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Biochemistry

उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के लिए मोनोलेयर ग्राफीन का अनुप्रयोग

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66023
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) ग्रिड के लिए समर्थन परतों का अनुप्रयोग कण घनत्व को बढ़ा सकता है, वायु-जल इंटरफ़ेस के साथ बातचीत को सीमित कर सकता है, बीम-प्रेरित गति को कम कर सकता है और कण अभिविन्यास के वितरण में सुधार कर सकता है। यह पेपर बेहतर क्रायो-नमूना तैयार करने के लिए ग्राफीन के मोनोलेयर के साथ क्रायोईएम ग्रिड कोटिंग के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) में, शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूल्स को एक छिद्रित कार्बन पन्नी वाले ग्रिड पर लागू किया जाता है; अणुओं को तब अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए धब्बा लगाया जाता है और तेजी से कांच की बर्फ की लगभग 20-100 एनएम मोटी परत में जमे हुए होते हैं, जो लगभग 1 माइक्रोन चौड़े पन्नी छेद में निलंबित होते हैं। परिणामी नमूने को क्रायोजेनिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया जाता है, और उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण के बाद, निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को निर्धारित किया जा सकता है। क्रायोईएम के व्यापक रूप से अपनाने के बावजूद, क्रायोईएम वर्कफ़्लोज़ में नमूना तैयार करना एक गंभीर अड़चन बनी हुई है, उपयोगकर्ताओं को अक्सर निलंबित कांच की बर्फ में खराब व्यवहार करने वाले नमूनों से संबंधित चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। हाल ही में, क्रायोईएम ग्रिड को ग्राफीन की एक निरंतर परत के साथ संशोधित करने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, जो एक समर्थन सतह के रूप में कार्य करता है जो अक्सर छवि वाले क्षेत्र में कण घनत्व को बढ़ाता है और कणों और वायु-जल इंटरफ़ेस के बीच बातचीत को कम कर सकता है। यहां, हम क्रायोईएम ग्रिड में ग्राफीन के आवेदन के लिए और परिणामी ग्रिड की सापेक्ष हाइड्रोफिलिसिटी का तेजी से आकलन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम इसकी विशेषता विवर्तन पैटर्न की कल्पना करके ग्राफीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक ईएम-आधारित विधि का वर्णन करते हैं। अंत में, हम अपेक्षाकृत कम एकाग्रता पर शुद्ध नमूने का उपयोग करके कैस 9 कॉम्प्लेक्स के 2.7 ए रिज़ॉल्यूशन घनत्व मानचित्र को तेजी से पुनर्निर्माण करके इन ग्राफीन समर्थन की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।

Introduction

एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्सकी कल्पना के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि में विकसित हुआ है। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन का पता लगाने 2,3,4, डेटा अधिग्रहण5, और छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम 6,7,8,9,10 में प्रगति से प्रेरित, क्रायोईएम अब मैक्रोमोलेक्यूल्स 11 की तेजी से बढ़ती संख्या के निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन 3 डी संरचनाओं का उत्पादन करने में सक्षम है. इसके अलावा, दृष्टिकोण के एकल अणु प्रकृति का लाभ उठाकर, उपयोगकर्ताओं को विषम संरचनात्मक पहनावा16,17 को समझने के लिए उत्पन्न डेटा का उपयोग करने के वादे पर प्रकाश डाला गया, एक ही नमूना 12,13,14,15 से कई संरचनाओं का निर्धारण कर सकते हैं. इस प्रगति के बावजूद, क्रायो-नमूना ग्रिड तैयारी में अड़चनें बनी रहती हैं।

क्रायोईएम द्वारा संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए, जैविक नमूनों को जलीय घोल में अच्छी तरह से फैलाया जाना चाहिए और फिर विट्रीफिकेशन 18,19नामक प्रक्रिया के माध्यम से फ्लैश-जमे हुए होना चाहिए। लक्ष्य नियमित रूप से दूरी वाले छेदों में निलंबित विट्रिफाइड बर्फ की एक समान पतली परत में कणों को पकड़ना है जो आमतौर पर अनाकार कार्बन की एक परत में काटे जाते हैं। यह पैटर्न वाला अनाकार कार्बन पन्नी एक टीईएम ग्रिड द्वारा समर्थित है जो तांबे या सोने के समर्थन सलाखों का एक जाल है। मानक वर्कफ़्लोज़ में, ग्रिड को नमूना के आवेदन से पहले ग्लो-डिस्चार्ज प्लाज्मा उपचार का उपयोग करके हाइड्रोफिलिक प्रदान किया जाता है। अतिरिक्त तरल को फिल्टर पेपर के साथ मिटाया जाता है, जिससे प्रोटीन समाधान को छेद में एक पतली तरल फिल्म बनाने की अनुमति मिलती है जिसे डुबकी-ठंड के दौरान आसानी से विट्रिफाइड किया जा सकता है। आम चुनौतियों में वायु-जल इंटरफ़ेस (AWI) के लिए कण स्थानीयकरण और बाद में विकृतीकरण20,21,22 या पसंदीदा अभिविन्यास 23,24,25 को अपनाना, छेद में पलायन करने के बजाय कार्बन पन्नी का कण पालन, और छेद 26 के भीतर कणों का क्लस्टरिंग और एकत्रीकरण शामिल है. गैर-समान बर्फ की मोटाई एक और चिंता का विषय है; मोटी बर्फ वृद्धि हुई इलेक्ट्रॉन बिखरने के कारण micrographs में पृष्ठभूमि शोर के उच्च स्तर में परिणाम कर सकते हैं, जबकि अत्यंत पतली बर्फ बड़े कणों27 को बाहर कर सकते हैं.

इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, ग्रिड सतहों को कोट करने के लिए विभिन्न प्रकार की पतली समर्थन फिल्मों का उपयोग किया गया है, जिससे कणों को इन समर्थनों पर आराम करने की अनुमति मिलती है और आदर्श रूप से, वायु-जल इंटरफ़ेस के साथ बातचीत से बचें। ग्राफीन का समर्थन करता है उनके न्यूनतम बिखरने पार अनुभाग, जो समर्थन परत28 द्वारा जोड़ा पृष्ठभूमि संकेत कम कर देता है के साथ युग्मित उनकी उच्च यांत्रिक शक्ति के कारण भाग में महान वादा दिखाया है. पृष्ठभूमि शोर के लिए अपने न्यूनतम योगदान के अलावा, ग्राफीन भी उल्लेखनीय विद्युत और तापीय चालकता29 प्रदर्शित करता है. ग्राफीन और ग्राफीन ऑक्साइड लेपित ग्रिड उच्च कण घनत्व, अधिक समान कण वितरण30, और AWI22 को कम स्थानीयकरण उपज के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, ग्राफीन एक समर्थन सतह प्रदान करता है जिसे आगे संशोधित किया जा सकता है: 1) कार्यात्मककरण 31,32,33 के माध्यम से ग्रिड सतह के भौतिक रासायनिक गुणों को ट्यून करें; या 2) युगल लिंकिंग एजेंट जो ब्याज34,35,36 के प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि की सुविधा प्रदान करते हैं।

इस लेख में, हमने ग्राफीन30 की एक समान परत के साथ क्रायोईएम ग्रिड को कोटिंग करने के लिए एक मौजूदा प्रक्रिया को संशोधित किया है। संशोधनों का उद्देश्य पूरे प्रोटोकॉल में ग्रिड हैंडलिंग को कम करना है, उपज और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लक्ष्य के साथ। इसके अतिरिक्त, हम डूबने से पहले ग्रिड हाइड्रोफिलिक प्रदान करने में विभिन्न यूवी / ओजोन उपचारों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए अपने दृष्टिकोण पर चर्चा करते हैं। ग्राफीन-लेपित ग्रिड का उपयोग करके क्रायोईएम नमूना तैयार करने में यह कदम महत्वपूर्ण है, और हमने परिणामी ग्रिड की सापेक्ष हाइड्रोफिलिसिटी को उपयोगी बनाने के लिए हमारी सीधी विधि पाई है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम गाइड आरएनए और लक्ष्य डीएनए के साथ जटिल में उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय एस पायोजेनेस कैस 9 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करके संरचना निर्धारण के लिए ग्राफीन-लेपित ग्रिड को नियोजित करने की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।

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Protocol

1. सीवीडी ग्राफीन की तैयारी

  1. ग्राफीन नक़्क़ाशी समाधान के रूप में नीचे वर्णित तैयार करें.
    1. 1 एम समाधान के लिए 50 एमएल बीकर में आणविक ग्रेड पानी के 20 एमएल में 4.6 ग्राम अमोनियम पर्सल्फेट (एपीएस) को भंग करें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। चरण 1.2 पर आगे बढ़ते समय APS को पूरी तरह से भंग करने की अनुमति दें।
  2. मिथाइल मेथैक्रिलेट (एमएमए) कोटिंग के लिए सीवीडी ग्राफीन का एक खंड तैयार करें। सीवीडी ग्राफीन के एक वर्ग खंड को सावधानी से काटें। एक साफ पेट्री डिश के भीतर एक coverslip (50 मिमी x 24 मिमी) के लिए वर्ग स्थानांतरण और स्पिन कोटर के लिए परिवहन के दौरान कवर.
    नोट: एक 18 मिमी x 18 मिमी वर्ग को 25-36 ग्राफीन-लेपित ग्रिड प्राप्त करना चाहिए।

2. एमएमए के साथ कोटिंग सीवीडी ग्राफीन

  1. स्पिन कोटर सेटिंग्स को 2,500 आरपीएम पर 60 एस हाई स्पीड स्पिन पर सेट करें। सीवीडी ग्राफीन को उचित आकार के चक पर सावधानी से रखें।
    नोट: आदर्श रूप से, सीवीडी ग्राफीन वैक्यूम सिस्टम में एमएमए की आकांक्षा को रोकने के लिए चयनित चक के किनारे पर 1-2 मिमी का विस्तार करेगा।
  2. वैक्यूम पंप को संलग्न करने के लिए टेक/एब्जॉर्ब बटन दबाएं और चक पर सीवीडी ग्राफीन चिपकाएं। सीवीडी ग्राफीन वर्ग के केंद्र में एमएमए लागू करें, ढक्कन बंद करें, और तुरंत स्टार्ट/स्टॉप बटन दबाएं। सीवीडी ग्राफीन के 18 मिमी x 18 मिमी वर्ग के लिए, एमएमए का 40 माइक्रोन पर्याप्त है।
  3. एक बार कताई बंद हो जाने के बाद, वैक्यूम पंप को अलग करें और चिमटी के साथ एमएमए लेपित सीवीडी ग्राफीन को ध्यान से पुनः प्राप्त करें। सीवीडी ग्राफीन को उल्टा करें जैसे कि एमएमए लेपित पक्ष नीचे का सामना कर रहा है और इसे ग्लास कवरस्लिप पर वापस रखें।

