Summary
De toepassing van steunlagen op cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM)-roosters kan de deeltjesdichtheid verhogen, interacties met de lucht-waterinterface beperken, door bundels geïnduceerde beweging verminderen en de verdeling van deeltjesoriëntaties verbeteren. Dit artikel beschrijft een robuust protocol voor het coaten van cryoEM-roosters met een monolaag grafeen voor een betere voorbereiding van cryomonsters.
Abstract
Bij cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM) worden gezuiverde macromoleculen aangebracht op een rooster met een holle koolstoffolie; De moleculen worden vervolgens gedept om overtollige vloeistof te verwijderen en snel ingevroren in een ongeveer 20-100 nm dikke laag glasachtig ijs, opgehangen in ongeveer 1 μm brede foliegaten. Het resulterende monster wordt afgebeeld met behulp van cryogene transmissie-elektronenmicroscopie en na beeldverwerking met behulp van geschikte software kunnen structuren met bijna-atomaire resolutie worden bepaald. Ondanks de wijdverbreide acceptatie van cryoEM blijft monstervoorbereiding een ernstig knelpunt in cryoEM-workflows, waarbij gebruikers vaak uitdagingen tegenkomen in verband met monsters die zich slecht gedragen in het zwevende glasvocht. Onlangs zijn methoden ontwikkeld om cryoEM-roosters aan te passen met een enkele continue laag grafeen, die fungeert als een ondersteunend oppervlak dat vaak de deeltjesdichtheid in het afgebeelde gebied verhoogt en interacties tussen deeltjes en de lucht-waterinterface kan verminderen. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor de toepassing van grafeen op cryoEM-roosters en voor het snel beoordelen van de relatieve hydrofiliciteit van de resulterende roosters. Daarnaast beschrijven we een op EM gebaseerde methode om de aanwezigheid van grafeen te bevestigen door het karakteristieke diffractiepatroon te visualiseren. Ten slotte demonstreren we het nut van deze grafeenondersteuningen door snel een dichtheidskaart met een resolutie van 2,7 Å van een Cas9-complex te reconstrueren met behulp van een zuiver monster met een relatief lage concentratie.
Introduction
Cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) is geëvolueerd tot een veelgebruikte methode voor het visualiseren van biologische macromoleculen1. Gevoed door vooruitgang in directe elektronendetectie 2,3,4, data-acquisitie5 en beeldverwerkingsalgoritmen 6,7,8,9,10, is cryoEM nu in staat om 3D-structuren met een bijna-atomaire resolutie te produceren van een snelgroeiend aantal macromoleculen11. Bovendien kunnen gebruikers, door gebruik te maken van het enkelvoudige molecuulkarakter van de benadering, meerdere structuren bepalen uit een enkel monster 12,13,14,15, wat de belofte benadrukt van het gebruik van de gegenereerde gegevens om heterogene structurele ensembles te begrijpen 16,17. Ondanks deze vooruitgang blijven er knelpunten bestaan bij de voorbereiding van het cryo-samplerooster.
