Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66023
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Применение опорных слоев к сеткам криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) может увеличить плотность частиц, ограничить взаимодействие с границей раздела воздух-вода, уменьшить движение, индуцированное лучом, и улучшить распределение ориентаций частиц. В данной работе описан надежный протокол покрытия криоЭМ-решеток монослоем графена для улучшения подготовки криообразцов.

Abstract

В криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) очищенные макромолекулы наносятся на сетку, несущую дырявую углеродную фольгу; Затем молекулы промокают, чтобы удалить лишнюю жидкость, и быстро замораживают в слое стекловидного льда толщиной примерно 20-100 нм, взвешенном в отверстиях фольги шириной примерно 1 мкм. Полученный образец получают с помощью криогенной просвечивающей электронной микроскопии, а после обработки изображения с помощью соответствующего программного обеспечения можно определить структуры с близким к атомному разрешению. Несмотря на широкое распространение криоЭМ, подготовка образцов остается серьезным узким местом в рабочих процессах криоЭМ, и пользователи часто сталкиваются с проблемами, связанными с плохим поведением образцов во взвешенном стекловидном льду. В последнее время были разработаны методы модификации криоЭМ-сеток с помощью одного непрерывного слоя графена, который действует как опорная поверхность, часто увеличивающая плотность частиц в изображаемой области и может уменьшить взаимодействие между частицами и границей раздела воздух-вода. Здесь мы приводим подробные протоколы для нанесения графена на криоЭМ-решетки и для быстрой оценки относительной гидрофильности полученных сеток. Кроме того, мы описываем метод на основе ЭМ для подтверждения присутствия графена путем визуализации его характерной дифракционной картины. Наконец, мы демонстрируем полезность этих графеновых носителей, быстро реконструируя карту плотности с разрешением 2,7 Å комплекса Cas9 с использованием чистого образца при относительно низкой концентрации.

Introduction

Криогенная электронная микроскопия одиночных частиц (криоЭМ) превратилась в широко используемый метод визуализации биологических макромолекул1. Благодаря достижениям в области прямого обнаружения электронов 2,3,4, сбора данных5 и алгоритмов обработки изображений 6,7,8,9,10, cryoEM теперь способна создавать 3D-структуры с близким к атомному разрешением быстро растущего числа макромолекул 11. Кроме того, используя одномолекулярную природу подхода, пользователи могут определить несколько структур из одного образца 12,13,14,15, что подчеркивает перспективность использования полученных данных для понимания гетерогенных структурных ансамблей 16,17. Несмотря на этот прогресс, сохраняются узкие места в подготовке сетки для криообразцов.

Для структурной характеристики с помощью криоЭМ биологические образцы должны быть хорошо диспергированы в водном растворе, а затем подвергнуты мгновенной заморозке с помощью процесса, называемого витрификацией18,19. Цель состоит в том, чтобы улавливать частицы в равномерно тонком слое стекловидного льда, взвешенного в равномерно расположенных отверстиях, которые, как правило, вырезаны в слое аморфного углерода. Эта узорчатая аморфная углеродная фольга поддерживается сеткой TEM, несущей сетку из медных или золотых опорных стержней. В стандартных рабочих процессах решетки становятся гидрофильными с помощью плазменной обработки тлеющим разрядом перед нанесением образца. Излишки жидкости промокают фильтровальной бумагой, что позволяет белковому раствору образовывать тонкую жидкую пленку через отверстия, которую можно легко остекловыть во время погружной заморозки. Общие проблемы включают локализацию частиц на границе раздела воздух-вода (AWI) и последующую денатурацию 20,21,22 или принятие предпочтительных ориентаций 23,24,25, прилипание частиц к углеродной фольге вместо того, чтобы мигрировать в отверстия, а также кластеризацию и агрегацию частиц в отверстиях26. Еще одной проблемой является неоднородная толщина льда; Толстый лед может привести к более высокому уровню фонового шума на микрофотографиях из-за повышенного рассеяния электронов, в то время как чрезвычайно тонкий лед может исключать более крупные частицы27.