3. ग्राफीन बैक-साइड की प्लाज्मा नक़्क़ाशी

  1. कवरस्लिप पर सीवीडी ग्राफीन को ग्लो डिस्चार्जर में स्थानांतरित करें और फ्लैट-टिप चिमटी का उपयोग करके 25 एमए पर 30 एस के लिए ग्लो डिस्चार्ज करें।
  2. पेट्री डिश के लिए coverslip पर सीवीडी ग्राफीन लौटें और तांबा नक़्क़ाशी क्षेत्र के लिए परिवहन के दौरान कवर. एमएमए कोटिंग प्लाज्मा नक़्क़ाशी से टॉपसाइड ग्राफीन परत की रक्षा करेगी।

4. ग्रिड के आकार के एमएमए लेपित सीवीडी ग्राफीन वर्गों को काटना

  1. सीवीडी ग्राफीन वर्ग का समर्थन करने के लिए चिमटी के दो जोड़े का प्रयोग करें। सीवीडी ग्राफीन वर्ग के उन्मुखीकरण पर ध्यान दें, चिमटी (क्रिटिकल) से जुड़े होने पर एमएमए पक्ष को ऊपर रखें।
  2. सीवीडी ग्राफीन को लगभग 3 मिमी x 3 मिमी वर्गों में काटें। सीवीडी ग्राफीन वर्ग दाईं ओर ऊपर पकड़ और स्थिति में लंगर के लिए इस कदम के लिए रिवर्स-एक्शन संदंश के दो सेट का उपयोग करें, और यह भी वर्ग के बाकी हिस्सों से दूर काटने के बाद एक 3 मिमी x 3 मिमी वर्ग के किनारे पकड़ करने के लिए.

5. एमएमए लेपित सीवीडी ग्राफीन से तांबा सब्सट्रेट को भंग करना

  1. एपीएस समाधान में प्रत्येक 3 मिमी x 3 मिमी वर्ग को ध्यान से फ्लोट करें। प्रत्येक वर्ग को छोड़ने से पहले एपीएस समाधान की सतह से संपर्क करें। बीकर को इस तरह झुकाएं कि प्रत्येक वर्ग को उथले कोण पर समाधान में रखा जा सके; यह सुनिश्चित करता है कि वर्ग डूबता नहीं है।
  2. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर बीकर और 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.

6. एपीएस से एमएमए/ग्राफीन फिल्मों को हटाना

  1. आयाम 12 मिमी x 50 मिमी के साथ एक ग्लास coverslip का प्रयोग करें और धीरे APS में लंबवत coverslip डुबकी और फिर coverslip पार्श्व इस तरह है कि यह एक अस्थायी एमएमए / ग्राफीन वर्ग abuts चलती द्वारा APS से एमएमए/ग्राफीन वर्गों निकालें.
  2. ध्यान से coverslip हटा दें और वर्ग हटाने पर coverslip के पक्ष का पूरी तरह से पालन करता है कि सुनिश्चित करें.
  3. 20 मिनट के लिए आणविक ग्रेड पानी से भरा एक साफ 50 एमएल बीकर के लिए एमएमए / ग्राफीन वर्गों हस्तांतरण. धीरे एक एमएमए/ग्राफीन वर्ग खड़ी पानी में संलग्न के साथ coverslip डुबकी और वर्ग पानी की सतह के साथ बातचीत पर coverslip से dislegs कि सुनिश्चित करें. सभी एमएमए/ग्राफीन वर्गों के लिए दोहराएं।

7. ग्रिड के लिए ग्राफीन का पालन करना

  1. नकारात्मक कार्रवाई चिमटी का उपयोग करना, धीरे से एक अस्थायी एमएमए / ग्राफीन वर्ग का सामना करना पड़ कार्बन पक्ष के साथ पानी में लंबवत एक ग्रिड डुबकी. एक बार वर्ग के संपर्क में, ग्रिड को ध्यान से हटा दें और सुनिश्चित करें कि वर्ग हटाने पर ग्रिड के कार्बन पक्ष का पूरी तरह से पालन करता है। हानिकारक ग्रिड वर्गों (CRITICAL को रोकने के लिए पानी में डूबे होने पर ग्रिड के पार्श्व आंदोलन को कम करें)।
  2. एक साफ coverslip एमएमए/ग्राफीन पक्ष ऊपर और 1 से 2 मिनट के लिए सूखी हवा पर ग्रिड रखें. फ्लैट टिप चिमटी का उपयोग कर 130 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक गर्म थाली के लिए coverslip ग्राफीन / एमएमए लेपित ग्रिड स्थानांतरण.
  3. एक गिलास पेट्री डिश के शीर्ष के साथ कवर और 20 मिनट के लिए सेते हैं. गर्मी से निकालें और 1 से 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
    चेतावनी: सावधानी बरतें क्योंकि पेट्री डिश टॉप बेहद गर्म होगा।

8. एसीटोन के साथ एमएमए को भंग करना

  1. एसीटोन के 15 एमएल से भरा पेट्री डिश में पूरे कवरस्लिप को स्थानांतरित करें। 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. एक साफ ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, एसीटोन को स्थानांतरित करें, जिसमें ग्रिड को एक अपशिष्ट कंटेनर में इनक्यूबेट किया गया था। ध्यान से एक साफ ग्लास सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग कर पेट्री डिश के लिए ताजा एसीटोन के 15 एमएल जोड़ें. 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. कुल 3 एसीटोन वॉश के लिए इन वॉश चरणों को दोहराएं।

