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Biochemistry

Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66023
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

La aplicación de capas de soporte a rejillas de microscopía electrónica criogénica (crioEM) puede aumentar la densidad de partículas, limitar las interacciones con la interfaz aire-agua, reducir el movimiento inducido por el haz y mejorar la distribución de las orientaciones de las partículas. Este artículo describe un protocolo robusto para recubrir rejillas crioEM con una monocapa de grafeno para mejorar la preparación de muestras criogénicas.

Abstract

En la microscopía electrónica criogénica (cryoEM), las macromoléculas purificadas se aplican a una rejilla que lleva una lámina de carbono agujereada; A continuación, las moléculas se secan para eliminar el exceso de líquido y se congelan rápidamente en una capa de hielo vítreo de aproximadamente 20-100 nm de espesor, suspendida en agujeros de lámina de aproximadamente 1 μm de ancho. La muestra resultante se obtiene mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica y, después del procesamiento de la imagen con un software adecuado, se pueden determinar estructuras de resolución casi atómica. A pesar de la adopción generalizada de la crioEM, la preparación de muestras sigue siendo un grave cuello de botella en los flujos de trabajo de la crioEM, ya que los usuarios a menudo se enfrentan a problemas relacionados con el mal comportamiento de las muestras en el hielo vítreo suspendido. Recientemente, se han desarrollado métodos para modificar las rejillas crioEM con una sola capa continua de grafeno, que actúa como una superficie de soporte que a menudo aumenta la densidad de partículas en el área de la imagen y puede reducir las interacciones entre las partículas y la interfaz aire-agua. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para la aplicación de grafeno a las rejillas crioEM y para evaluar rápidamente la hidrofilicidad relativa de las rejillas resultantes. Además, describimos un método basado en EM para confirmar la presencia de grafeno mediante la visualización de su patrón de difracción característico. Finalmente, demostramos la utilidad de estos soportes de grafeno mediante la reconstrucción rápida de un mapa de densidad de resolución de 2,7 Å de un complejo Cas9 utilizando una muestra pura a una concentración relativamente baja.

Introduction

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) se ha convertido en un método ampliamente utilizado para visualizarmacromoléculas biológicas. Impulsado por los avances en la detección directa de electrones 2,3,4, la adquisición de datos5 y los algoritmos de procesamiento de imágenes 6,7,8,9,10, cryoEM es ahora capaz de producir estructuras 3D de resolución casi atómica de un número cada vez mayor de macromoléculas11. Además, al aprovechar la naturaleza de una sola molécula del enfoque, los usuarios pueden determinar múltiples estructuras a partir de una sola muestra 12,13,14,15, lo que destaca la promesa de utilizar los datos generados para comprender conjuntos estructurales heterogéneos 16,17. A pesar de estos avances, persisten los cuellos de botella en la preparación de la rejilla de muestras criogénicas.

Para la caracterización estructural por crioEM, las muestras biológicas deben estar bien dispersas en solución acuosa y luego deben ser congeladas rápidamente a través de un proceso llamado vitrificación18,19. El objetivo es capturar partículas en una capa uniformemente delgada de hielo vitrificado suspendida a través de agujeros espaciados regularmente que generalmente se cortan en una capa de carbono amorfo. Esta lámina de carbono amorfa estampada está soportada por una rejilla TEM que soporta una malla de barras de soporte de cobre u oro. En los flujos de trabajo estándar, las rejillas se vuelven hidrófilas mediante un tratamiento de plasma de descarga incandescente antes de la aplicación de la muestra. El exceso de líquido se seca con papel de filtro, lo que permite que la solución proteica forme una fina película líquida a través de los orificios que se puede vitrificar fácilmente durante la congelación por inmersión. Los desafíos comunes incluyen la localización de partículas en la interfaz aire-agua (AWI) y la posterior desnaturalización20,21,22 o la adopción de orientaciones preferidas 23,24,25, la adherencia de las partículas a la lámina de carbono en lugar de migrar hacia los agujeros, y la agrupación y agregación de las partículas dentro de los agujeros 26. El espesor no uniforme del hielo es otra preocupación; El hielo grueso puede dar lugar a niveles más altos de ruido de fondo en las micrografías debido al aumento de la dispersión de electrones, mientras que el hielo extremadamente delgado puede excluir partículas más grandes27.