Для решения этих проблем были использованы различные тонкие опорные пленки для покрытия поверхностей сетки, что позволяет частицам оставаться на этих опорах и, в идеале, избегать взаимодействия с границей раздела воздух-вода. Графеновые опоры показали большие перспективы, отчасти из-за их высокой механической прочности в сочетании с минимальным сечением рассеяния, что снижает фоновый сигнал, добавляемый опорным слоем28. В дополнение к своему минимальному вкладу в фоновый шум, графен также демонстрирует замечательную электро- и теплопроводность29. Было показано, что сетки с покрытием из графена и оксида графена обеспечивают более высокую плотность частиц, более равномерное распределение частиц30 и меньшую локализацию к AWI22. Кроме того, графен обеспечивает опорную поверхность, которая может быть дополнительно модифицирована для: 1) настройки физико-химических свойств поверхности сетки посредством функционализации 31,32,33; или 2) парные связывающие агенты, облегчающие аффинную очистку интересующих белков 34,35,36.

В данной статье мы модифицировали существующую процедуру покрытия криоЭМ-сеток одним однородным слоем графена30. Изменения направлены на минимизацию обработки сетки во всем протоколе с целью повышения производительности и воспроизводимости. Кроме того, мы обсуждаем наш подход к оценке эффективности различных УФ/озоновых обработок для придания решеткам гидрофильности перед погружением. Этот этап подготовки криоЭМ образцов с использованием сеток с графеновым покрытием имеет решающее значение, и мы обнаружили, что наш простой метод количественной оценки относительной гидрофильности полученных сеток является полезным. Используя этот протокол, мы демонстрируем полезность использования сеток с графеновым покрытием для определения структуры путем создания 3D-реконструкции с высоким разрешением каталитически неактивного S. pyogenes Cas9 в комплексе с направляющей РНК и ДНК-мишенью.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление графена CVD

  1. Приготовьте раствор для травления графена, как описано ниже.
    1. Растворите 4,6 г персульфата аммония (APS) в 20 мл молекулярной воды в стакане объемом 50 мл для раствора 1 М и накройте алюминиевой фольгой. Дайте APS полностью раствориться, переходя к шагу 1.2.
  2. Подготовьте участок графена CVD для покрытия метилметакрилатом (ММА). Аккуратно вырежьте квадратный срез CVD графена. Перенесите квадрат на покровный лист (50 мм x 24 мм) в чистую чашку Петри и накройте крышкой во время транспортировки в машину для нанесения покрытий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Квадрат размером 18 мм x 18 мм должен дать 25-36 сеток с графеновым покрытием.

2. Покрытие CVD графеном MMA

  1. Установите настройки центрифугатора на 60 с высокоскоростной отжим при 2 500 об/мин. Осторожно поместите графен CVD на патрон подходящего размера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале графен CVD должен выступать на 1-2 мм за край выбранного патрона, чтобы предотвратить аспирацию MMA в вакуумную систему.
  2. Нажмите кнопку Take/Absorb , чтобы включить вакуумный насос и прикрепить графен CVD к патрону. Нанесите MMA на центр графенового квадрата CVD, закройте крышку и немедленно нажмите кнопку «Старт / Стоп ». Для квадрата CVD-графена размером 18 мм x 18 мм достаточно 40 мкл MMA.
  3. После остановки отжима отключите вакуумный насос и осторожно извлеките графен CVD с покрытием MMA пинцетом. Переверните графен CVD так, чтобы сторона, покрытая MMA, была обращена вниз, и поместите его обратно на стеклянный защитный лист.

3. Плазменное травление обратной стороны графена

  1. С помощью пинцета с плоским наконечником перенесите графен CVD на покровное стекло в тлеющий разрядник и тлеющий разряд в течение 30 с током 25 мА.
  2. Верните графен CVD на покровном стекло в чашку Петри и крышку во время транспортировки в зону травления меди. Покрытие MMA защитит верхний слой графена от плазменного травления.

4. Резка графеновых квадратов CVD размером с сетку MMA

  1. Используйте две пары пинцетов для поддержки графенового квадрата CVD. Обратите внимание на ориентацию графенового квадрата CVD, держите сторону MMA вверх, когда прикреплена к пинцету (КРИТИЧНО).
  2. Нарежьте графен CVD на квадраты примерно 3 мм x 3 мм. Используйте два набора щипцов обратного действия для этого шага, чтобы удерживать графеновый квадрат CVD правой стороной вверх и закрепить его в нужном положении, а также удерживать край квадрата размером 3 мм x 3 мм после того, как он отрезал его от остальной части квадрата.