9. आइसोप्रोपानॉल के साथ अवशिष्ट एसीटोन को हटाना

  1. 3 एसीटोन धोने के बाद, एसीटोन को हटा दें और एक साफ ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके आइसोप्रोपेनॉल के 15 एमएल के साथ बदलें। 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. कुल 4 आइसोप्रोपेनॉल वॉश के लिए 3x दोहराएं। ध्यान से isopropanol से ग्रिड को हटाने और चिमटी का उपयोग कर एक साफ coverslip पर सूखी हवा.
    नोट: अवशिष्ट आइसोप्रोपेनॉल चिमटी से ग्रिड जारी करना मुश्किल बना सकता है। चिमटी से ग्रिड जारी करने से पहले ग्रिड और साफ coverslip के बीच संपर्क बनाने इस समस्या को कम कर सकते हैं.
  3. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर सेट हॉटप्लेट पर ग्राफीन-लेपित ग्रिड के साथ कवरस्लिप को स्थानांतरित करके अवशिष्ट ऑर्गेनिक्स को वाष्पित करें। कमरे के तापमान पर ठंडा करें और उपयोग होने तक वैक्यूम के तहत स्टोर करें।

10. ग्राफीन-लेपित ग्रिड का यूवी/ओजोन उपचार

  1. रिवर्स-एक्शन चिमटी का उपयोग करके, धीरे से ग्रिड को यूवी/ओजोन क्लीनर के स्वच्छ रोशनी क्षेत्र में रखें, जिसमें ग्राफीन-लेपित पक्ष ऊपर की ओर हो।
  2. रोशनी क्षेत्र को बंद स्लाइड करें और मशीन को चालू करें। ग्रिड का इलाज शुरू करने के लिए यूवी/ओजोन शुरू करने के लिए समय डायल को निर्दिष्ट उपचार समय में बदल दें ..
    नोट: उपचार की अवधि एक ट्यून करने योग्य पैरामीटर है, जिसमें अतिरिक्त उपचार में ग्रिड को नुकसान पहुंचाने की क्षमता होती है। हान एट अल .30 यूवी / ओजोन उपचार के 10 मिनट की सिफारिश करता है, और हमने पर्याप्त करने के लिए 10 मिनट का उपचार भी पाया है। इस उपचार समय को ट्यून करने के मार्गदर्शन के लिए चरण 12 देखें।
  3. कोह एट अल.37 में वर्णित प्लंजिंग चरणों का पालन करके उपचारित ग्रिड पर क्रायोईएम नमूने को डुबोने के लिए सीधे आगे बढ़ें।
    नोट: वायुमंडलीय हाइड्रोकार्बन यूवी/ओजोन उपचार के बाद ग्रिड सतह पर जमा हो सकते हैं और ग्राफीन सतह 38,39की हाइड्रोफोबिसिटी बढ़ा सकते हैं। इससे बचने के लिए, यूवी/ओजोन उपचारित ग्रिड को तुरंत डुबो दें। यह बैचों में यूवी/ओजोन उपचार ग्रिड के लिए फायदेमंद हो सकता है, उदाहरण के लिए, यूवी/ओजोन छह ग्रिडों का इलाज करता है और तुरंत उन छह ग्रिडों को डुबोता है, फिर यूवी/ओजोन ग्रिड के दूसरे बैच का इलाज करता है, इसके बाद दूसरे बैच को डुबोता है।

11. एक विवर्तन छवि कैप्चर करना

  1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप अच्छी तरह से स्थापित समानांतर रोशनी के साथ देखते हैं और -0.2 माइक्रोन के लिए अंतिम डिफोकस सेट करते हैं।
  2. फ्लोरोसेंट स्क्रीन डालें और बीम पूरी तरह से बंद हो जाए। स्पष्ट रूप से विवर्तन धब्बे कल्पना करने के लिए विवर्तन मोड दर्ज करें.
  3. एक सीसीडी कैमरा का उपयोग कर एक छवि प्राप्त करें और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर यह मूल्यांकन.
    नोट: एक ग्राफीन मोनोलेयर द्वारा उत्पन्न सबसे आसानी से देखे गए और पहचाने जाने योग्य विवर्तन स्पॉट 2.13 ए की स्थानिक आवृत्ति के अनुरूप 6 स्पॉट हैं। पारस्परिक इकाइयों में इन विवर्तन स्पॉट में से एक के लिए विवर्तित बीम के केंद्र से दूरी का अनुमान लगाने के लिए एक माप उपकरण का उपयोग करें। विशेष रूप से 2.13 å 0.47 Equation 1å-1।