Voor structurele karakterisering door cryoEM moeten biologische monsters goed worden gedispergeerd in een waterige oplossing en vervolgens snel worden ingevroren via een proces dat vitrificatie18,19 wordt genoemd. Het doel is om deeltjes op te vangen in een uniform dunne laag verglaasd ijs die in gaten op regelmatige afstand van elkaar hangt en die meestal in een laag amorfe koolstof worden gesneden. Deze amorfe koolstoffolie met patroon wordt ondersteund door een TEM-raster met een gaas van koperen of gouden steunbalken. In standaardworkflows worden roosters hydrofiel gemaakt met behulp van een gloei-ontladingsplasmabehandeling voorafgaand aan de toepassing van het monster. Overtollige vloeistof wordt gedept met filtreerpapier, waardoor de eiwitoplossing een dunne vloeibare film over de gaten kan vormen die gemakkelijk kan worden verglaasd tijdens het invriezen. Veel voorkomende uitdagingen zijn onder meer de lokalisatie van deeltjes op het lucht-watergrensvlak (AWI) en de daaropvolgende denaturatie20,21,22 of het aannemen van voorkeursoriëntaties 23,24,25, het hechten van deeltjes aan de koolstoffolie in plaats van in de gaten te migreren, en clustering en aggregatie van de deeltjes in de gaten 26. Niet-uniforme ijsdikte is een ander punt van zorg; Dik ijs kan leiden tot hogere niveaus van achtergrondruis in de microfoto's als gevolg van verhoogde elektronenverstrooiing, terwijl extreem dun ijs grotere deeltjes kan uitsluiten27.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, is een verscheidenheid aan dunne steunfolies gebruikt om roosteroppervlakken te coaten, waardoor deeltjes op deze steunen kunnen rusten en, idealiter, interacties met het lucht-watergrensvlak worden vermeden. Grafeensteunen zijn veelbelovend gebleken, deels vanwege hun hoge mechanische sterkte in combinatie met hun minimale verstrooiingsdoorsnede, waardoor het achtergrondsignaal dat door de ondersteuningslaag wordt toegevoegd, wordt verminderd28. Naast de minimale bijdrage aan achtergrondgeluid, vertoont grafeen ook een opmerkelijke elektrische en thermische geleidbaarheid29. Van met grafeen en grafeenoxide beklede roosters is aangetoond dat ze een hogere deeltjesdichtheid, een meer uniforme deeltjesverdeling30 en een verminderde lokalisatie van de AWI22 opleveren. Bovendien biedt grafeen een steunoppervlak dat verder kan worden aangepast om: 1) de fysiochemische eigenschappen van het rasteroppervlak af te stemmen door functionalisering 31,32,33; of 2) koppelbindmiddelen die de affiniteitszuivering van interessante eiwitten vergemakkelijken 34,35,36.
In dit artikel hebben we een bestaande procedure aangepast voor het coaten van cryoEM-roosters met een enkele uniforme laag grafeen30. De aanpassingen zijn bedoeld om de verwerking van het net in het hele protocol tot een minimum te beperken, met als doel de opbrengst en reproduceerbaarheid te verhogen. Daarnaast bespreken we onze aanpak om de werkzaamheid van verschillende UV/ozonbehandelingen te evalueren bij het hydrofiel maken van roosters voorafgaand aan het dompelen. Deze stap in de voorbereiding van cryoEM-monsters met behulp van met grafeen gecoate roosters is van cruciaal belang, en we hebben gemerkt dat onze eenvoudige methode om de relatieve hydrofiliciteit van de resulterende roosters te kwantificeren nuttig is. Met behulp van dit protocol demonstreren we het nut van het gebruik van met grafeen gecoate roosters voor structuurbepaling door een 3D-reconstructie met hoge resolutie te genereren van katalytisch inactieve S. pyogenes Cas9 in complex met gids-RNA en doel-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van CVD-grafeen
- Bereid grafeen-etsoplossing zoals hieronder beschreven.
- Los 4,6 g ammoniumpersulfaat (APS) op in 20 ml moleculair water in een bekerglas van 50 ml voor een oplossing van 1 M en dek af met aluminiumfolie. Laat APS volledig oplossen terwijl u doorgaat naar stap 1.2.
- Bereid een deel van CVD-grafeen voor op methylmethacrylaat (MMA)-coating. Snijd voorzichtig een vierkant stuk CVD-grafeen. Breng het vierkant over op een dekglaasje (50 mm x 24 mm) in een schone petrischaal en dek af tijdens het transport naar de spincoater.
OPMERKING: Een vierkant van 18 mm x 18 mm zou 25-36 met grafeen gecoate rasters moeten opleveren.
2. CVD-grafeen coaten met MMA
- Stel de instellingen van de spincoater in op een centrifuge van 60 seconden met hoge snelheid bij 2.500 tpm. Plaats het CVD-grafeen voorzichtig op de boorkop van de juiste maat.
NOTITIE: Idealiter steekt het CVD-grafeen 1-2 mm uit over de rand van de geselecteerde boorkop om aspiratie van MMA in het vacuümsysteem te voorkomen. - Druk op de Take/Absorb-knop om de vacuümpomp in te schakelen en het CVD-grafeen op de boorkop te bevestigen. Breng MMA aan op het midden van het CVD-grafeenvierkant, sluit het deksel en druk onmiddellijk op de Start/Stop-knop . Voor een vierkant van 18 mm x 18 mm CVD-grafeen is 40 μL MMA voldoende.