5. Растворение медной подложки из CVD-графена с покрытием MMA

  1. Осторожно прогладьте каждый квадрат размером 3 мм x 3 мм в растворе APS. Соприкоснитесь с поверхностью раствора APS, прежде чем отпускать каждый квадрат. Наклоните стакан так, чтобы каждый квадрат можно было поместить в раствор под небольшим углом; Это гарантирует, что квадрат не утонет.
  2. Накройте стакан алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение ночи при температуре 25 °C.

6. Удаление пленок MMA/графена из APS

  1. Используйте стеклянный защитный лист размером 12 мм x 50 мм и извлеките квадраты MMA/графена из APS, осторожно погрузив защитный лист вертикально в APS, а затем переместив покровный лист в сторону так, чтобы он примыкал к плавающему квадрату MMA/графена.
  2. Осторожно снимите защитный лист и убедитесь, что квадрат полностью прилегает к боковой стороне защитного стекла при снятии.
  3. Переложите квадраты MMA/графена в чистый стакан объемом 50 мл, наполненный молекулярной водой, на 20 минут. Осторожно погрузите покровное стекло с прикрепленным квадратом MMA/графена в воду вертикально и убедитесь, что квадрат вываливается из покровного стекла при взаимодействии с поверхностью воды. Повторите то же самое для всех квадратов MMA/graphene.

7. Прилипание графена к сеткам

  1. Используя пинцет отрицательного действия, осторожно опустите сетку вертикально в воду карбоновой стороной, обращенной к плавающему квадрату MMA/графена. После контакта с квадратом осторожно снимите решетку и убедитесь, что квадрат полностью прилегает к углеродной стороне решетки после снятия. Сведите к минимуму боковое смещение сетки при погружении в воду, чтобы не повредить квадраты сетки (КРИТИЧЕСКИЙ).
  2. Положите решетки на чистый покровный лист MMA/графеновой стороной вверх и сушите на воздухе в течение 1–2 минут. Перенесите сетки с покрытием из графена/MMA на горячую плиту, установленную на 130 °C, с помощью пинцета с плоским наконечником.
  3. Накрыть крышкой стеклянной чашки Петри и инкубировать 20 мин. Снимите с огня и охладите до комнатной температуры в течение 1-2 минут.
    ВНИМАНИЕ: Соблюдайте осторожность, так как верхняя часть чашки Петри будет очень горячей.

8. Растворение ММА ацетоном

  1. Переложите весь покровный листок в чашку Петри, наполненную 15 мл ацетона. Инкубировать 30 мин.
  2. С помощью чистой стеклянной серологической пипетки перенесите ацетон, в котором инкубировались сетки, в контейнер для отходов. Осторожно добавьте 15 мл свежего ацетона в чашку Петри с помощью чистой стеклянной серологической пипетки. Инкубировать 30 мин.
  3. Повторите эти шаги стирки в общей сложности для 3 промывок ацетоном.

9. Удаление остатков ацетона изопропанолом

  1. После 3 промывок ацетоном удалите ацетон и замените его 15 мл изопропанола с помощью чистой стеклянной серологической пипетки. Инкубировать 20 мин.
  2. Повторите 3 раза, чтобы в общей сложности выполнить 4 смывания изопропанолом. Осторожно удалите сетки от изопропанола и высушите на воздухе на чистом покровном стекле с помощью пинцета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный изопропанол может затруднить освобождение сетки от пинцета. Установление контакта между сеткой и чистым покровным стеклом перед освобождением сетки от пинцета может облегчить эту проблему.
  3. Испарите остатки органики, перенеся покровное стекло с решетками с графеновым покрытием на конфорку, установленную на 100 °C в течение 10 минут. Остудите до комнатной температуры и храните под вакуумом до использования.