12. ग्रिड हाइड्रोफिलिसिटी का आकलन

  1. इमेजिंग सेटअप तैयार करें। एक फोन स्टैंड, टेबलटॉप इमेजिंग सतह, कैमरा के साथ फोन, ग्लास कवरस्लिप और पैराफिन फिल्म का पता लगाएँ। यहां दिखाए गए चित्र एक फोन स्टैंड और टेबलटॉप इमेजिंग सतह का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे जो प्रदान की गई .stl फ़ाइलों का उपयोग करके 3 डी मुद्रित किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप अधिक आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक संपर्क कोण माप (पूरक चित्रा 1 ए) थे।
  2. सपाट सतह पर एक ग्लास coverslip रखना, तो पैराफिन फिल्म के 1 सेमी वर्ग द्वारा एक 1 सेमी काट लें और कांच coverslip पर जगह है. फोन स्टैंड पर फोन रखें, फोन को उन्मुख करना जैसे कि कैमरा ग्लास कवरस्लिप के साथ विमान में है। रबर बैंड (अनुपूरक चित्रा 1 बी) का उपयोग कर इस स्थिति में सुरक्षित फोन. यह सत्यापित करने के लिए एक नमूना फ़ोटो लें कि कैमरा इमेजिंग सतह के साथ संरेखित है।
  3. सीधे ग्राफीन लेपित ग्रिड के यूवी/ओजोन उपचार के बाद, ग्लास coverslip पर पैराफिन फिल्म के वर्ग पर एक एकल ग्रिड जगह. सुनिश्चित करें कि ग्राफीन पक्ष ऊपर की ओर है। एक विंदुक के साथ ग्रिड सतह के केंद्र पर एक 2 माइक्रोन पानी की बूंद जोड़ें और तुरंत एक तस्वीर ले लो।
    नोट: इस चरण को बाद में दोहराएं: i) उपचार की पर्याप्त लंबाई निर्धारित करने के लिए यूवी/ओजोन उपचार के वांछित अंतराल; या ii) वांछित समय अंतराल के बाद यूवी/ओजोन उपचार यह मापने के लिए कि उपचार के कितने समय बाद ग्रिड सतह अपने हाइड्रोफिलिक चरित्र को बनाए रखती है।
  4. फ़ोटो से संपर्क कोणों की गणना उन्हें ImageJ43 में आयात करके और संपर्क कोण प्लगइन का उपयोग करके करें।

13. dCas9 जटिल डेटासेट का एकल कण विश्लेषण

नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी छवि प्रसंस्करण क्रायोस्पार्क संस्करण 4.2.1 का उपयोग करके किया गया था।

  1. पैच मोशन सुधार और पैच सीटीएफ अनुमान कार्यों का उपयोग करके फिल्मों को प्रीप्रोसेस करें। 115 Å से 135 Å तक व्यास में एक गोलाकार बूँद का उपयोग करके, ब्लॉब पिकर जॉब का उपयोग करके कण पिकिंग करें।
  2. माइक्रोग्राफ नौकरी से निकालें का उपयोग कर कणों निकालें, सामान्यीकृत सहसंबंध गुणांक (एनसीसी) और माइक्रोग्राफ प्रति लगभग 200-300 कणों में जिसके परिणामस्वरूप बिजली थ्रेसहोल्ड का उपयोग कर. ध्यान दें कि उपयुक्त थ्रेसहोल्ड और परिणामी कण गणना भिन्न हो सकती है, और उपयोगकर्ताओं को उपयुक्त स्थितियों की पहचान करने के लिए माइक्रोग्राफ की एक श्रृंखला में गुणवत्ता का निरीक्षण करना चाहिए।
  3. एब-इनिटियो पुनर्निर्माण कार्य का उपयोग करके बहुस्तरीय प्रारंभिक पुनर्निर्माण करें, जिसमें तीन वर्गों की आवश्यकता होती है। तीन वर्गों में से दो में संभवतः सतह संदूषक सहित गैर-कैस 9 कण होंगे। आगे की प्रक्रिया के लिए dCas9 जैसा दिखने वाला वर्ग चुनें।
    नोट: कण स्टैक को और परिष्कृत करने के लिए मल्टीक्लास एब-इनिटियो पुनर्निर्माण या विषम शोधन के अतिरिक्त दौर लागू किए जा सकते हैं।
  4. डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का चयन करते हुए गैर-समान शोधन कार्य का उपयोग करके 3D परिशोधन निष्पादित करें. सत्यापन (FSC), और ThreeDFSC नौकरियों का उपयोग करके पुनर्निर्माण के संकल्प का अनुमान लगाएं, अंतिम 3D शोधन से नक्शे और मुखौटा को नियोजित करना।

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Representative Results

यहां उल्लिखित उपकरण (चित्रा 1) और प्रोटोकॉल (चित्रा 2) का उपयोग करके ग्राफीन-लेपित क्रायोईएम ग्रिड के सफल निर्माण के परिणामस्वरूप फॉइल छेद को कवर करने वाले ग्राफीन का एक मोनोलेयर होगा जिसकी पुष्टि इसकी विशेषता विवर्तन पैटर्न द्वारा की जा सकती है। ग्राफीन सतह पर प्रोटीन सोखना को बढ़ावा देने के लिए, यूवी / ओजोन उपचार का उपयोग ऑक्सीजन युक्त कार्यात्मक समूहों को स्थापित करके सतह हाइड्रोफिलिक को प्रस्तुत करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, हवा में हाइड्रोकार्बन संदूषक ग्राफीन सतह पर 5 मिनट के बाद यूवी/ओजोन उपचार के रूप में सोखना कर सकते हैं और इस प्रभाव 38,39का प्रतिकार कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यूवी/ओजोन उपचार की अवधि और उपचार और डूबने के बीच का समय दोनों नमूने की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। हम सतह संपर्क कोण (चित्रा 3; चरण 12 देखें) के आधार पर लेपित ग्रिड के हाइड्रोफिलिक चरित्र का आकलन करने के लिए एक सरल विधि का उपयोग करके इन प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं।