Para abordar estos desafíos, se ha utilizado una variedad de películas de soporte delgadas para recubrir las superficies de la rejilla, lo que permite que las partículas descansen sobre estos soportes e, idealmente, eviten las interacciones con la interfaz aire-agua. Los soportes de grafeno han demostrado ser muy prometedores, en parte debido a su alta resistencia mecánica junto con su mínima sección transversal de dispersión, que reduce la señal de fondo añadida por la capade soporte 28. Además de su mínima contribución al ruido de fondo, el grafeno también exhibe una notable conductividad eléctrica y térmica29. Se ha demostrado que las rejillas recubiertas de grafeno y óxido de grafeno producen una mayor densidad de partículas, una distribución más uniforme de las partículas30 y una localización reducida en el AWI22. Además, el grafeno proporciona una superficie de soporte que se puede modificar aún más para: 1) ajustar las propiedades fisicoquímicas de la superficie de la rejilla a través de la funcionalización 31,32,33; o 2) acoplar agentes enlazantes que faciliten la purificación por afinidad de proteínas de interés 34,35,36.

En este artículo, hemos modificado un procedimiento existente para recubrir rejillas crioEM con una sola capa uniforme de grafeno30. Las modificaciones tienen como objetivo minimizar el manejo de la red en todo el protocolo, con el objetivo de aumentar el rendimiento y la reproducibilidad. Además, discutimos nuestro enfoque para evaluar la eficacia de varios tratamientos UV/ozono en la representación de rejillas hidrófilas antes de la inmersión. Este paso en la preparación de muestras crioEM utilizando rejillas recubiertas de grafeno es fundamental, y hemos encontrado que nuestro método sencillo para cuantificar la hidrofilicidad relativa de las rejillas resultantes es útil. Utilizando este protocolo, demostramos la utilidad de emplear rejillas recubiertas de grafeno para la determinación de la estructura mediante la generación de una reconstrucción 3D de alta resolución de S. pyogenes Cas9 catalíticamente inactivo en complejo con ARN guía y ADN diana.

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Protocol

1. Preparación del grafeno CVD

  1. Prepare la solución de grabado de grafeno como se describe a continuación.
    1. Disuelva 4,6 g de persulfato de amonio (APS) en 20 ml de agua de grado molecular en un vaso de precipitados de 50 ml para obtener una solución de 1 M y cúbralo con papel de aluminio. Deje que APS se disuelva por completo mientras continúa con el paso 1.2.
  2. Prepare una sección de grafeno CVD para el recubrimiento de metacrilato de metilo (MMA). Corta con cuidado una sección cuadrada de grafeno CVD. Transfiera el cuadrado a un cubreobjetos (50 mm x 24 mm) dentro de una placa de Petri limpia y cúbralo durante el transporte a la máquina de recubrimiento giratorio.
    NOTA: Un cuadrado de 18 mm x 18 mm debe producir 25-36 cuadrículas recubiertas de grafeno.

2. Recubrimiento de grafeno CVD con MMA

  1. Ajuste la configuración del recubrimiento giratorio a un centrifugado de alta velocidad de 60 s a 2.500 rpm. Coloque con cuidado el grafeno CVD en el mandril del tamaño adecuado.
    NOTA: Idealmente, el grafeno CVD se extenderá 1-2 mm sobre el borde del mandril seleccionado para evitar la aspiración de MMA en el sistema de vacío.
  2. Presione el botón Take/Absorb para activar la bomba de vacío y fijar el grafeno CVD al mandril. Aplique MMA en el centro del cuadrado de grafeno CVD, cierre la tapa y presione el botón Inicio/Parada inmediatamente. Para un cuadrado de 18 mm x 18 mm de grafeno CVD, 40 μL de MMA son suficientes.
  3. Una vez que se haya detenido el centrifugado, desconecte la bomba de vacío y recupere con cuidado el grafeno CVD recubierto de MMA con unas pinzas. Invierta el grafeno CVD de modo que el lado recubierto de MMA quede hacia abajo y vuelva a colocarlo en el cubreobjetos de vidrio.

