med den förfinade kryoEM-densitetskartan, som markerar den upplösta sidokedjedensiteten (figur 5B). Vid jämförelse av samma prov och koncentration (250 ng/μL) applicerad på identiska rutnät som saknade grafen, observerades inga partiklar (figur 4F,G). Denna observation belyser effektiviteten av grafenstödet för att möjliggöra visualisering av partiklar från prover med låg koncentration.
Bild 1: Nödvändig utrustning. Laboratorieutrustning och verktyg som är nödvändiga för tillverkning av grafennät med hjälp av protokollet som beskrivs i den här artikeln. Artiklar och deras antal visas och märks i enlighet med detta. Nödvändiga reagenser som inte visas inkluderar: CVD-grafen, metylmetakrylat EL-6 (MMA), ammoniumpersulfat (APS), aceton, isopropanol, etanol, vatten av molekylär kvalitet. Nödvändiga instrument som inte visas inkluderar: spinnbestrykare, glödutmatare, värmeplatta, vakuumexsickator och termometer. Alla nödvändiga artiklar beskrivs i materialförteckningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk bild av tillverkningsprocessen för grafenrutnät. Grafen beläggs med ett tunt skikt metylmetakrylat EL-6 (MMA) med hjälp av en spinnbestrykare (steg 2). Grafen på motsatt sida av kopparfolien avlägsnas via plasmaetsning (steg 3). Ammoniumpersulfat (APS) används sedan för att etsa bort kopparn (steg 4-5). MMA-grafenfilmen placeras på rutnätsytan (steg 6-7). Slutligen löses MMA upp under en serie tvättar med organiska lösningsmedel (steg 8-9). Stegen som anges ovan pilar motsvarar numrerade steg som beskrivs i protokollavsnittet. Denna metod har anpassats från Han et al.30. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av rutnätsytans hydrofilicitet som en funktion av UV/ozonbehandlingens varaktighet och den tid som förflutit efter behandlingen. A) Uppmätta kontaktvinklar plottade som en funktion av behandlingens varaktighet. Minskade kontaktvinklar överensstämmer med ökad hydrofilicitet (obehandlat galler: 78°; 20 min: 37°). Kontaktvinklar uppmätta med ImageJ43. (B) Uppmätta kontaktvinklar plottade som en funktion av tiden, efterbehandling (0 min: 45°; 60 min: 74°). Rutnätet som mättes i efterbehandlingsförloppet var UV/ozonbehandlat i 12 minuter, vilket indikeras av asterisk. Varje efterbehandlingsmätning utfördes på samma rutnät, där provet avlägsnades genom fuktinsugning mellan mätningarna. Specifika kontaktvinklar som mäts förväntas variera som en funktion av laboratoriets miljöförhållanden, och vi rekommenderar att användare utför liknande experiment i sina laboratorier för att identifiera lämpliga förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa bilder av grafenbelagda rutnät och obestrukna styrgaller. (A-C) Representativa bilder av atlas, rutnätsruta och foliehål av grafenbelagda håliga kolgaller tagna med ett 300 keV-mikroskop utrustat med en K3-direktelektrondetektor. (D) CryoEM-mikrobild av S. pyogenes dCas9 i komplex med sgRNA och mål-DNA (komplex vid 250 ng/μL koncentration) på grafenbelagd hålig kolruta. (E) Diffraktionsbild från rutnät avbildad i paneler (AD). Orange pil indikerar en position som motsvarar en rumslig frekvens på 2,13 Å. Ett identiskt prov som det i panel (D) applicerades på (F) UV/ozonbehandling och (G) glödutsläppta håliga kolgaller utan grafen. CryoEM-mikrobilder som visas är representativa för varje rutnät och visar inga partiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: CryoEM-rekonstruktion av ett Cas9-komplex från grafenbelagda rutnät. (A) CryoEM densitetskarta från 3D-rekonstruktion av S. pyogenes dCas9 i komplex med sgRNA och mål-DNA. (B) Rester R63-L82 från en monterad modell avbildas inom den halvtransparenta kryoEM-densiteten, med en delmängd av synliga sidokedjor märkta. (C) Fourier Shell Correlation (FSC) kurvor för de omaskerade, löst och tätt maskerade kartorna. D) Histogram och riktad FSC-plottning baserad på 3DFSC-metoden23. Se kompletterande figur 2 och steg 13 för mer information. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Bildstativ för kontaktvinkel. (A) Ett 3D-printat kamerastativ och bildfäste för bordsskiva för att säkra kameran i ett läge som riktar in kameran i plan med täckglaset. (B) Rutnätet placeras på täckglaset ovanpå en fyrkantig bit paraffinfilm på 1 cm x 1 cm. Det avbildade bildfästet 3D-printades med hjälp av de medföljande .stl-filerna (Supplementary Coding File 1 och Supplementary Coding File 2) och kan enkelt modifieras för att passa de flesta enheter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande bild 2: Arbetsflöde för bildbehandling. Bearbetningsarbetsflöde för dCas9-komplex. Jobbnamn, jobbinformation och icke-standardparametrar (kursiv) anges. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: CAD-filer för stereolitografi i STL-format tillhandahålls för att underlätta 3D-utskrift av kamerastativ (camera_stand_v1.stl). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: Stereolitografi CAD-filer i STL-format tillhandahålls för att underlätta 3D-utskrift av bordsbildfästet (slide_mount_v1.stl) och klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CryoEM-provberedning innebär en mängd tekniska utmaningar, där de flesta arbetsflöden kräver att forskare manuellt manipulerar ömtåliga galler med extrem försiktighet för att undvika att skada dem. Dessutom är det oförutsägbart att ett prov kan förglasas. Partiklar interagerar ofta med gränsytan mellan luft och vatten eller med den fasta stödfolie som täcker gallren, vilket kan leda till att partiklar antar föredragna riktningar eller inte kommer in i avbildningshålen om inte mycket höga proteinkoncentrationer appliceras24. Att överlagra håliga kryoEM-rutnät med ett kontinuerligt monolager av grafen har visat sig vara oerhört lovande när det gäller att förbättra partikelfördelningen på mikrografer, öka partikelantalet vid låga koncentrationer och minska föredragna orienteringar som drivs av interaktioner vid luft-vatten-gränssnittet30.