- Zodra het centrifugeren is gestopt, schakelt u de vacuümpomp uit en haalt u voorzichtig het MMA-gecoate CVD-grafeen op met een pincet. Keer het CVD-grafeen zo om dat de MMA-gecoate kant naar beneden is gericht en plaats het terug op het glazen dekglaasje.
3. Plasma-etsen van de achterkant van het grafeen
- Breng CVD-grafeen op het dekglaasje over in de gloeiontlader en gloeiontlading gedurende 30 s bij 25 mA met een pincet met platte punt.
- Doe het CVD-grafeen op het dekglaasje terug in de petrischaal en dek af tijdens het transport naar de koperetsplaats. MMA-coating beschermt de grafeenlaag aan de bovenzijde tegen plasma-etsen.
4. Snijden van MMA-gecoate CVD-grafeenvierkanten ter grootte van een raster
- Gebruik twee pincetten om het CVD-grafeenvierkant te ondersteunen. Let op de oriëntatie van het CVD-grafeenvierkant, houd de MMA-kant naar boven terwijl deze aan het pincet is bevestigd (CRITICAL).
- Snijd CVD-grafeen in vierkanten van ongeveer 3 mm x 3 mm. Gebruik voor deze stap twee sets pincetten met omgekeerde werking om het CVD-grafeenvierkant met de goede kant naar boven te houden en op zijn plaats te verankeren, en ook om de rand van een vierkant van 3 mm x 3 mm vast te houden nadat het van de rest van het vierkant is weggesneden.
5. Oplossen van kopersubstraat van MMA-gecoat CVD-grafeen
- Drijf voorzichtig elk vierkant van 3 mm x 3 mm in de APS-oplossing. Maak contact met het oppervlak van de APS-oplossing voordat u elk vierkant loslaat. Kantel het bekerglas zodanig dat elk vierkant onder een ondiepe hoek in de oplossing kan worden geplaatst; Dit zorgt ervoor dat het vierkant niet wegzakt.
- Dek het bekerglas af met aluminiumfolie en incubeer een nacht bij 25 °C.
6. MMA/grafeenfilms verwijderen uit APS
- Gebruik een glazen dekglaasje met afmetingen 12 mm x 50 mm en haal de MMA/grafeenvierkanten uit APS door het dekglaasje voorzichtig verticaal in het APS te steken en het dekglaasje vervolgens zijwaarts te bewegen, zodat het grenst aan een zwevend MMA/grafeenvierkant.
- Verwijder het dekglaasje voorzichtig en zorg ervoor dat het winkelhaakje bij het verwijderen volledig aan de zijkant van het dekglaasje hecht.
- Breng MMA/grafeenvierkanten gedurende 20 minuten over in een schoon bekerglas van 50 ml gevuld met water van moleculaire kwaliteit. Dompel het dekglaasje voorzichtig met een MMA/grafeenvierkant verticaal in het water en zorg ervoor dat het vierkant loskomt van het dekglaasje bij interactie met het wateroppervlak. Herhaal dit voor alle MMA/grafeenvierkanten.
7. Grafeen op roosters plakken
- Dompel met een pincet met negatieve werking een rooster voorzichtig verticaal in het water met de koolstofzijde naar een drijvend MMA/grafeenvierkant gericht. Eenmaal in contact met het vierkant, verwijdert u voorzichtig het rooster en zorgt u ervoor dat het vierkant bij verwijdering volledig aan de koolstofzijde van het rooster hecht. Minimaliseer zijdelingse beweging van het rooster wanneer het in water wordt ondergedompeld om beschadiging van roostervierkanten (CRITICAL) te voorkomen.
- Leg de roosters op een schoon dekglaasje met de MMA/grafeenkant naar boven en laat ze 1 tot 2 minuten aan de lucht drogen. Breng dekglaasje-grafeen/MMA-gecoate roosters over naar een kookplaat die is ingesteld op 130 °C met behulp van een pincet met platte punt.
- Dek af met de bovenkant van een glazen petrischaal en incubeer gedurende 20 min. Haal van het vuur en laat 1 tot 2 minuten afkoelen tot kamertemperatuur.