3. Grabado con plasma de la parte posterior de grafeno

  1. Transfiera el grafeno CVD en el cubreobjetos al descargador de incandescencia y descargue la luminiscencia durante 30 s a 25 mA con unas pinzas de punta plana.
  2. Regrese el grafeno CVD en el cubreobjetos a la placa de Petri y cúbralo durante el transporte al área de grabado de cobre. El recubrimiento MMA protegerá la capa superior de grafeno del grabado por plasma.

4. Corte de cuadrados de grafeno CVD recubiertos de MMA del tamaño de una cuadrícula

  1. Use dos pares de pinzas para sostener el cuadrado de grafeno CVD. Tome nota de la orientación del cuadrado de grafeno CVD, mantenga el lado MMA hacia arriba mientras está sujeto a las pinzas (CRITICAL).
  2. Corta el grafeno CVD en cuadrados de aproximadamente 3 mm x 3 mm. Use dos juegos de pinzas de acción inversa para este paso para sujetar el cuadrado de grafeno CVD con el lado derecho hacia arriba y anclarlo en su posición, y también para sostener el borde de un cuadrado de 3 mm x 3 mm después de cortarlo del resto del cuadrado.

5. Disolución de sustrato de cobre de grafeno CVD recubierto de MMA

  1. Flote con cuidado cada cuadrado de 3 mm x 3 mm en la solución APS. Haga contacto con la superficie de la solución APS antes de soltar cada cuadrado. Incline el vaso de precipitados de tal manera que cada cuadrado pueda colocarse en la solución en un ángulo poco profundo; Esto asegura que el cuadrado no se hunda.
  2. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio e incube durante la noche a 25 °C.

6. Eliminación de películas de MMA/grafeno de APS

  1. Utilice un cubreobjetos de vidrio con unas dimensiones de 12 mm x 50 mm y extraiga los cuadrados de MMA/grafeno del APS sumergiendo suavemente el cubreobjetos verticalmente en el APS y luego moviendo el cubreobjetos lateralmente de modo que haga codo con un cuadrado flotante de MMA/grafeno.
  2. Retire con cuidado el cubreobjetos y asegúrese de que el cuadrado se adhiera completamente al costado del cubreobjetos al retirarlo.
  3. Transfiera los cuadrados de MMA/grafeno a un vaso de precipitados limpio de 50 ml lleno de agua de grado molecular durante 20 minutos. Sumerja suavemente el cubreobjetos con un cuadrado de MMA/grafeno unido al agua verticalmente y asegúrese de que el cubreobjetos se desprenda del cubreobjetos al interactuar con la superficie del agua. Repita para todos los cuadrados de MMA/grafeno.

7. Adherir grafeno a las rejillas

  1. Con unas pinzas de acción negativa, sumerja suavemente una rejilla verticalmente en el agua con el lado de carbono frente a un cuadrado flotante de MMA/grafeno. Una vez en contacto con el cuadrado, retire con cuidado la rejilla y asegúrese de que el cuadrado se adhiera completamente al lado de carbono de la rejilla al retirarlo. Minimice el movimiento lateral de la rejilla cuando se sumerja en agua para evitar dañar los cuadrados de la rejilla (CRÍTICO).
  2. Coloque las rejillas en un cubreobjetos limpio con MMA/grafeno hacia arriba y séquelas al aire durante 1 a 2 minutos. Transfiera las rejillas recubiertas de grafeno/MMA a una placa calefactora ajustada a 130 °C con unas pinzas de punta plana.
  3. Cubra con la parte superior de una placa de Petri de vidrio e incube durante 20 min. Retira del fuego y deja enfriar a temperatura ambiente durante 1 a 2 min.
    PRECAUCIÓN: Tenga cuidado ya que la parte superior de la placa de Petri estará extremadamente caliente.