एकल कण क्रायोईएम में ग्राफीन समर्थन के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, हमने उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ एस पायोजेनेस कैस 9 (एच 10 ए; सी 80 एस; सी574एस; H840A)40 sgRNA के साथ जटिल में और ग्राफीन-लेपित ग्रिड के लिए डीएनए को लक्षित करता है, इन ग्रिडों से एक क्रायोईएम डेटासेट एकत्र करता है, और एकल कण विश्लेषण7 करता है। ग्राफीन-लेपित ग्रिड में लगातार K3 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर(चित्रा 4A-E)से लैस 300 keV माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 0.654 Å/pix आवर्धन पर ~ 300 कण प्रति माइक्रोग्राफ होते हैं। +18 ° चरण झुकाव के साथ एक 8 घंटे डेटा संग्रह सत्र में अंतिम क्यूरेटेड स्टैक में 2,963 फिल्में और 324,439 कण मिले। इन कणों का उपयोग करते हुए, हमने एक 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न किया, जो शोधन पर, 2.7 ए के अनुमानित संकल्प के साथ घनत्व मानचित्र और अनिसोट्रोपिक कलाकृतियों (चित्रा 5) से बचने के लिए पर्याप्त कोणीय नमूनाकरण प्राप्त किया। एक परमाणु मॉडल (PDB 6o0z)41 को इस मानचित्र में डॉक किया गया था, और ISOLDE42 का उपयोग करके परिष्कृत किया गया था। इस सज्जित परमाणु मॉडल के अवशेष R63-L82 परिष्कृत क्रायोईएम घनत्व मानचित्र के साथ प्रदर्शित किए जाते हैं, जो हल किए गए साइड-चेन घनत्व(चित्रा 5बी)को उजागर करते हैं। जब एक ही नमूना और एकाग्रता (250 एनजी/μL) की तुलना समान ग्रिड है कि ग्राफीन की कमी के लिए लागू की, कोई कण (चित्रा 4 एफ, जी) मनाया गया. यह अवलोकन कम सांद्रता वाले नमूनों से कणों के दृश्य को सक्षम करने में ग्राफीन समर्थन की प्रभावकारिता पर प्रकाश डालता है।