10. УФ/озоновая обработка сеток с графеновым покрытием

  1. Используя пинцет обратного действия, аккуратно поместите решетки в чистую зону освещения УФ/озонового очистителя стороной с графеновым покрытием вверх.
  2. Закройте зону освещения и включите машину. Поверните диск времени на назначенное время обработки, чтобы начать обработку решеток ультрафиолетовым излучением / озоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность обработки является настраиваемым параметром, при этом избыточная обработка может повредить сетку. Han et al.30 рекомендуют 10-минутную обработку ультрафиолетом/озоном, и мы также обнаружили, что 10-минутной процедуры достаточно. Обратитесь к шагу 12 для получения рекомендаций по настройке этого времени лечения.
  3. Приступайте непосредственно к погружению криоЭМ-образца на обработанные решетки, выполнив шаги погружения, как описано в Koh et al.37.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Атмосферные углеводороды могут накапливаться на поверхности сетки после обработки УФ/озоном и увеличивать гидрофобность поверхности графена38,39. Чтобы избежать этого, немедленно погрузите решетки, обработанные ультрафиолетом/озоном. Может быть полезно обрабатывать сетки УФ/озоном партиями, например, обработка УФ/озоном шести сеток и немедленное погружение этих шести сеток, затем обработка УФ/озоном второй партии сеток, а затем погружение второй партии.

11. Получение дифракционного изображения

  1. Убедитесь, что микроскоп хорошо настроен при установленном параллельном освещении, и установите конечную расфокусировку на -0,2 мкм.
  2. Вставьте люминесцентный экран, и луч полностью остановится. Войдите в дифракционный режим, чтобы четко визуализировать дифракционные пятна.
  3. Получение изображения с помощью ПЗС-камеры и его оценка с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее легко наблюдаемыми и идентифицируемыми дифракционными пятнами, генерируемыми монослоем графена, являются 6 пятен, соответствующих пространственной частоте 2,13 Å. Используйте измерительный инструмент, чтобы оценить расстояние от центра дифрагированного пучка до одного из этих дифракционных пятен в обратных единицах. Примечательно, что 2,13 Х Equation 1 0,47 Е-1.

12. Оценка гидрофильности сетки

  1. Подготовьте установку для создания образов. Найдите подставку для телефона, настольную поверхность для визуализации, телефон с камерой, стеклянную защитную пленку и парафиновую пленку. Изображения, показанные здесь, были получены с помощью подставки для телефона и настольной поверхности изображения, которые были напечатаны на 3D-принтере с использованием предоставленных файлов .stl, что привело к более легко воспроизводимым и количественно измеримым измерениям угла контакта (дополнительный рисунок 1A).
  2. Положите стеклянный покровный листок на плоскую поверхность, затем отрежьте квадрат парафиновой пленки размером 1 см на 1 см и поместите его на стеклянный покровный листок. Поместите телефон на подставку для телефона, расположив телефон так, чтобы камера находилась в плоскости со стеклянной защитной накладкой. Закрепите телефон в этом положении с помощью резинок (дополнительный рисунок 1B). Сделайте образец фотографии, чтобы убедиться, что камера выровнена по поверхности изображения.
  3. Непосредственно после обработки УФ/озоном решеток с графеновым покрытием поместите одинарную сетку на квадрат парафиновой пленки на стеклянном покровном стекле. Убедитесь, что графеновая сторона обращена вверх. Добавьте каплю воды объемом 2 мкл на центр поверхности решетки с помощью пипетки и сразу же сделайте снимок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг после: i) желаемых интервалов обработки УФ/озоном, чтобы определить достаточную продолжительность обработки; или ii) желаемые интервалы времени после обработки УФ-излучением/озоном, чтобы измерить, как долго после обработки поверхность сетки сохраняет свои гидрофильные свойства.
  4. Рассчитайте углы контакта по фотографиям, импортировав их в ImageJ43 и используя плагин контактных углов.

13. Одночастичный анализ комплексного набора данных dCas9

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся обработка изображений, описанная в этом протоколе, была выполнена с использованием cryoSPARC версии 4.2.1.