8. Disolución de MMA con acetona

  1. Transfiera todo el cubreobjetos a una placa de Petri llena de 15 ml de acetona. Incubar durante 30 min.
  2. Utilizando una pipeta serológica de vidrio limpio, transfiera la acetona, en la que se incubaron las rejillas, a un contenedor de residuos. Agregue con cuidado 15 ml de acetona fresca a la placa de Petri con una pipeta serológica de vidrio limpio. Incubar durante 30 min.
  3. Repita estos pasos de lavado para un total de 3 lavados con acetona.

9. Eliminación de acetona residual con isopropanol

  1. Después de 3 lavados con acetona, retire la acetona y reemplácela con 15 ml de isopropanol con una pipeta serológica de vidrio limpio. Incubar durante 20 min.
  2. Repita 3 veces para un total de 4 lavados con isopropanol. Retire con cuidado las rejillas del isopropanol y séquelas al aire en un cubreobjetos limpio con unas pinzas.
    NOTA: El isopropanol residual puede dificultar la liberación de las rejillas de las pinzas. Hacer contacto entre la rejilla y el cubreobjetos limpio antes de soltar la rejilla de las pinzas puede aliviar este problema.
  3. Evapore los residuos orgánicos transfiriendo el cubreobjetos con rejillas recubiertas de grafeno a una placa calefactora ajustada a 100 °C durante 10 min. Deje enfriar a temperatura ambiente y guárdelo al vacío hasta su uso.

10. Tratamiento UV/ozono de rejillas recubiertas de grafeno

  1. Con unas pinzas de acción inversa, coloque suavemente las rejillas en un área de iluminación limpia de un limpiador UV/ozono con el lado recubierto de grafeno hacia arriba.
  2. Deslice el área de iluminación para cerrarla y encienda la máquina. Gire el dial de tiempo al tiempo de tratamiento designado para comenzar el tratamiento UV/ozono de las rejillas.
    NOTA: La duración del tratamiento es un parámetro ajustable, y el exceso de tratamiento tiene el potencial de dañar la red. Han et al.30 recomiendan 10 min de tratamiento UV/ozono, y también hemos encontrado que un tratamiento de 10 min es suficiente. Consulte el paso 12 para obtener orientación sobre cómo ajustar este tiempo de tratamiento.
  3. Proceda directamente a sumergir una muestra de crioEM en las rejillas tratadas siguiendo los pasos de inmersión descritos en Koh et al.37.
    NOTA: Los hidrocarburos atmosféricos pueden acumularse en la superficie de la rejilla después del tratamiento UV/ozono y aumentar la hidrofobicidad de la superficie del grafeno38,39. Para evitar esto, sumerja inmediatamente las rejillas tratadas con UV/ozono. Puede ser ventajoso tratar las rejillas UV/ozono en lotes, por ejemplo, tratar UV/ozono seis rejillas e inmediatamente sumergir esas seis rejillas, luego tratar UV/ozono un segundo lote de rejillas, seguido de sumergir el segundo lote.

11. Captura de una imagen de difracción

  1. Asegúrese de que el microscopio esté bien sintonizado con la iluminación paralela establecida y ajuste el desenfoque final a -0,2 μm.
  2. Inserte la pantalla fluorescente y el haz se detendrá por completo. Ingrese al modo de difracción para visualizar claramente los puntos de difracción.
  3. Adquiera una imagen con una cámara CCD y evalúela con un software de análisis de imágenes.
    NOTA: Los puntos de difracción más fácilmente observables e identificables generados por una monocapa de grafeno son 6 puntos correspondientes a una frecuencia espacial de 2,13 Å. Utilice una herramienta de medición para estimar la distancia desde el centro del haz difractado hasta uno de estos puntos de difracción en unidades recíprocas. En particular, 2,13 Å Equation 1 0,47 Å-1.