Figure 1
चित्र 1: आवश्यक उपकरण। इस आलेख में विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग करके ग्राफीन ग्रिड के निर्माण के लिए आवश्यक लैब उपकरण और उपकरण। वस्तुओं और उनकी मात्रा को तदनुसार दिखाया और लेबल किया जाता है। आवश्यक अभिकर्मक जो नहीं दिखाए गए हैं उनमें शामिल हैं: सीवीडी ग्राफीन, मिथाइल-मेथैक्रिलेट ईएल -6 (एमएमए), अमोनियम पर्सल्फेट (एपीएस), एसीटोन, आइसोप्रोपेनॉल, इथेनॉल, आणविक ग्रेड पानी। आवश्यक उपकरण जो नहीं दिखाए गए हैं उनमें शामिल हैं: स्पिन कोटर, ग्लो डिस्चार्जर, हॉट प्लेट, वैक्यूम डेसिकेटर और थर्मामीटर। सभी अपेक्षित मदों का विवरण सामग्री की तालिका में दिया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्राफीन ग्रिड निर्माण प्रक्रिया का योजनाबद्ध। ग्राफीन एक स्पिन कोटर (चरण 2) का उपयोग करके मिथाइल-मेथैक्रिलेट ईएल -6 (एमएमए) की एक पतली परत के साथ लेपित है। तांबे की पन्नी के विपरीत दिशा में ग्राफीन प्लाज्मा नक़्क़ाशी (चरण 3) के माध्यम से हटा दिया जाता है. अमोनियम पर्सल्फेट (एपीएस) का उपयोग तब तांबे को खोदने के लिए किया जाता है (चरण 4-5)। एमएमए-ग्राफीन फिल्म को ग्रिड सतह (चरण 6-7) पर रखा गया है। अंत में, एमएमए कार्बनिक सॉल्वैंट्स (कदम 8-9) के साथ washes की एक श्रृंखला के दौरान भंग कर दिया है. ऊपर बताए गए चरण तीर प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित क्रमांकित चरणों के अनुरूप हैं। इस विधि हान एट अल से अनुकूलित किया गया है.30. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: यूवी/ओजोन उपचार की अवधि और उपचार के बाद बीता हुआ समय के एक समारोह के रूप में ग्रिड सतह हाइड्रोफिलिसिटी का आकलन। (ए) मापा संपर्क कोण उपचार की अवधि के एक समारोह के रूप में साजिश रची। घटे हुए संपर्क कोण बढ़ी हुई हाइड्रोफिलिसिटी (अनुपचारित ग्रिड: 78 डिग्री; 20 मिनट: 37 डिग्री) के अनुरूप हैं। ImageJ43 का उपयोग करके मापा गया संपर्क कोण। (बी) मापा संपर्क कोण समय के एक समारोह के रूप में साजिश रची, पोस्ट उपचार (0 मिनट: 45 डिग्री; 60 मिनट: 74 डिग्री)। पोस्ट उपचार समय-पाठ्यक्रम में मापा गया ग्रिड यूवी / ओजोन 12 मिनट के लिए इलाज किया गया था, जैसा कि तारांकन द्वारा इंगित किया गया था। प्रत्येक पोस्ट-ट्रीटमेंट माप एक ही ग्रिड पर किया गया था, माप के बीच विकिंग द्वारा हटाए गए नमूने के साथ। मापा विशिष्ट संपर्क कोण प्रयोगशाला पर्यावरण की स्थिति का एक समारोह के रूप में भिन्न होने की उम्मीद कर रहे हैं, और हम उपयोगकर्ताओं को उपयुक्त परिस्थितियों की पहचान करने के लिए अपनी प्रयोगशालाओं में इसी तरह के प्रयोगों प्रदर्शन की सिफारिश करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ग्राफीन-लेपित ग्रिड और अनकोटेड नियंत्रण ग्रिड की प्रतिनिधि छवियां। (एसी) प्रतिनिधि एटलस, ग्रिड वर्ग, और ग्राफीन-लेपित छेद कार्बन ग्रिड की पन्नी छेद छवियों को K3 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से लैस 300 keV माइक्रोस्कोप पर लिया गया। (डी) एस. पायोजेनेस dCas9 का क्रायोईएम माइक्रोग्राफ sgRNA के साथ जटिल में और ग्राफीन-लेपित छिद्रित कार्बन ग्रिड पर लक्ष्य डीएनए (250 ng/μL एकाग्रता पर जटिल)। (ई) पैनलों (एडी) में imaged ग्रिड से विवर्तन छवि. नारंगी तीर 2.13 Å की स्थानिक आवृत्ति के अनुरूप स्थिति को इंगित करता है। पैनल (डी) में एक समान नमूना (एफ) यूवी / ओजोन उपचार और (जी) ग्लो डिस्चार्ज किए गए छिद्रित कार्बन ग्रिड पर ग्राफीन के बिना लागू किया गया था। प्रदर्शित क्रायोईएम माइक्रोग्राफ प्रत्येक ग्रिड के प्रतिनिधि हैं और कोई कण नहीं दिखाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ग्राफीन-लेपित ग्रिड से एक Cas9 कॉम्प्लेक्स का क्रायोईएम पुनर्निर्माण। (ए) एसजीआरएनए और लक्ष्य डीएनए के साथ जटिल में एस पायोजेनेस डीसीएएस 9 के 3 डी पुनर्निर्माण से क्रायोईएम घनत्व मानचित्र। (बी) एक फिट मॉडल से अवशेष R63-L82 को अर्ध-पारदर्शी क्रायोईएम घनत्व के भीतर दर्शाया गया है, जिसमें लेबल किए गए दृश्यमान साइडचेन का एक सबसेट है। (सी) फूरियर शेल सहसंबंध (एफएससी) अनमास्क, शिथिल और कसकर नकाबपोश मानचित्रों के घटता। (डी) 3 डीएफएससी विधि23 पर आधारित हिस्टोग्राम और दिशात्मक एफएससी प्लॉट। अधिक जानकारी के लिए अनुपूरक चित्र 2 और चरण 13 देखें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: संपर्क कोण इमेजिंग स्टैंड। (ए) एक 3 डी प्रिंटेड कैमरा स्टैंड और टेबलटॉप इमेजिंग माउंट कैमरे को सुरक्षित करने के लिए एक स्थिति में जो कैमरे को कवरस्लिप के साथ विमान में संरेखित करता है। (बी)ग्रिड पैराफिन फिल्म के एक 1 सेमी x 1 सेमी वर्ग टुकड़ा के शीर्ष पर coverslip पर रखा गया है. दर्शाया गया इमेजिंग माउंट प्रदान की गई .stl फ़ाइलों (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 और पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) का उपयोग करके 3D-मुद्रित किया गया था और अधिकांश उपकरणों को समायोजित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: छवि प्रसंस्करण कार्यप्रवाह। dCas9 कॉम्प्लेक्स के लिए प्रोसेसिंग वर्कफ़्लो। नौकरी के नाम, नौकरी का विवरण और गैर-डिफ़ॉल्ट पैरामीटर (इटैलिककृत) इंगित किए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: एसटीएल प्रारूप में स्टीरियोलिथोग्राफी सीएडी फाइलें कैमरा स्टैंड (camera_stand_v1.stl) की 3 डी प्रिंटिंग की सुविधा के लिए प्रदान की जाती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: एसटीएल प्रारूप में स्टीरियोलिथोग्राफी सीएडी फाइलें टेबलटॉप इमेजिंग माउंट (slide_mount_v1.एसटीएल) की 3 डी प्रिंटिंग की सुविधा के लिए प्रदान की जाती हैं और कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

क्रायोईएम नमूना तैयार करने में कई तकनीकी चुनौतियां शामिल हैं, जिनमें अधिकांश वर्कफ़्लोज़ के लिए शोधकर्ताओं को मैन्युअल रूप से नाजुक ग्रिड को अत्यधिक देखभाल के साथ हेरफेर करने की आवश्यकता होती है ताकि उन्हें नुकसान पहुंचाने से बचा जा सके। इसके अतिरिक्त, विट्रीफिकेशन के लिए किसी भी नमूने की सुविधा अप्रत्याशित है; कणों अक्सर हवा पानी इंटरफेस के साथ या ठोस समर्थन पन्नी ग्रिड ओवरलेइंग के साथ बातचीत, जो कणों पसंदीदा अभिविन्यास को अपनाने या इमेजिंग छेद में प्रवेश करने में विफल जब तक बहुत उच्च प्रोटीन सांद्रता24 लागू कर रहे हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. ग्राफीन की एक सतत monolayer के साथ छेद क्रायोईएम ग्रिड ओवरलेइंग माइक्रोग्राफ पर कण वितरण में सुधार, कम सांद्रता पर कण संख्या में वृद्धि, और हवा पानी इंटरफेस30 पर बातचीत द्वारा संचालित पसंदीदा अभिविन्यास को कम करने में जबरदस्त वादा दिखाया गया है.