LET OP: Wees voorzichtig, want de bovenkant van de petrischaal zal extreem heet zijn.
8. MMA oplossen met aceton
- Breng het hele dekglaasje over in een petrischaal gevuld met 15 ml aceton. Incubeer gedurende 30 min.
- Breng aceton, waarin de roosters zijn geïncubeerd, met een schone glazen serologische pipet over in een afvalcontainer. Voeg voorzichtig 15 ml verse aceton toe aan de petrischaal met behulp van een schone glazen serologische pipet. Incubeer gedurende 30 min.
- Herhaal deze wasstappen voor in totaal 3 acetonwasbeurten.
9. Resterende aceton verwijderen met isopropanol
- Verwijder na 3 wasbeurten aceton en vervang deze door 15 ml isopropanol met behulp van een schone serologische pipet van glas. Incubeer gedurende 20 min.
- Herhaal dit 3x voor een totaal van 4 isopropanol wasbeurten. Verwijder de roosters voorzichtig van isopropanol en laat ze met een pincet aan de lucht drogen op een schoon dekglaasje.
OPMERKING: Resterende isopropanol kan het moeilijk maken om roosters los te maken van een pincet. Door contact te maken tussen het rooster en het schone dekglaasje voordat u het rooster van het pincet losmaakt, kunt u dit probleem verlichten. - Verdamp de resterende organische stoffen door het dekglaasje met met grafeen gecoate roosters gedurende 10 minuten over te brengen op een kookplaat die is ingesteld op 100 °C. Koel af tot kamertemperatuur en bewaar onder vacuüm tot gebruik.
10. UV/ozonbehandeling van met grafeen gecoate roosters
- Plaats de roosters met een pincet voorzichtig in een schoon verlichtingsgebied van een UV/ozonreiniger met de met grafeen gecoate kant naar boven.
- Schuif het verlichtingsgebied dicht en zet de machine AAN. Draai de tijdknop naar de aangegeven behandelingstijd om te beginnen met UV/ozonbehandeling van de roosters.
OPMERKING: De duur van de behandeling is een afstembare parameter, waarbij overmatige behandeling het rooster kan beschadigen. Han et al.30 beveelt 10 minuten UV/ozonbehandeling aan, en we hebben ook een behandeling van 10 minuten voldoende gevonden. Zie stap 12 voor richtlijnen voor het afstemmen van deze behandeltijd. - Ga direct verder met het onderdompelen van een cryoEM-monster op de behandelde roosters door de duikstappen te volgen zoals beschreven in Koh et al.37.
OPMERKING: Atmosferische koolwaterstoffen kunnen zich ophopen op het roosteroppervlak na UV/ozonbehandeling en de hydrofobiciteit van het grafeenoppervlak verhogen38,39. Om dit te voorkomen, dompelt u de met UV/ozon behandelde roosters onmiddellijk onder. Het kan voordelig zijn om UV/ozonroosters in batches te behandelen, bijvoorbeeld UV/ozon zes roosters te behandelen en die zes roosters onmiddellijk te onderdompelen, vervolgens UV/ozon een tweede partij roosters te behandelen, gevolgd door de tweede partij te onderdompelen.
11. Een diffractiebeeld vastleggen
- Zorg ervoor dat de microscoop goed is afgesteld met parallelle verlichting en stel de uiteindelijke onscherpte in op -0.2 μm.
- Plaats het fluorescerende scherm en de straalstop volledig. Ga naar de diffractiemodus om diffractievlekken duidelijk te visualiseren.
- Verkrijg een beeld met behulp van een CCD-camera en evalueer het met behulp van beeldanalysesoftware.
OPMERKING: De gemakkelijkst waarneembare en identificeerbare diffractievlekken die door een grafeenmonolaag worden gegenereerd, zijn 6 vlekken die overeenkomen met een ruimtelijke frequentie van 2,13 Å. Gebruik een meetinstrument om de afstand van het midden van de gediffracteerde bundel tot een van deze diffractiepunten in reciproke eenheden te schatten. Met name 2,13 Å
0,47 Å-1.