12. Evaluación de la hidrofilicidad de la red

  1. Prepare la configuración de imágenes. Localice un soporte para teléfono, una superficie de imagen de mesa, un teléfono con cámara, una funda de vidrio y una película de parafina. Las imágenes que se muestran aquí se obtuvieron utilizando un soporte de teléfono y una superficie de imagen de mesa que se imprimieron en 3D utilizando los archivos .stl proporcionados, lo que resultó en mediciones de ángulo de contacto más fácilmente reproducibles y cuantificables (Figura suplementaria 1A).
  2. Coloque un cubreobjetos de vidrio sobre la superficie plana, luego corte un cuadrado de 1 cm por 1 cm de película de parafina y colóquelo sobre el cubreobjetos de vidrio. Coloque el teléfono en el soporte del teléfono, orientando el teléfono de modo que la cámara quede en el plano con el cubreobjetos de vidrio. Asegure el teléfono en esta posición con bandas elásticas (Figura complementaria 1B). Tome una foto de muestra para verificar que la cámara esté alineada con la superficie de la imagen.
  3. Inmediatamente después del tratamiento UV/ozono de las rejillas recubiertas de grafeno, coloque una sola rejilla en el cuadrado de la película de parafina en el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el lado del grafeno esté orientado hacia arriba. Agregue una gota de agua de 2 μL en el centro de la superficie de la rejilla con una pipeta e inmediatamente tome una foto.
    NOTA: Repita este paso después de: i) los intervalos deseados de tratamiento UV/ozono para determinar una duración suficiente del tratamiento; o ii) intervalos de tiempo deseados después del tratamiento UV/ozono para medir cuánto tiempo después del tratamiento la superficie de la rejilla mantiene su carácter hidrofílico.
  4. Calcule los ángulos de contacto a partir de fotos importándolas a ImageJ43 y utilizando el complemento de ángulo de contacto.

13. Análisis de una sola partícula del conjunto de datos complejos dCas9

NOTA: Todo el procesamiento de imágenes descrito en este protocolo se realizó utilizando cryoSPARC versión 4.2.1.

  1. Preprocese películas mediante los trabajos Patch Motion Correction y Patch CTF Estimation. Realice la selección de partículas mediante el trabajo Selector de blobs, utilizando una mancha esférica cuyo diámetro oscila entre 115 Å y 135 Å.
  2. Extraiga partículas mediante el trabajo Extraer de micrografías, utilizando el coeficiente de correlación normalizado (NCC) y umbrales de potencia, lo que da como resultado aproximadamente 200-300 partículas por micrografía. Tenga en cuenta que los umbrales apropiados y el recuento de partículas resultante pueden variar, y los usuarios deben inspeccionar la calidad de la selección en una variedad de micrografías para identificar las condiciones adecuadas.
  3. Realice reconstrucciones iniciales multiclase utilizando el trabajo de reconstrucción Ab-initio, que requiere tres clases. Es probable que dos de las tres clases contengan partículas que no sean Cas9, incluidos los contaminantes de la superficie. Seleccione la clase similar a dCas9 para su posterior procesamiento.
    NOTA: Se pueden aplicar rondas adicionales de reconstrucción Ab-initio multiclase o refinamiento heterogéneo para refinar aún más la pila de partículas.
  4. Realice el refinamiento 3D mediante el trabajo Refinamiento no uniforme seleccionando los parámetros predeterminados. Estime la resolución de la reconstrucción utilizando los trabajos de Validación (FSC) y ThreeDFSC, empleando los mapas y la máscara del refinamiento 3D final.

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Representative Results

La fabricación exitosa de rejillas crioEM recubiertas de grafeno utilizando el equipo (Figura 1) y el protocolo (Figura 2) descritos aquí dará como resultado una monocapa de grafeno que cubrirá los orificios de la lámina que puede confirmarse por su patrón de difracción característico. Para promover la adsorción de proteínas a la superficie del grafeno, se puede utilizar el tratamiento UV/ozono para hacer que la superficie sea hidrófila mediante la instalación de grupos funcionales que contienen oxígeno. Sin embargo, los contaminantes de hidrocarburos en el aire pueden adsorberse en la superficie del grafeno tan pronto como 5 minutos después del tratamiento UV/ozono y contrarrestar este efecto38,39. Es importante destacar que tanto la duración del tratamiento UV/ozono como el tiempo transcurrido entre el tratamiento y la inmersión pueden afectar a la calidad de la muestra. Demostramos estos efectos utilizando un método simple para evaluar el carácter hidrofílico de la rejilla revestida basado en el ángulo de contacto de la superficie (Figura 3; ver paso 12).