क्रायोईएम ग्रिड के लिए मौजूदा ग्राफीन कोटिंग प्रोटोकॉल की एक सीमा कोटिंग प्रक्रिया के लिए आवश्यक व्यापक मैनुअल जोड़तोड़ है, जो गुणवत्ता से समझौता कर सकती है और ग्रिड-टू-ग्रिड परिवर्तनशीलता बढ़ा सकती है। इस काम में हम ग्राफीन30 के मोनोलेयर के साथ क्रायोईएम ग्रिड कोटिंग के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों का वर्णन करते हैं।

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदमों में एमएमए के साथ सीवीडी ग्राफीन कोटिंग, एपीएस में सीवीडी ग्राफीन कॉपर सब्सट्रेट का विघटन और क्रायोईएम ग्रिड के लिए ग्राफीन का अनुप्रयोग शामिल है। हमने प्रत्येक धोने के चरण के लिए एक नए विलायक कंटेनर में ग्रिड को व्यक्तिगत रूप से संभालने और स्थानांतरित करने के बजाय, एक ही पेट्री डिश के भीतर सॉल्वैंट्स का आदान-प्रदान करके लेपित ग्रिड के मैनुअल जोड़तोड़ को कम करने के लिए मूल प्रोटोकॉल को संशोधित किया, जिससे अक्षुण्ण, उच्च गुणवत्ता, ग्राफीन-लेपित ग्रिड की उपज में वृद्धि हुई। जबकि हमने ग्राफीन लेपित ग्रिड के जोड़तोड़ को कम से कम करने का प्रयास किया, हम स्वीकार करते हैं कि क्रायोईएम ग्रिड के लिए अलग-अलग ग्राफीन वर्गों का मैन्युअल अनुप्रयोग स्वाभाविक रूप से चुनौतीपूर्ण है, और कुछ ग्रिड-टू-ग्रिड परिवर्तनशीलता की उम्मीद है।

ग्राफीन-लेपित ग्रिड को आमतौर पर नमूना आवेदन के लिए सतह हाइड्रोफिलिक को प्रस्तुत करने के लिए यूवी / ओजोन उपचार की आवश्यकता होती है। यूवी/ओजोन उपचार की अवधि और उपचार के बाद और डूबने से पहले का समय ग्रिड हाइड्रोफिलिसिटी और अंततः नमूना गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। ग्रिड निर्माण प्रोटोकॉल के अलावा, हम यूवी / ओजोन उपचार के बाद ग्रिड हाइड्रोफिलिसिटी का आकलन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। प्रक्रिया में, एक लागू नमूने की सतह संपर्क कोण लेपित ग्रिड20,44 के हाइड्रोफिलिक चरित्र के संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है. डिजाइन सस्ते में 3 डी-प्रिंट करने के लिए प्रदान किए जाते हैं, एक कस्टम ग्रिड इमेजिंग माउंट जो सतह संपर्क कोण का अनुमान लगाने के लिए एक साधारण सेल फोन कैमरा का उपयोग करता है।

अंत में, हम उत्प्रेरक निष्क्रिय आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ की 2.7 Å क्रायोईएम संरचना निर्धारित करने के लिए इस प्रोटोकॉल को नियोजित करके प्राप्त परिणामों का वर्णन करते हैं, एस. पायोजेनेस Cas9 sgRNA और लक्ष्य डीएनए40 के साथ जटिल में। ग्राफीन की अनुपस्थिति में, उपयोग की जाने वाली जटिल सांद्रता (250 एनजी / इसके विपरीत, ग्राफीन-लेपित ग्रिड उच्च घनत्व पर कणों को बोर करते हैं, जिससे 2,961 माइक्रोग्राफ से उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र के 3 डी-पुनर्निर्माण को सक्षम किया जा सकता है। एक साथ लिया गया, ये डेटा एकल कण विश्लेषण के लिए क्रायोईएम ग्रिड में ग्राफीन मोनोलेयर लगाने के मूल्य को उजागर करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

नमूने तैयार किए गए थे और अर्नोल्ड और माबेल बेकमैन फाउंडेशन के लिए धन्यवाद प्राप्त माइक्रोस्कोप पर MIT.nano में क्रायोईएम सुविधा में imaged थे। संपर्क कोण इमेजिंग उपकरणों को एमआईटी मेट्रोपोलिस मेकर स्पेस में मुद्रित किया गया था। हम Nieng यान और Yimo हान की प्रयोगशालाओं, और MIT.nano पर कर्मचारियों को इस पद्धति को अपनाने के दौरान उनके समर्थन के लिए धन्यवाद. विशेष रूप से, हम डॉ. गुआनहुई गाओ और सारा स्टर्लिंग को उनकी व्यावहारिक चर्चा और प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान R01-GM144542, 5T32-GM007287 और NSF-CAREER अनुदान 2046778 द्वारा समर्थित किया गया था। डेविस लैब में अनुसंधान अल्फ्रेड पी. स्लोन फाउंडेशन, जेम्स एच. फेरी फंड, एमआईटी जे-क्लिनिक और व्हाइटहेड परिवार द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216

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References

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Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).

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