0,47 Å-1.12. Beoordeling van de hydrofiliciteit van het net
- Bereid de beeldvormingsinstellingen voor. Zoek een telefoonstandaard, een beeldoppervlak op een tafelblad, een telefoon met camera, een glazen dekglaasje en paraffinefilm. De hier getoonde afbeeldingen zijn verkregen met behulp van een telefoonstandaard en een beeldvormingsoppervlak op tafel die in 3D zijn geprint met behulp van de meegeleverde .stl-bestanden, wat resulteert in gemakkelijker reproduceerbare en kwantificeerbare contacthoekmetingen (aanvullende afbeelding 1A).
- Leg een glazen dekglaasje op het vlakke oppervlak, knip vervolgens een vierkant van 1 cm bij 1 cm paraffinefolie en plaats het op het glazen dekglaasje. Plaats de telefoon op de telefoonstandaard en richt de telefoon zo dat de camera zich in het vlak van het glazen dekglaasje bevindt. Zet de telefoon in deze positie vast met elastiekjes (aanvullende afbeelding 1B). Maak een voorbeeldfoto om te controleren of de camera is uitgelijnd met het beeldoppervlak.
- Direct na de UV/ozonbehandeling van met grafeen gecoate roosters een enkel rooster op het vierkant van de paraffinefolie op het glazen dekglaasje leggen. Zorg ervoor dat de grafeenzijde naar boven wijst. Breng met een pipet een waterdruppel van 2 μL aan op het midden van het roosteroppervlak en maak direct een foto.
OPMERKING: Herhaal deze stap na: i) de gewenste intervallen van UV/ozonbehandeling om een voldoende lange behandeling te bepalen; of ii) gewenste tijdsintervallen na UV/ozonbehandeling om te meten hoe lang na de behandeling het roosteroppervlak zijn hydrofiele karakter behoudt. - Bereken contacthoeken op basis van foto's door ze te importeren in ImageJ43 en de contacthoekplug-in te gebruiken.
13. Analyse van één deeltje van de dCas9 complexe dataset
OPMERKING: Alle beeldverwerking die in dit protocol wordt beschreven, is uitgevoerd met behulp van cryoSPARC versie 4.2.1.
- Films voorbewerken met behulp van de taken Patch Motion Correction en Patch CTF Estimation. Voer partikelpicking uit met behulp van de taak Blobkiezer, met behulp van een bolvormige blob met een diameter van 115 Å tot 135 Å.
- Extraheer deeltjes met behulp van de taak Extract uit microfoto's, met behulp van genormaliseerde correlatiecoëfficiënt (NCC) en vermogensdrempels, wat resulteert in ongeveer 200-300 deeltjes per microfoto. Houd er rekening mee dat de juiste drempels en het resulterende aantal deeltjes kunnen variëren, en dat gebruikers de kwaliteit van de oogst over een reeks microfoto's moeten inspecteren om geschikte omstandigheden te identificeren.
- Voer initiële reconstructies met meerdere klassen uit met behulp van de Ab-initio-reconstructietaak, waarvoor drie klassen nodig zijn. Twee van de drie klassen zullen waarschijnlijk niet-Cas9-deeltjes bevatten, inclusief oppervlakteverontreinigingen. Selecteer de klasse die lijkt op dCas9 voor verdere verwerking.
OPMERKING: Extra rondes van Ab-initio-reconstructie met meerdere klassen of heterogene verfijning kunnen worden toegepast om de deeltjesstapel verder te verfijnen. - Voer 3D-verfijning uit met behulp van de taak Niet-uniforme verfijning door standaardparameters te selecteren. Maak een schatting van de resolutie van de reconstructie met behulp van de Validation (FSC) en ThreeDFSC taken, met behulp van de kaarten en het masker van de uiteindelijke 3D-verfijning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle fabricage van met grafeen gecoate cryoEM-roosters met behulp van de hier beschreven apparatuur (Figuur 1) en het protocol (Figuur 2) zal resulteren in een monolaag van grafeen die de foliegaten bedekt, wat kan worden bevestigd door het karakteristieke diffractiepatroon. Om de adsorptie van eiwitten aan het grafeenoppervlak te bevorderen, kan UV/ozonbehandeling worden gebruikt om het oppervlak hydrofiel te maken door zuurstofhoudende functionele groepen te installeren. Koolwaterstofverontreinigingen in de lucht kunnen echter al 5 minuten na de UV/ozonbehandeling aan het grafeenoppervlak adsorberen en dit effect tegengaan38,39. Belangrijk is dat zowel de duur van de UV/ozonbehandeling als de tijd die is verstreken tussen de behandeling en het dompelen de kwaliteit van het monster kunnen beïnvloeden. We demonstreren deze effecten met behulp van een eenvoudige methode om het hydrofiele karakter van het gecoate rooster te beoordelen op basis van de contacthoek van het oppervlak (Figuur 3; zie stap 12).