Para demostrar el uso de soportes de grafeno en crioEM de una sola partícula, aplicamos una endonucleasa de ADN guiada por ARN catalíticamente inactiva S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 en complejo con sgRNA y ADN diana a rejillas recubiertas de grafeno, recopiló un conjunto de datos de crioEM de estas rejillas y realizó un análisis de partícula única7. Las rejillas recubiertas de grafeno contenían consistentemente ~300 partículas por micrografía con un aumento de 0,654 Å/pix utilizando un microscopio de 300 keV equipado con un detector de electrones directo K3 (Figura 4A-E). Una sesión de recopilación de datos de 8 horas con una inclinación del escenario de +18° produjo 2.963 películas y 324.439 partículas en una pila final seleccionada. Utilizando estas partículas, generamos una reconstrucción 3D que, tras el refinamiento, arrojó un mapa de densidad con una resolución estimada de 2,7 Å y un muestreo angular adecuado para evitar artefactos anisotrópicos (Figura 5). Un modelo atómico (PDB 6o0z)41 fue acoplado a este mapa, y refinado usando ISOLDE42. Los residuos R63-L82 de este modelo atómico ajustado se muestran con el mapa de densidad crioEM refinado, destacando la densidad de la cadena lateral resuelta (Figura 5B). Al comparar la misma muestra y concentración (250 ng/μL) aplicada a rejillas idénticas que carecían de grafeno, no se observaron partículas (Figura 4F, G). Esta observación pone de manifiesto la eficacia del soporte de grafeno para permitir la visualización de partículas de muestras de baja concentración.