En begränsning av befintliga grafenbeläggningsprotokoll för kryoEM-rutnät är de omfattande manuella manipulationer som krävs för beläggningsprocessen, vilket kan äventyra kvaliteten och öka variationen mellan rutnäten. I detta arbete beskriver vi små modifieringar av ett befintligt protokoll för beläggning av cryoEM-rutnät med ett monolager av grafen30.
Kritiska steg inom detta protokoll inkluderar beläggning av CVD-grafen med MMA, upplösning av CVD-grafenkopparsubstratet i APS och applicering av grafen på kryoEM-rutnät. Vi modifierade det ursprungliga protokollet för att minimera manuella manipulationer av de belagda gallren genom att utbyta lösningsmedel inom samma petriskål, istället för att individuellt hantera och överföra galler till en ny lösningsmedelsbehållare för varje tvättsteg, och därigenom sträva efter att öka utbytet av intakta, högkvalitativa, grafenbelagda galler. Även om vi strävade efter att minska manipulationer av grafenbelagda rutnät till ett minimum, erkänner vi att den manuella tillämpningen av enskilda grafenrutor på kryoEM-rutnät i sig är utmanande, och att en viss variation mellan rutnät förväntas.
Grafenbelagda galler kräver vanligtvis UV/ozonbehandling för att göra ytan hydrofil för provapplicering. Varaktigheten av UV/ozonbehandling och den tid som förflutit efter behandlingen och före sänkning kan påverka nätets hydrofilicitet och i slutändan provkvaliteten. Utöver rutnätstillverkningsprotokollet beskriver vi en teknik för att bedöma rutnätets hydrofilicitet efter UV/ozonbehandling. I proceduren används ytkontaktvinkeln för ett applicerat prov som en indikator på den hydrofila karaktären hos det belagda gallret20,44. Mönster tillhandahålls för att billigt 3D-printa ett anpassat rutnätsbildfäste som använder en enkel mobiltelefonkamera för att uppskatta ytans kontaktvinkel.
Slutligen beskriver vi resultat som erhållits genom att använda detta protokoll för att bestämma 2,7 Å kryoEM-strukturen för det katalytiskt inaktiva RNA-styrda DNA-endonukleas, S. pyogenes Cas9 i komplex med sgRNA och mål-DNA40. I frånvaro av grafen observerades inga partiklar i foliehål vid de komplexa koncentrationer som användes (250 ng/μL). Grafenbelagda rutnät bar däremot partiklar med hög densitet, vilket möjliggjorde enkel 3D-rekonstruktion av en högupplöst karta från 2 961 mikrografer. Sammantaget belyser dessa data värdet av att applicera grafenmonolager på kryoEM-rutnät för analys av enstaka partiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Prover förbereddes och avbildades vid CryoEM-anläggningen i MIT.nano på mikroskop som förvärvats tack vare Arnold och Mabel Beckmans stiftelse. Kontaktvinkelavbildningsenheter skrevs ut på MIT Metropolis Maker Space. Vi tackar Nieng Yans och Yimo Hans laboratorier och personalen på MIT.nano för deras stöd under införandet av denna metod. Vi vill särskilt tacka doktorerna Guanhui Gao och Sarah Sterling för deras insiktsfulla diskussioner och feedback. Detta arbete stöddes av NIH-anslagen R01-GM144542, 5T32-GM007287 och NSF-CAREER-anslaget 2046778. Forskningen i Davis-laboratoriet stöds av Alfred P. Sloan Foundation, James H. Ferry Fund, MIT J-Clinic och Whitehead Family.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Dubochet, J.
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S.
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