Om het gebruik van grafeendragers in cryoEM met één deeltje aan te tonen, pasten we een katalytisch inactief RNA-geleid DNA-endonuclease S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 in complex met sgRNA en doel-DNA naar met grafeen gecoate roosters, verzamelde een cryoEM-dataset van deze roosters en voerde een analyse van afzonderlijke deeltjes uit7. Met grafeen beklede roosters bevatten consequent ~300 deeltjes per microfoto bij een vergroting van 0,654 Å/pix met behulp van een 300 keV microscoop uitgerust met een K3 directe elektronendetector (Figuur 4A-E). Een 8 uur durende gegevensverzamelingssessie met een kanteling van +18° leverde 2.963 films en 324.439 deeltjes op in een uiteindelijke samengestelde stapel. Met behulp van deze deeltjes genereerden we een 3D-reconstructie die, na verfijning, een dichtheidskaart opleverde met een geschatte resolutie van 2,7 Å en adequate hoekbemonstering om anisotrope artefacten te vermijden (Figuur 5). Een atomair model (PDB 6o0z)41 werd aan deze kaart gekoppeld en verfijnd met behulp van ISOLDE42. Residuen R63-L82 van dit gefitte atoommodel worden weergegeven met de verfijnde cryoEM-dichtheidskaart, die de opgeloste zijketendichtheid benadrukt (Figuur 5B). Bij vergelijking van hetzelfde monster en dezelfde concentratie (250 ng/μL) toegepast op identieke roosters zonder grafeen, werden geen deeltjes waargenomen (Figuur 4F,G). Deze observatie benadrukt de werkzaamheid van de grafeenondersteuning bij het mogelijk maken van de visualisatie van deeltjes uit monsters met een lage concentratie.
Figuur 1: Benodigde apparatuur. Laboratoriumapparatuur en gereedschappen die nodig zijn voor de fabricage van grafeenroosters met behulp van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven. Artikelen en hun hoeveelheid worden dienovereenkomstig weergegeven en geëtiketteerd. Vereiste reagentia die niet worden getoond, zijn onder meer: CVD-grafeen, methylmethacrylaat EL-6 (MMA), ammoniumpersulfaat (APS), aceton, isopropanol, ethanol, water van moleculaire kwaliteit. Vereiste instrumenten die niet worden getoond, zijn onder meer: spincoater, gloeiontlader, kookplaat, vacuümexsiccator en thermometer. Alle vereiste items worden gedetailleerd beschreven in de Tabel met materialen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van het fabricageproces van het grafeenrooster. Grafeen wordt gecoat met een dunne laag methylmethacrylaat EL-6 (MMA) met behulp van een spincoater (stap 2). Grafeen aan de andere kant van de koperfolie wordt verwijderd via plasma-etsen (stap 3). Ammoniumpersulfaat (APS) wordt vervolgens gebruikt om het koper weg te etsen (stappen 4-5). De MMA-grafeenfilm wordt op het rasteroppervlak geplaatst (stap 6-7). Ten slotte wordt MMA opgelost tijdens een reeks wasbeurten met organische oplosmiddelen (stappen 8-9). De hierboven aangegeven stappen komen overeen met de genummerde stappen die worden beschreven in de sectie protocollen. Deze methode is overgenomen van Han et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beoordeling van de hydrofiliciteit van het roosteroppervlak als functie van de duur van de UV/ozonbehandeling en de verstreken tijd na de behandeling. (A) Gemeten contacthoeken uitgezet als functie van de duur van de behandeling. Verminderde contacthoeken komen overeen met verhoogde hydrofiliciteit (onbehandeld rooster: 78°; 20 min: 37°). Contacthoeken gemeten met ImageJ43. (B) Gemeten contacthoeken uitgezet als functie van de tijd, na de behandeling (0 min: 45°; 60 min: 74°). Het raster gemeten in de nabehandelingstijd werd gedurende 12 minuten behandeld met UV/ozon, zoals aangegeven met een sterretje. Elke meting na de behandeling werd uitgevoerd op hetzelfde rooster, waarbij het monster werd verwijderd door wicking tussen de metingen. Specifieke gemeten contacthoeken zullen naar verwachting variëren