Figure 1
Figura 1: Equipo necesario. Equipos y herramientas de laboratorio necesarios para la fabricación de rejillas de grafeno utilizando el protocolo detallado en este artículo. Los artículos y su cantidad se muestran y etiquetan en consecuencia. Los reactivos necesarios que no se muestran incluyen: grafeno CVD, metacrilato de metilo EL-6 (MMA), persulfato de amonio (APS), acetona, isopropanol, etanol, agua de grado molecular. Los instrumentos necesarios que no se muestran incluyen: recubridor giratorio, descargador incandescente, placa calefactora, desecador al vacío y termómetro. Todos los elementos necesarios se detallan en la Tabla de Materiales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema del proceso de fabricación de la rejilla de grafeno. El grafeno se recubre con una fina capa de metacrilato de metilo EL-6 (MMA) utilizando un recubridor giratorio (paso 2). El grafeno en el lado opuesto de la lámina de cobre se elimina mediante grabado con plasma (paso 3). A continuación, se utiliza persulfato de amonio (APS) para grabar el cobre (pasos 4-5). La película de MMA-grafeno se coloca sobre la superficie de la rejilla (paso 6-7). Por último, el MMA se disuelve durante una serie de lavados con disolventes orgánicos (pasos 8-9). Los pasos indicados anteriormente, las flechas, corresponden a los pasos numerados descritos en la sección de protocolos. Este método ha sido adaptado de Han et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la hidrofilicidad de la superficie de la rejilla en función de la duración del tratamiento UV/ozono y del tiempo transcurrido después del tratamiento. (A) Ángulos de contacto medidos trazados en función de la duración del tratamiento. La disminución de los ángulos de contacto es consistente con un aumento de la hidrofilicidad (rejilla no tratada: 78°; 20 min: 37°). Ángulos de contacto medidos con ImageJ43. (B) Ángulos de contacto medidos trazados en función del tiempo, después del tratamiento (0 min: 45°; 60 min: 74°). La cuadrícula medida en el curso de tiempo posterior al tratamiento fue tratada con UV/ozono durante 12 min, como se indica con un asterisco. Cada medición posterior al tratamiento se realizó en la misma cuadrícula, y la muestra se retiró mediante mecha entre mediciones. Se espera que los ángulos de contacto específicos medidos varíen en función de las condiciones ambientales del laboratorio, y recomendamos que los usuarios realicen experimentos similares en sus laboratorios para identificar las condiciones adecuadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes representativas de rejillas recubiertas de grafeno y rejillas de control no recubiertas. (A-C) Imágenes representativas de atlas, cuadrículas cuadradas y agujeros de lámina de rejillas de carbono agujereadas recubiertas de grafeno tomadas con un microscopio de 300 keV equipado con un detector de electrones directo K3. (D) Micrografía crioEM de S. pyogenes dCas9 en complejo con sgRNA y ADN diana (complejo a una concentración de 250 ng/μL) en una rejilla de carbono agujereada recubierta de grafeno. (E) Imagen de difracción de la cuadrícula en paneles (A-D). La flecha naranja indica una posición correspondiente a una frecuencia espacial de 2,13 Å. Se aplicó una muestra idéntica a la del panel (D) a (F) tratamiento UV/ozono y (G) rejillas de carbono agujereadas descargadas por brillo sin grafeno. Las micrografías crioEM que se muestran son representativas de cada cuadrícula y no muestran partículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Reconstrucción crioEM de un complejo Cas9 a partir de rejillas recubiertas de grafeno. (A) Mapa de densidad crioEM a partir de la reconstrucción 3D de S. pyogenes dCas9 en complejo con sgRNA y ADN diana. (B) Los residuos R63-L82 de un modelo ajustado se representan dentro de la densidad de crioEM semitransparente, con un subconjunto de cadenas laterales visibles etiquetadas. (C) Curvas de correlación de capas de Fourier (FSC) de los mapas desenmascarados, sueltos y estrechamente enmascarados. (D) Histograma y gráfico direccional FSC basado en el método 3DFSC23. Consulte la Figura complementaria 2 y el paso 13 para obtener más información. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Soporte de imágenes de ángulo de contacto. (A) Un soporte de cámara impreso en 3D y un soporte de imagen de mesa para asegurar la cámara en una posición que alinee la cámara en el plano con el cubreobjetos. (B) La rejilla se coloca en el cubreobjetos encima de un trozo cuadrado de película de parafina de 1 cm x 1 cm. El soporte de imagen representado se imprimió en 3D utilizando los archivos .stl proporcionados (Archivo de codificación suplementario 1 y Archivo de codificación suplementario 2) y se puede modificar fácilmente para adaptarse a la mayoría de los dispositivos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Flujo de trabajo de procesamiento de imágenes. Flujo de trabajo de procesamiento para el complejo dCas9. Se indican los nombres de los trabajos, los detalles de los trabajos y los parámetros no predeterminados (cursivas). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 1: Se proporcionan archivos CAD de estereolitografía en formato STL para facilitar la impresión 3D del soporte de la cámara (camera_stand_v1.stl). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: Se proporcionan archivos CAD de estereolitografía en formato STL para facilitar la impresión 3D de la montura de imagen de mesa (slide_mount_v1.stl) y haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La preparación de muestras de CryoEM implica una serie de desafíos técnicos, ya que la mayoría de los flujos de trabajo requieren que los investigadores manipulen manualmente las rejillas frágiles con extremo cuidado para evitar dañarlas. Además, la posibilidad de vitrificación de cualquier muestra es impredecible; Las partículas a menudo interactúan con la interfaz aire-agua o con la lámina de soporte sólida que se superpone a las rejillas, lo que puede llevar a que las partículas adopten las orientaciones preferidas o no entren en los orificios de imagen a menos que se apliquen concentraciones muy altas de proteínas24. La superposición de rejillas crioEM agujereadas con una monocapa continua de grafeno ha demostrado ser tremendamente prometedora para mejorar la distribución de partículas en las micrografías, aumentar el número de partículas a bajas concentraciones y reducir las orientaciones preferidas impulsadas por las interacciones en la interfaz aire-agua30.

Una limitación de los protocolos de recubrimiento de grafeno existentes para las rejillas crioEM son las extensas manipulaciones manuales necesarias para el proceso de recubrimiento, que pueden comprometer la calidad y aumentar la variabilidad de la red a la red. En este trabajo describimos ligeras modificaciones a un protocolo existente para el recubrimiento de rejillas crioEM con una monocapa de grafeno30.

Los pasos críticos dentro de este protocolo incluyen el recubrimiento de grafeno CVD con MMA, la disolución del sustrato de cobre de grafeno CVD en APS y la aplicación de grafeno a las rejillas crioEM. Modificamos el protocolo original para minimizar las manipulaciones manuales de las rejillas recubiertas mediante el intercambio de disolventes dentro de la misma placa de Petri, en lugar de manipular y transferir individualmente las rejillas a un nuevo recipiente de disolvente para cada paso de lavado, con el objetivo de aumentar el rendimiento de las rejillas recubiertas de grafeno intactas y de alta calidad. Si bien nos esforzamos por reducir al mínimo las manipulaciones de las rejillas recubiertas de grafeno, reconocemos que la aplicación manual de cuadrados de grafeno individuales a las rejillas crioEM es inherentemente desafiante y que se espera cierta variabilidad de cuadrícula a cuadrícula.

Las rejillas recubiertas de grafeno suelen requerir un tratamiento UV/ozono para que la superficie sea hidrófila para la aplicación de muestras. La duración del tratamiento UV/ozono y el tiempo transcurrido después del tratamiento y antes de la inmersión pueden afectar la hidrofilicidad de la red y, en última instancia, la calidad de la muestra. Además del protocolo de fabricación de la red, describimos una técnica para evaluar la hidrofilicidad de la red después del tratamiento UV/ozono. En el procedimiento, el ángulo de contacto de la superficie de una muestra aplicada se utiliza como indicador del carácter hidrofílico de la rejillarevestida 20,44. Se proporcionan diseños para imprimir en 3D de forma económica un soporte de imagen de cuadrícula personalizado que utiliza una simple cámara de teléfono celular para estimar el ángulo de contacto de la superficie.

Finalmente, describimos los resultados obtenidos mediante el empleo de este protocolo para determinar la estructura crioEM de 2,7 Å de la endonucleasa de ADN guiada por ARN catalíticamente inactiva, S. pyogenes Cas9 en complejo con sgRNA y ADN diana40. En ausencia de grafeno, no se observaron partículas en los orificios de la lámina a las concentraciones complejas utilizadas (250 ng/μL). Por el contrario, las rejillas recubiertas de grafeno perforan partículas a alta densidad, lo que permite una fácil reconstrucción en 3D de un mapa de alta resolución a partir de 2.961 micrografías. En conjunto, estos datos ponen de manifiesto el valor de aplicar monocapas de grafeno a las rejillas crioEM para el análisis de partículas individuales.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgments

Los especímenes se prepararon y se obtuvieron imágenes en las instalaciones de CryoEM en MIT.nano en microscopios adquiridos gracias a la Fundación Arnold y Mabel Beckman. Los dispositivos de imágenes de ángulo de contacto se imprimieron en el MIT Metropolis Maker Space. Agradecemos a los laboratorios de Nieng Yan y Yimo Han, y al personal de MIT.nano por su apoyo a lo largo de la adopción de este método. En particular, extendemos nuestro agradecimiento a los doctores Guanhui Gao y Sarah Sterling por sus perspicaces discusiones y comentarios. Este trabajo fue financiado por las subvenciones R01-GM144542, 5T32-GM007287 de los NIH y la 2046778 de subvenciones NSF-CAREER. La investigación en el laboratorio de Davis cuenta con el apoyo de la Fundación Alfred P. Sloan, el Fondo James H. Ferry, la Clínica J del MIT y la Familia Whitehead.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216

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References

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Bioquímica Número 201
Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución
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Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, … More

Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).

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