  1. Предварительная обработка фильмов с помощью заданий Patch Motion Correction и Patch CTF Estimation. Выполните выбор частиц с помощью задания Выбор BLOB-объектов, используя сферический BLOB-объект диаметром от 115 Å до 135 Å.
  2. Извлечение частиц с помощью задания Извлечение из микрофотографий с использованием нормализованного коэффициента корреляции (NCC) и пороговых значений мощности, что дает примерно 200-300 частиц на микрофотографию. Обратите внимание, что соответствующие пороговые значения и результирующее количество частиц могут отличаться, и пользователи должны проверять качество пленки на различных микрофотографиях, чтобы определить подходящие условия.
  3. Выполните многоклассовые начальные реконструкции с помощью задания реконструкции Ab-initio, для которого требуется три класса. Два из трех классов, вероятно, будут содержать частицы, не относящиеся к Cas9, включая поверхностные загрязнители. Выберите класс, похожий на dCas9, для дальнейшей обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейшего уточнения стека частиц могут быть применены дополнительные раунды мультиклассовой реконструкции Ab-initio или гетерогенного измельчения.
  4. Выполните 3D-уточнение с помощью задания Неравномерное уточнение, выбрав параметры по умолчанию. Оцените разрешение реконструкции с помощью заданий Validation (FSC) и ThreeDFSC, используя карты и маску из окончательного 3D-уточнения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешное изготовление криоЭМ сеток с графеновым покрытием с использованием оборудования (рис. 1) и протокола (рис. 2), описанных здесь, приведет к появлению монослоя графена, покрывающего отверстия фольги, что может быть подтверждено его характерной дифракционной картиной. Чтобы способствовать адсорбции белка на поверхности графена, можно использовать УФ/озоновую обработку, чтобы сделать поверхность гидрофильной путем установки кислородсодержащих функциональных групп. Однако углеводородные загрязнители в воздухе могут адсорбироваться на поверхности графена уже через 5 мин после обработки УФ/озоном и противодействовать этому эффекту 38,39. Важно отметить, что на качество образца могут влиять как продолжительность УФ/озоновой обработки, так и время, прошедшее между обработкой и погружением. Мы демонстрируем эти эффекты с помощью простого метода оценки гидрофильных характеристик сетки с покрытием на основе угла контакта с поверхностью (рис. 3; см. шаг 12).

Для демонстрации использования графеновых носителей в криоЭМ одиночных частиц мы применили каталитически неактивную РНК-управляемую ДНК-эндонуклеазу S. pyogenes Cas9 (H10A; С80С; С574С; H840A)40 в комплексе с sgRNA и ДНК-мишенью на сетках, покрытых графеном, собрал набор данных криоЭМ из этих сеток и выполнил анализ одиночных частиц7. Сетки с графеновым покрытием постоянно содержали ~300 частиц на микрофотографию при увеличении 0,654 Å/пикс с использованием микроскопа с энергией 300 кэВ, оснащенного детектором прямых электронов K3 (рис. 4A-E). В результате 8-часового сеанса сбора данных с углом наклона сцены +18° было получено 2 963 видеоролика и 324 439 частиц в окончательном курируемом стеке. Используя эти частицы, мы создали 3D-реконструкцию, которая после уточнения дала карту плотности с расчетным разрешением 2,7 Å и адекватной угловой выборкой, чтобы избежать анизотропных артефактов (рис. 5). Атомарная модель (PDB 6o0z)41 была пристыкована к этой карте и уточнена с помощью ISOLDE42. Остатки R63-L82 этой подогнанной атомной модели отображаются с уточненной картой плотности криоЭМ, подчеркивающей разрешенную плотность боковой цепи (рис. 5B). При сравнении одного и того же образца и концентрации (250 нг/мкл), примененной к идентичным сеткам, в которых отсутствовал графен, частиц не наблюдалось (рис. 4F, G). Это наблюдение подчеркивает эффективность графеновой основы для визуализации частиц из образцов с низкой концентрацией.