als functie van de omgevingsomstandigheden in het laboratorium, en we raden gebruikers aan soortgelijke experimenten in hun laboratoria uit te voeren om geschikte omstandigheden te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van met grafeen gecoate roosters en ongecoate controleroosters. (A-C) Representatieve atlas-, rastervierkant- en foliegatafbeeldingen van met grafeen gecoate holle koolstofroosters, genomen met een microscoop van 300 keV uitgerust met een K3 directe elektronendetector. (D) CryoEM-microfoto van S. pyogenes dCas9 in complex met sgRNA en doel-DNA (complex bij 250 ng/μL concentratie) op grafeengecoat holkoolstofrooster. (E) Diffractiebeeld van raster afgebeeld in panelen (A-D). De oranje pijl geeft een positie aan die overeenkomt met een ruimtelijke frequentie van 2,13 Å. Een identiek monster als dat in paneel (D) werd toegepast op (F) UV/ozonbehandeling en (G) gloeiende geloosde holle koolstofroosters zonder grafeen. De getoonde CryoEM-microfoto's zijn representatief voor elk raster en tonen geen deeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: CryoEM reconstructie van een Cas9 complex uit grafeen-gecoate roosters. (A) CryoEM dichtheidskaart van 3D reconstructie van de S. pyogenes dCas9 in complex met sgRNA en doel-DNA. (B) Residuen R63-L82 van een passend model worden afgebeeld binnen de semi-transparante cryoEM-dichtheid, met een subset van zichtbare zijketens gelabeld. (C) Fourier Shell Correlation (FSC) curven van de ontmaskerde, losjes en strak gemaskeerde kaarten. (D) Histogram en directionele FSC-grafiek op basis van de 3DFSC-methode23. Zie aanvullende figuur 2 en stap 13 voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende afbeelding 1: Contacthoekbeeldstandaard. (A) Een 3D-geprinte camerastandaard en een beeldhouder op tafel om de camera vast te zetten in een positie die de camera in het vlak uitlijnt met het dekglaasje. (B) Het rooster wordt op het dekglaasje geplaatst op een vierkant stuk paraffinefolie van 1 cm x 1 cm. De afgebeelde beeldmontagehouder is 3D-geprint met behulp van de meegeleverde .stl-bestanden (Supplementary Coding File 1 en Supplementary Coding File 2) en kan gemakkelijk worden aangepast aan de meeste apparaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 2: Workflow voor beeldverwerking. Verwerkingsworkflow voor dCas9 complex. Taaknamen, taakdetails en niet-standaardparameters (cursief) worden aangegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: Stereolithografie CAD-bestanden in het STL-formaat worden geleverd om het 3D-printen van een camerastatief (camera_stand_v1.stl) te vergemakkelijken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 2: Stereolithografie CAD-bestanden in het STL-formaat worden geleverd om het 3D-printen van de tafelmodel beeldvormingsmontering (slide_mount_v1.stl) te vergemakkelijken en klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voorbereiding van cryoEM-monsters brengt een groot aantal technische uitdagingen met zich mee, waarbij de meeste workflows vereisen dat onderzoekers fragiele roosters handmatig en uiterst voorzichtig manipuleren om beschadiging te voorkomen. Bovendien is de ontvankelijkheid van een monster voor vitrificatie onvoorspelbaar; Deeltjes interageren vaak met het lucht-water-grensvlak of met de stevige steunfolie die de roosters bedekt, wat ertoe kan leiden dat deeltjes de voorkeursoriëntatie aannemen of niet in de beeldvormingsgaten terechtkomen, tenzij zeer hoge eiwitconcentraties worden toegepast24. Het overlappen van holle cryoEM-roosters met een continue monolaag van grafeen is veelbelovend gebleken bij het verbeteren van deeltjesverdelingen op microfoto's, het verhogen van het aantal deeltjes bij lage concentraties en het verminderen van voorkeursoriëntaties die worden aangedreven door interacties op het lucht-water-grensvlak30.
Een beperking van bestaande grafeencoatingprotocollen voor cryoEM-roosters zijn de uitgebreide handmatige manipulaties die nodig zijn voor het coatingproces, wat de kwaliteit in gevaar kan brengen en de variabiliteit van raster tot raster kan vergroten. In dit werk beschrijven we kleine aanpassingen aan een bestaand protocol voor het coaten van cryoEM-roosters met een monolaag grafeen30.
Kritieke stappen binnen dit protocol zijn onder meer het coaten van CVD-grafeen met MMA, het oplossen van het CVD-grafeenkopersubstraat in APS en het aanbrengen van grafeen op cryoEM-roosters. We hebben het oorspronkelijke protocol aangepast om handmatige manipulaties van de gecoate roosters te minimaliseren door oplosmiddelen uit te wisselen in dezelfde petrischaal, in plaats van de roosters voor elke wasstap afzonderlijk te hanteren en over te brengen naar een nieuwe oplosmiddelcontainer, met als doel de opbrengst van intacte, hoogwaardige, met grafeen gecoate roosters te verhogen. Hoewel we ernaar hebben gestreefd om manipulaties van met grafeen gecoate roosters tot een minimum te beperken, erkennen we dat de handmatige toepassing van individuele grafeenvierkanten op cryoEM-rasters inherent uitdagend is en dat enige variabiliteit van raster tot raster wordt verwacht.
Met grafeen gecoate roosters vereisen doorgaans een UV/ozonbehandeling om het oppervlak hydrofiel te maken voor monstertoepassing. De duur van de UV/ozonbehandeling en de tijd die is verstreken na de behandeling en voorafgaand aan het dompelen kunnen van invloed zijn op de hydrofiliciteit van het rooster en uiteindelijk op de kwaliteit van het monster. Naast het netfabricageprotocol beschrijven we een techniek voor het beoordelen van de hydrofiliciteit van het net na UV/ozonbehandeling. In de procedure wordt de contacthoek van het oppervlak van een aangebracht monster gebruikt als indicator voor het hydrofiele karakter van het gecoate rooster20,44. Er worden ontwerpen geleverd om goedkoop een op maat gemaakte rasterbeeldhouder te 3D-printen die een eenvoudige camera van een mobiele telefoon gebruikt om de contacthoek van het oppervlak te schatten.
Ten slotte beschrijven we de resultaten die zijn verkregen door dit protocol te gebruiken om de 2,7 Å cryoEM-structuur te bepalen van het katalytisch inactieve RNA-geleide DNA-endonuclease, S. pyogenes Cas9 in complex met sgRNA en doel-DNA40. Bij afwezigheid van grafeen werden geen deeltjes waargenomen in foliegaten bij de gebruikte complexe concentraties (250 ng/μL). Daarentegen droegen met grafeen gecoate roosters deeltjes met een hoge dichtheid, waardoor een gemakkelijke 3D-reconstructie van een kaart met hoge resolutie van 2.961 microfoto's mogelijk werd. Alles bij elkaar benadrukken deze gegevens de waarde van het toepassen van grafeenmonolagen op cryoEM-roosters voor analyse van afzonderlijke deeltjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Specimens werden geprepareerd en afgebeeld in de CryoEM-faciliteit in MIT.nano op microscopen die waren verkregen dankzij de Arnold en Mabel Beckman Foundation. Beeldvormingsapparaten voor contacthoeken werden geprint in de MIT Metropolis Maker Space. We danken de laboratoria van Nieng Yan en Yimo Han en het personeel van MIT.nano voor hun steun tijdens de invoering van deze methode. In het bijzonder willen we Drs. Guanhui Gao en Sarah Sterling bedanken voor hun inzichtelijke discussies en feedback. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01-GM144542, 5T32-GM007287 en NSF-CAREER-subsidie 2046778. Onderzoek in het Davis-lab wordt ondersteund door de Alfred P. Sloan Foundation, het James H. Ferry Fund, de MIT J-Clinic en de Whitehead Family.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Dubochet, J.
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S.
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