Figure 1
Рисунок 1: Необходимое оборудование. Лабораторное оборудование и инструменты, необходимые для изготовления графеновых сеток с использованием протокола, подробно описанного в этой статье. Товары и их количество отображаются и маркируются соответствующим образом. К необходимым реагентам, которые не показаны, относятся: графен CVD, метилметакрилат EL-6 (MMA), персульфат аммония (APS), ацетон, изопропанол, этанол, молекулярная вода. Необходимые приборы, которые не показаны, включают: устройство для нанесения покрытий, тильный разрядник, нагревательную плиту, вакуумный эксикатор и термометр. Все необходимые элементы подробно описаны в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема процесса изготовления графеновой сетки. Графен покрывается тонким слоем метилметакрилата EL-6 (MMA) с помощью установки для нанесения отжима (шаг 2). Графен на противоположной стороне медной фольги удаляется с помощью плазменного травления (шаг 3). Затем персульфат аммония (APS) используется для травления меди (шаги 4-5). На поверхность сетки наносится ММА-графеновая пленка (шаг 6-7). Наконец, ММА растворяется во время серии промывок органическими растворителями (шаги 8-9). Шаги, указанные выше стрелками, соответствуют пронумерованным шагам, описанным в разделе протоколов. Этот метод был адаптирован из Han et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка гидрофильности поверхности сетки в зависимости от продолжительности УФ/озоновой обработки и времени, прошедшего после обработки. (A) Измеренные углы контакта, построенные в зависимости от продолжительности обработки. Уменьшение углов контакта согласуется с повышенной гидрофильностью (необработанная сетка: 78°; 20 мин: 37°). Углы контакта измерены с помощью ImageJ43. (B) Измеренные углы контакта, отображаемые в зависимости от времени после обработки (0 мин: 45°; 60 мин: 74°). Сетка, измеренная во временном интервале после обработки, подвергалась обработке ультрафиолетом/озоном в течение 12 минут, как указано звездочкой. Каждое измерение после обработки выполнялось на одной и той же сетке, при этом образец удалялся путем отвода влаги между измерениями. Ожидается, что конкретные измеряемые углы контакта будут варьироваться в зависимости от лабораторных условий окружающей среды, и мы рекомендуем пользователям проводить аналогичные эксперименты в своих лабораториях, чтобы определить подходящие условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные изображения сетки с графеновым покрытием и контрольной сетки без покрытия. (А-С) Репрезентативные атласные, квадратные и фольгированные изображения дырчатых углеродных решеток с графеновым покрытием, полученные на микроскопе с напряжением 300 кэВ, оснащенном детектором прямых электронов К3. (D) КриоЭМ-микрофотография S. pyogenes dCas9 в комплексе с sgРНК и целевой ДНК (комплекс в концентрации 250 нг/мкл) на дырчатой углеродной сетке, покрытой графеном. (E) Дифракционное изображение из сетки, представленной на панелях (A-D). Оранжевая стрелка указывает на положение, соответствующее пространственной частоте 2,13 Å. Образец, идентичный тому, что показан на панели (D), был применен для (F) обработки УФ-озоном и (G) дырчатых углеродных решеток с тлеющим разрядом без графена. Представленные криоЭМ-микрофотографии являются репрезентативными для каждой сетки и не показывают частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: КриоЭМ-реконструкция комплекса Cas9 из сеток с графеновым покрытием. (A) Карта плотности КриоЭМ из 3D-реконструкции S. pyogenes dCas9 в комплексе с sgRNA и ДНК-мишенью. (B) Остатки R63-L82 из подогнанной модели изображены в пределах полупрозрачной криоЭМ-плотности, с подмножеством видимых боковых цепей, помеченных мечением. (C) Кривые оболочечной корреляции Фурье (FSC) для незамаскированных, слабо и плотно замаскированных отображений. (D) Гистограмма и направленный график FSC на основе метода 3DFSC23. Дополнительную информацию см. на дополнительном рисунке 2 и шаге 13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Стойка для визуализации с углом контакта. (A) Напечатанная на 3D-принтере подставка для камеры и настольное крепление для обработки изображений для фиксации камеры в положении, которое выравнивает камеру в плоскости с защитным стеклом. (Б) Сетка помещается на покровное стекло поверх квадратного куска парафиновой пленки размером 1 см х 1 см. Изображенное крепление для визуализации было напечатано на 3D-принтере с использованием предоставленных файлов .stl (Дополнительный файл кодирования 1 и Дополнительный файл кодирования 2) и может быть легко изменено для размещения большинства устройств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Рабочий процесс обработки изображений. Рабочий процесс обработки для комплекса dCas9. Указываются имена заданий, сведения о задании и параметры, отличные от параметров по умолчанию (курсивом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 1: Стереолитографические CAD-файлы в формате STL предназначены для облегчения 3D-печати подставки для фотоаппарата (camera_stand_v1.stl). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл кодирования 2: Стереолитографические CAD-файлы в формате STL предоставляются для облегчения 3D-печати настольного крепления для визуализации (slide_mount_v1.stl) и , пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подготовка образцов для криоЭМ сопряжена с множеством технических проблем, при этом большинство рабочих процессов требуют от исследователей ручных манипуляций с хрупкими сетками с особой осторожностью, чтобы не повредить их. Кроме того, восприимчивость любого образца к витрификации непредсказуема; Частицы часто взаимодействуют с границей раздела воздух-вода или с твердой опорной фольгой, накладывающейся на сетки, что может привести к тому, что частицы примут предпочтительную ориентацию или не попадут в отверстия визуализации, если не применяются очень высокие концентрации белка24. Наложение дырчатых криоЭМ-сеток на непрерывный монослой графена показало огромные перспективы в улучшении распределения частиц на микрофотографиях, увеличении числа частиц при низких концентрациях и уменьшении предпочтительных ориентаций, обусловленных взаимодействиями на границе раздела воздух-вода-30.

Ограничением существующих протоколов нанесения графеновых покрытий для криоЭМ-решеток является обширное ручное манипулирование, необходимое для процесса нанесения покрытия, что может поставить под угрозу качество и увеличить вариативность от сетки к сетке. В данной работе мы описываем незначительные модификации существующего протокола покрытия криоЭМ сеток монослоем графена30.

Важнейшие этапы в рамках этого протокола включают покрытие графена CVD MMA, растворение графеновой медной подложки CVD в APS и нанесение графена на криоEM-сетки. Мы модифицировали первоначальный протокол, чтобы свести к минимуму ручные манипуляции с сетками с покрытием, заменяя растворители в одной чашке Петри, вместо того, чтобы по отдельности обрабатывать и переносить сетки в новый контейнер для растворителей на каждом этапе промывки, тем самым стремясь увеличить выход неповрежденных, высококачественных сеток с графеновым покрытием. Несмотря на то, что мы стремились свести к минимуму манипуляции с сетками с графеновым покрытием, мы признаем, что ручное нанесение отдельных графеновых квадратов на крио-ЭМ-сетки по своей сути является сложной задачей, и что ожидается некоторая изменчивость от сетки к сетке.

Сетки с графеновым покрытием обычно требуют обработки УФ-излучением/озоном, чтобы сделать поверхность гидрофильной для нанесения образца. Продолжительность обработки УФ-озоном, а также время, прошедшее после обработки и до погружения, могут повлиять на гидрофильность сетки и, в конечном итоге, на качество образца. В дополнение к протоколу изготовления сетки мы описываем методику оценки гидрофильности сетки после обработки УФ/озоном. В процедуре в качестве показателя гидрофильного характера сетки с покрытием20,44 используется угол контакта поверхности нанесенного образца. Предоставляются конструкции для недорогой 3D-печати индивидуального крепления для изображения сетки, которое использует простую камеру сотового телефона для оценки угла контакта с поверхностью.

Наконец, описаны результаты, полученные с использованием этого протокола для определения криоЭМ-структуры 2,7 Å каталитически неактивной РНК-управляемой ДНК-эндонуклеазы S. pyogenes Cas9 в комплексе с sgРНК и ДНК-мишенью40. В отсутствие графена частицы в отверстиях фольги не наблюдались при использовании комплексных концентраций (250 нг/мкл). В отличие от них, сетки, покрытые графеном, содержали частицы с высокой плотностью, что позволяло легко реконструировать карту высокого разрешения по 2961 микрофотографии. Взятые вместе, эти данные подчеркивают ценность применения монослоев графена к криоЭМ-сеткам для анализа одиночных частиц.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов, которые можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Образцы были подготовлены и визуализированы на CryoEM Facility в MIT.nano на микроскопах, приобретенных благодаря Фонду Арнольда и Мейбл Бекман. Устройства для визуализации контактного угла были напечатаны в MIT Metropolis Maker Space. Мы благодарим лаборатории Nieng Yan и Yimo Han, а также сотрудников MIT.nano за их поддержку на протяжении всего процесса внедрения этого метода. В частности, мы выражаем нашу благодарность докторам Гуаньхуэй Гао и Саре Стерлинг за их содержательные дискуссии и отзывы. Эта работа была поддержана грантами NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 и грантом NSF-CAREER 2046778. Исследования в лаборатории Дэвиса поддерживаются Фондом Альфреда. Слоуна, Фондом Джеймса Х. Ферри, J-Clinic Массачусетского технологического института и семьей Уайтхед.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM--the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).

Tags

Биохимия выпуск 201
Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, … More

Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter