Summary
Anvendelsen av støttelag til kryogen elektronmikroskopi (kryoEM) nett kan øke partikkeltettheten, begrense interaksjoner med luft-vanngrensesnittet, redusere stråleindusert bevegelse og forbedre fordelingen av partikkelorienteringer. Dette papiret beskriver en robust protokoll for å belegge cryoEM-rutenett med et monolag grafen for forbedret klargjøring av kryoprøver.
Abstract
I kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) påføres rensede makromolekyler på et rutenett som bærer en holey karbonfolie; Molekylene blir deretter blottet for å fjerne overflødig væske og raskt frosset i et omtrent 20-100 nm tykt lag av glassaktig is, suspendert over omtrent 1 μm brede foliehull. Den resulterende prøven avbildes ved hjelp av kryogen transmisjonselektronmikroskopi, og etter bildebehandling ved hjelp av egnet programvare kan næratomoppløsningsstrukturer bestemmes. Til tross for at cryoEM er utbredt, er prøvepreparering fortsatt en alvorlig flaskehals i cryoEM-arbeidsflyter, med brukere som ofte møter utfordringer knyttet til prøver som oppfører seg dårlig i den suspenderte glassmassen. Nylig har metoder blitt utviklet for å modifisere kryoEM-gitter med et enkelt kontinuerlig lag av grafen, som fungerer som en støtteflate som ofte øker partikkeltettheten i det avbildede området og kan redusere interaksjoner mellom partikler og luft-vanngrensesnittet. Her gir vi detaljerte protokoller for anvendelse av grafen til kryoEM-nett og for raskt å vurdere den relative hydrofiliteten til de resulterende nettene. I tillegg beskriver vi en EM-basert metode for å bekrefte tilstedeværelsen av grafen ved å visualisere dens karakteristiske diffraksjonsmønster. Til slutt demonstrerer vi nytten av disse grafenstøttene ved raskt å rekonstruere et 2.7 Å-oppløsningstetthetskart over et Cas9-kompleks ved hjelp av en ren prøve i en relativt lav konsentrasjon.
Introduction
Enkeltpartikkelkryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har utviklet seg til en mye brukt metode for visualisering av biologiske makromolekyler1. Drevet av fremskritt innen direkte elektrondeteksjon 2,3,4, datainnsamling5 og bildebehandlingsalgoritmer 6,7,8,9,10, er cryoEM nå i stand til å produsere 3D-strukturer med nær atomoppløsning av et raskt voksende antall makromolekyler11. Videre, ved å utnytte tilnærmingens enkeltmolekylære natur, kan brukerne bestemme flere strukturer fra en enkelt prøve 12,13,14,15, og fremheve løftet om å bruke dataene som genereres for å forstå heterogene strukturelle ensembler 16,17. Til tross for denne fremgangen fortsetter flaskehalser i klargjøring av kryoprøver.
For strukturell karakterisering ved kryoEM, bør biologiske prøver være godt dispergert i vandig løsning og må deretter flashfryses gjennom en prosess som kalles vitrifisering 18,19. Målet er å fange partikler i et jevnt tynt lag av forglasset is suspendert over regelmessig fordelte hull som vanligvis kuttes i et lag av amorft karbon. Denne mønstrede amorfe karbonfolien støttes av et TEM-gitter som bærer et nett av kobber- eller gullstøttestenger. I standard arbeidsflyter gjengis rister hydrofile ved hjelp av en plasmabehandling med glødeutladning før prøven påføres. Overflødig væske blottes med filterpapir, slik at proteinløsningen danner en tynn væskefilm over hullene som lett kan vitrifiseres under frysing av lunger. Vanlige utfordringer inkluderer partikkellokalisering til luft-vanngrensesnittet (AWI) og påfølgende denaturering20,21,22 eller adopsjon av foretrukne orienteringer 23,24,25, partikkeladherens til karbonfolien i stedet for å migrere inn i hullene, og klynging og aggregering av partiklene i hullene26. Ujevn istykkelse er en annen bekymring; Tykk is kan gi høyere bakgrunnsstøy i mikrografene på grunn av økt elektronspredning, mens ekstremt tynn is kan utelukke større partikler27.
For å møte disse utfordringene har en rekke tynne støttefilmer blitt brukt til å belegge gitteroverflater, slik at partikler kan hvile på disse støttene og, ideelt sett, unngå interaksjoner med luft-vanngrensesnittet. Grafenstøtter har vist stort løfte, delvis på grunn av deres høye mekaniske styrke kombinert med deres minimale spredningstverrsnitt, noe som reduserer bakgrunnssignalet lagt til av støttelaget28. I tillegg til det minimale bidraget til bakgrunnsstøy, viser grafen også bemerkelsesverdig elektrisk og termisk ledningsevne29. Grafen og grafenoksydbelagte nett har vist seg å gi høyere partikkeltetthet, mer jevn partikkelfordeling30 og redusert lokalisering til AWI22. I tillegg gir grafen en støtteflate som kan modifiseres ytterligere til: 1) justere de fysiokjemiske egenskapene til gitteroverflaten gjennom funksjonalisering 31,32,33; eller 2) parkoblingsmidler som letter affinitetsrensing av proteiner av interesse 34,35,36.
I denne artikkelen har vi endret en eksisterende prosedyre for å belegge cryoEM-gitter med et enkelt jevnt lag grafen30. Modifikasjonene tar sikte på å minimere netthåndtering gjennom hele protokollen, med mål om å øke utbyttet og reproduserbarheten. I tillegg diskuterer vi vår tilnærming for å evaluere effekten av ulike UV/ozon-behandlinger ved å gjøre ristene hydrofile før de stuper. Dette trinnet i klargjøring av kryoEM-prøver ved bruk av grafenbelagte rutenett er kritisk, og vi har funnet ut at vår enkle metode for å kvantifisere den relative hydrofiliteten til de resulterende rutene er nyttig. Ved hjelp av denne protokollen demonstrerer vi nytten av å bruke grafenbelagte nett for strukturbestemmelse ved å generere en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon av katalytisk inaktive S. pyogenes Cas9 i kompleks med guide RNA og mål-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av CVD-grafen
- Forbered grafenetseløsning som beskrevet nedenfor.
- Løs opp 4,6 g ammoniumpersulfat (APS) i 20 ml vann av molekylær kvalitet i et 50 ml beger for en 1 M løsning og dekk med aluminiumsfolie. La APS oppløses fullstendig mens du går videre til trinn 1.2.
- Forbered en del av CVD-grafen for metylmetakrylat (MMA) belegg. Klipp forsiktig en firkantet del av CVD-grafen. Overfør firkanten til en dekkseddel (50 mm x 24 mm) i en ren petriskål og deksel under transport til sentrifugeren.
MERK: En 18 mm x 18 mm firkant skal gi 25-36 grafenbelagte rister.
2. Belegge CVD-grafen med MMA
- Sett spinncoaterinnstillingene til et 60 s høyhastighetsspinn ved 2,500 o / min. Legg CVD-grafén forsiktig på den passende størrelsen chuck.
MERK: Ideelt sett vil CVD-grafen strekke seg 1-2 mm over kanten av den valgte chucken for å forhindre aspirasjon av MMA i vakuumsystemet. - Trykk på Ta / absorber-knappen for å koble inn vakuumpumpen og fest CVD-grafen til chucken. Påfør MMA i midten av CVD-grafenfirkanten, lukk lokket og trykk på Start / Stop-knappen umiddelbart. For en 18 mm x 18 mm firkant av CVD-grafen er 40 μL MMA tilstrekkelig.
- Når spinningen har stoppet, kobler du fra vakuumpumpen og henter forsiktig MMA-belagt CVD-grafen med pinsett. Inverter CVD-grafénet slik at den MMA-belagte siden vender ned og legg den tilbake på glassdekselet.
3. Plasmaetsing av grafenbaksiden
- Overfør CVD-grafen på dekselet inn i glødeladeren og glødeutladning i 30 s ved 25 mA ved hjelp av pinsett med flat spiss.
- Sett CVD-grafénet tilbake på omslaget til petriskålen og dekk til under transport til kobberetseområdet. MMA-belegg vil beskytte topside grafenlaget fra plasmaetsing.
4. Skjæring av MMA-belagte CVD-grafenfirkanter i rutenettstørrelse
- Bruk to par pinsett for å støtte CVD-grafenfirkanten. Legg merke til orienteringen til CVD-grafenfirkanten, hold MMA-siden opp mens du er festet til pinsetten (KRITISK).
- Skjær CVD-grafen i omtrent 3 mm x 3 mm firkanter. Bruk to sett med omvendt handling tang for dette trinnet for å holde CVD-grafenfirkanten høyre side opp og forankre den på plass, og også for å holde kanten av en 3 mm x 3 mm firkant etter å ha kuttet den bort fra resten av firkanten.
5. Oppløsning av kobbersubstrat fra MMA-belagt CVD-grafen
- Flytt forsiktig hver 3 mm x 3 mm firkant i APS-løsningen. Kom i kontakt med overflaten på APS-løsningen før du slipper hver rute. Vipp begeret slik at hver firkant kan plasseres i løsningen i grunne vinkel; Dette sikrer at torget ikke synker.
- Dekk begeret med aluminiumsfolie og rug over natten ved 25 °C.
6. Fjerne MMA / grafenfilmer fra APS
- Bruk et glassdeksel med dimensjoner 12 mm x 50 mm og trekk ut MMA / grafenkvadratene fra APS ved å forsiktig skyve dekselet vertikalt inn i APS og deretter flytte dekselet sideveis slik at det støter på en flytende MMA / grafenfirkant.
- Fjern forsiktig dekselet og sørg for at firkanten fester seg helt til siden av dekselet ved fjerning.
- Overfør MMA/grafenkvadrater til et rent 50 ml beger fylt med vann av molekylær kvalitet i 20 minutter. Dypp forsiktig dekselet med en MMA / grafenfirkant festet vertikalt i vannet og sørg for at firkanten løsner fra dekselet ved interaksjon med vannoverflaten. Gjenta for alle MMA / grafen firkanter.
7. Fester grafen til rutenett
- Bruk pinsett med negativ virkning, dypp forsiktig et rutenett vertikalt i vannet med karbonsiden mot en flytende MMA / grafenfirkant. Når du er i kontakt med torget, fjern rutenettet forsiktig og sørg for at torget fester seg helt til karbonsiden av rutenettet ved fjerning. Minimer lateral bevegelse av rutenettet når det er nedsenket i vann for å forhindre skade på rutenett (KRITISK).
- Plasser rister på et rent deksel MMA / grafensiden opp og lufttørk i 1 til 2 min. Overfør dekselgrafen / MMA-belagte rister til en kokeplate satt til 130 ° C ved hjelp av pinsett med flat spiss.
- Dekk med toppen av et glass petriskål og inkuber i 20 minutter. Fjern fra varme og avkjøl til romtemperatur i 1 til 2 min.
FORSIKTIG: Vær forsiktig da petriskaboltoppen blir ekstremt varm.
8. Oppløsning av MMA med aceton
- Overfør hele coverslip til en petriskål fylt med 15 ml aceton. Inkuber i 30 min.
- Bruk en ren glass serologisk pipette, overfør aceton, der ristene ble inkubert, til en avfallsbeholder. Tilsett forsiktig 15 ml fersk aceton til petriskålen ved hjelp av en ren serologisk pipette av glass. Inkuber i 30 min.
- Gjenta disse vasketrinnene for totalt 3 acetonvasker.
9. Fjerning av gjenværende aceton med isopropanol
- Etter 3 aceton vasker, fjern aceton og erstatt med 15 ml isopropanol ved hjelp av en ren glass serologisk pipette. Inkuber i 20 min.
- Gjenta 3x for totalt 4 isopropanol vasker. Fjern rister forsiktig fra isopropanol og lufttørk på et rent deksel med pinsett.
MERK: Gjenværende isopropanol kan gjøre det vanskelig å frigjøre rister fra pinsett. Å ta kontakt mellom rutenettet og den rene dekkslippen før du slipper rutenettet fra pinsetten, kan lindre dette problemet. - Fordamp gjenværende organiske stoffer ved å overføre dekselet med grafenbelagte rister til en kokeplate satt til 100 °C i 10 minutter. Avkjøl til romtemperatur og oppbevar under vakuum til bruk.
10. UV / ozonbehandling av grafenbelagte rister
- Bruk pinsett med omvendt virkemåte, plasser ristene forsiktig i et rent belysningsområde på en UV / ozonrenser med den grafenbelagte siden vendt oppover.
- Skyv belysningsområdet lukket og slå maskinen PÅ. Vri tidsvelgeren til den angitte behandlingstiden for å starte UV/ozonbehandling av ristene.
MERK: Behandlingsvarighet er en justerbar parameter, og overflødig behandling har potensial til å skade nettet. Han et al.30 anbefaler 10 min UV/ozonbehandling, og vi har også funnet ut at 10 min behandling er tilstrekkelig. Se trinn 12 for veiledning om innstilling av denne behandlingstiden. - Fortsett direkte til å kaste en cryoEM-prøve på de behandlede ristene ved å følge stupetrinnene som beskrevet i Koh et al.37.
MERK: Atmosfæriske hydrokarboner kan akkumuleres på rutenettoverflaten etter UV / ozonbehandling og øke hydrofobisiteten til grafenoverflaten38,39. For å unngå dette, kast UV / ozonbehandlede rister umiddelbart. Det kan være fordelaktig å UV / ozon behandle rutenett i batcher, for eksempel UV / ozon behandle seks rutenett og umiddelbart kaste de seks rutene, deretter UV / ozon behandle en andre batch av rutenett, etterfulgt av å kaste den andre batchen.
11. Ta et diffraksjonsbilde
- Sørg for at mikroskopet er godt innstilt med parallell belysning etablert og sett endelig defokus til -0,2 μm.
- Sett inn fluorescerende skjerm og strålen stopper helt. Gå inn i diffraksjonsmodus for å tydelig visualisere diffraksjonspunkter.
- Skaff deg et bilde ved hjelp av et CCD-kamera og evaluer det ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.
MERK: De lettest observerte og identifiserbare diffraksjonspunktene generert av et grafenmonolag er 6 flekker som tilsvarer en romlig frekvens på 2,13 Å. Bruk et måleverktøy for å estimere avstanden fra midten av den diffrakterte strålen til et av disse diffraksjonspunktene i gjensidige enheter. Spesielt 2.13 Å
0.47 Å-1.
0.47 Å-1.12. Vurdering av netthydrofilitet
- Forbered bildeoppsettet. Finn et telefonstativ, bordbildeoverflate, telefon med kamera, glassdeksel og parafinfilm. Bildene som vises her, ble tatt ved hjelp av et telefonstativ og en avbildningsoverflate på bordplaten som ble 3D-printet ved hjelp av de medfølgende .stl-filene, noe som resulterte i lettere reproduserbare og kvantifiserbare kontaktvinkelmålinger (tilleggsfigur 1A).
- Legg et glassdeksel på den flate overflaten, kutt deretter en 1 cm med 1 cm firkant parafinfilm og legg den på glassdekselet. Plasser telefonen på telefonstativet, og orienter telefonen slik at kameraet er i plan med glassdekselet. Sikker telefonen i denne posisjonen ved hjelp av gummistrikker (tilleggsfigur 1B). Ta et eksempelbilde for å bekrefte at kameraet er på linje med bildeoverflaten.
- Rett etter UV / ozonbehandling av grafenbelagte rister, plasser et enkelt rutenett på kvadratet av parafinfilm på glassdekselet. Forsikre deg om at grafensiden vender oppover. Legg til en 2 μL vanndråpe på midten av rutenettoverflaten med en pipette og ta et bilde umiddelbart.
MERK: Gjenta dette trinnet etter: i) ønskede intervaller for UV/ozonbehandling for å bestemme tilstrekkelig behandlingslengde; eller ii) ønskede tidsintervaller etter UV/ozonbehandling for å måle hvor lenge etter behandling nettoverflaten beholder sin hydrofile karakter. - Beregn kontaktvinkler fra bilder ved å importere dem til ImageJ43 og bruke plugin-modulen for kontaktvinkel.
13. Enkeltpartikkelanalyse av dCas9-kompleksdatasettet
MERK: All bildebehandling beskrevet i denne protokollen ble utført med cryoSPARC versjon 4.2.1.
- Forhåndsbehandle filmer ved hjelp av jobbene Patch Motion Correction og Patch CTF Estimation. Utfør partikkelplukking ved hjelp av Blob-plukkerjobben ved hjelp av en sfærisk klatt som varierer i diameter fra 115 Å til 135 Å.
- Ekstrahere partikler ved hjelp av Extract from micrographs-jobben, ved hjelp av normalisert korrelasjonskoeffisient (NCC) og effektterskler som resulterer i omtrent 200-300 partikler per mikrograf. Vær oppmerksom på at passende terskler og resulterende partikkelantall kan variere, og brukere bør inspisere plukkkvaliteten på tvers av en rekke mikrografer for å identifisere passende forhold.
- Utfør multiclass innledende rekonstruksjoner ved hjelp av Ab-initio rekonstruksjonsjobben, som krever tre klasser. To av de tre klassene vil sannsynligvis inneholde ikke-Cas9-partikler, inkludert overflateforurensninger. Velg klassen som ligner dCas9 for videre behandling.
MERK: Ytterligere runder med multiklasse Ab-initio rekonstruksjon eller heterogen raffinement kan brukes til å avgrense partikkelstakken ytterligere. - Utfør 3D-finjustering ved hjelp av jobben Ikke-uniform finjustering ved å velge standardparametere. Beregn oppløsningen av rekonstruksjonen ved hjelp av valideringsjobbene (FSC) og ThreeDFSC, ved hjelp av kartene og masken fra den endelige 3D-finjusteringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket fabrikasjon av grafenbelagte kryoEM-gitter ved bruk av utstyret (figur 1) og protokollen (figur 2) som er skissert her, vil resultere i et monolag av grafen som dekker foliehullene som kan bekreftes av dets karakteristiske diffraksjonsmønster. For å fremme proteinadsorpsjon til grafenoverflaten, kan UV / ozonbehandling brukes til å gjøre overflaten hydrofil ved å installere oksygenholdige funksjonelle grupper. Imidlertid kan hydrokarbonforurensninger i luften adsorbere på grafenoverflaten så tidlig som 5 minutter etter UV / ozonbehandling og motvirke denne effekten38,39. Det er viktig at både varigheten av UV/ozon-behandlingen og tiden som går mellom behandling og stup kan påvirke prøvekvaliteten. Vi demonstrerer disse effektene ved hjelp av en enkel metode for å vurdere den hydrofile karakteren til det belagte nettet basert på overflatekontaktvinkelen (figur 3; se trinn 12).
For å demonstrere bruken av grafenstøtter i enkeltpartikkelkryoEM, brukte vi en katalytisk inaktiv RNA-guidet DNA-endonuklease S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 i kompleks med sgRNA og mål-DNA til grafenbelagte nett, samlet et cryoEM-datasett fra disse nettene, og utførte enkeltpartikkelanalyse7. Grafenbelagte rutenett inneholdt konsekvent ~ 300 partikler per mikrograf ved 0,654 Å / pix forstørrelse ved hjelp av et 300 keV mikroskop utstyrt med en K3 direkte elektrondetektor (figur 4A-E). En 8-timers datainnsamlingsøkt med +18° scenehelling ga 2 963 filmer og 324 439 partikler i en endelig kuratert stabel. Ved hjelp av disse partiklene genererte vi en 3D-rekonstruksjon som ved raffinering ga et tetthetskart med en estimert oppløsning på 2,7 Å og tilstrekkelig vinkelprøvetaking for å unngå anisotrope artefakter (figur 5). En atommodell (PDB 6o0z)41 ble forankret i dette kartet, og raffinert ved hjelp av ISOLDE42. Residues R63-L82 av denne monterte atommodellen vises med det raffinerte cryoEM-tetthetskartet, som fremhever den oppløste sidekjedetettheten (figur 5B). Ved sammenligning av samme prøve og konsentrasjon (250 ng/μL) anvendt på identiske rutenett som manglet grafén, ble det ikke observert partikler (figur 4F,G). Denne observasjonen fremhever effekten av grafenstøtten ved å muliggjøre visualisering av partikler fra lavkonsentrasjonsprøver.
Figur 1: Nødvendig utstyr. Laboratorieutstyr og verktøy som er nødvendige for fremstilling av grafennett ved hjelp av protokollen beskrevet i denne artikkelen. Varer og deres antall vises og merkes tilsvarende. Nødvendige reagenser som ikke er vist inkluderer: CVD-grafen, metylmetakrylat EL-6 (MMA), ammoniumpersulfat (APS), aceton, isopropanol, etanol, vann av molekylær kvalitet. Nødvendige instrumenter som ikke vises inkluderer: spinnbelegg, glødelader, kokeplate, vakuumtørker og termometer. Alle nødvendige elementer er beskrevet i materialfortegnelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av grafengitterprosessen. Grafen er belagt med et tynt lag metylmetakrylat EL-6 (MMA) ved hjelp av en spinnbelegger (trinn 2). Grafén på motsatt side av kobberfolien fjernes via plasmaetsing (trinn 3). Ammoniumpersulfat (APS) brukes deretter til å etse bort kobberet (trinn 4-5). MMA-grafenfilmen plasseres på rutenettoverflaten (trinn 6-7). Til slutt oppløses MMA under en serie vasker med organiske løsningsmidler (trinn 8-9). Trinnene som er angitt ovenfor, tilsvarer nummererte trinn som er beskrevet i protokolldelen. Denne metoden er tilpasset fra Han et al.30. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av hydrofilitet på nettoverflaten som funksjon av varighet av UV/ozonbehandling og tid etter behandling. (A) Målte kontaktvinkler plottet som en funksjon av behandlingens varighet. Reduserte kontaktvinkler er forenlig med økt hydrofilitet (ubehandlet rutenett: 78°; 20 min: 37°). Kontaktvinkler målt med ImageJ43. (B) Målte kontaktvinkler plottet som funksjon av tid, etter behandling (0 min: 45°; 60 min: 74°). Rutenett målt i tidsforløpet etter behandlingen var UV/ozonbehandlet i 12 minutter, som indikert med stjerne. Hver etterbehandlingsmåling ble utført på samme rutenett, med prøven fjernet ved å transportere mellom målingene. Spesifikke målte kontaktvinkler forventes å variere som en funksjon av laboratoriemiljøforhold, og vi anbefaler at brukerne utfører lignende eksperimenter i laboratoriene sine for å identifisere passende forhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av grafenbelagt rutenett og ubestrøkne kontrollgitter. (A-C) Representativt atlas, rutenett og foliehullbilder av grafenbelagte holey karbongitter tatt på et 300 keV mikroskop utstyrt med en K3 direkte elektrondetektor. (D) CryoEM-mikrografi av S. pyogenes dCas9 i kompleks med sgRNA og mål-DNA (kompleks ved 250 ng / μL konsentrasjon) på grafenbelagt holey karbonnett. (E) Diffraksjonsbilde fra rutenett avbildet i paneler (A-D). Oransje pil indikerer en posisjon som tilsvarer en romlig frekvens på 2,13 Å. En identisk prøve som i panel (D) ble brukt på (F) UV / ozonbehandling og (G) glød utladet holey karbongitter uten grafen. KryoEM-mikrografene som vises, er representative for hvert rutenett og viser ingen partikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: CryoEM-rekonstruksjon av et Cas9-kompleks fra grafenbelagte nett. (A) CryoEM tetthetskart fra 3D-rekonstruksjon av S. pyogenes dCas9 i kompleks med sgRNA og mål-DNA. (B) Rester R63-L82 fra en tilpasset modell er avbildet i den halvtransparente kryoEM-tettheten, med et delsett av synlige sidekjeder merket. (C) Fourier Shell Correlation (FSC)-kurver for de umaskerte, løst og tett maskerte kartene. (D) Histogram og retningsbestemt FSC-plott basert på 3DFSC-metoden23. Se tilleggsfigur 2 og trinn 13 for mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Avbildningsstativ for kontaktvinkel. (A) Et 3D-printet kamerastativ og bildefeste på bordplaten for å sikre kameraet i en posisjon som justerer kameraet i planet med omslaget. (B) Gitter er plassert på dekselet på toppen av et 1 cm x 1 cm kvadratisk stykke parafinfilm. Den avbildede bildemonteringen ble 3D-printet ved hjelp av de medfølgende STL-filene (Supplementary Coding File 1 og Supplementary Coding File 2) og kan enkelt endres for å imøtekomme de fleste enheter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Arbeidsflyt for bildebehandling. Behandlingsarbeidsflyt for dCas9-komplekset. Jobbnavn, jobbdetaljer og ikke-standardparametere (kursiv) er angitt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 1: Stereolitografi CAD-filer i STL-formatet leveres for å lette 3D-utskrift av kamerastativ (camera_stand_v1.stl). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 2: Stereolitografi CAD-filer i STL format er gitt for å lette 3D-utskrift av bordplaten bildemontering (slide_mount_v1.stl) og Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CryoEM-prøvepreparering innebærer en rekke tekniske utfordringer, med de fleste arbeidsflyter som krever at forskere manuelt manipulerer skjøre rister med ekstrem forsiktighet for å unngå å skade dem. I tillegg er tilgjengeligheten til enhver prøve til vitrifisering uforutsigbar; Partikler interagerer ofte med luft-vann-grensesnittet eller med den faste støttefolien som ligger over ristene, noe som kan føre til at partikler vedtar foretrukne retninger eller ikke kommer inn i bildehullene med mindre svært høye proteinkonsentrasjoner påføres24. Overliggende holey cryoEM-rutenett med et kontinuerlig monolag av grafen har vist enormt løfte om å forbedre partikkelfordelinger på mikrografer, øke partikkelantallet ved lave konsentrasjoner og redusere foretrukne orienteringer drevet av interaksjoner ved luft-vann-grensesnittet30.
En begrensning av eksisterende grafenbeleggprotokoller for kryoEM-nett er de omfattende manuelle manipulasjonene som kreves for belegningsprosessen, noe som kan kompromittere kvaliteten og øke variasjonen fra rutenett til nettet. I dette arbeidet beskriver vi små modifikasjoner av en eksisterende protokoll for å belegge cryoEM-nett med et monolag av grafen30.
Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer belegg CVD-grafen med MMA, oppløsning av CVD-grafenkobbersubstratet i APS, og anvendelse av grafen til kryoEM-nett. Vi modifiserte den opprinnelige protokollen for å minimere manuelle manipulasjoner av de belagte ristene ved å bytte løsemidler i samme petriskål, i stedet for individuelt å håndtere og overføre rister til en ny løsemiddelbeholder for hvert vasketrinn, og dermed sikte på å øke utbyttet av intakte, høykvalitets, grafenbelagte rister. Mens vi forsøkte å redusere manipulasjoner av grafenbelagte nett til et minimum, erkjenner vi at manuell anvendelse av individuelle grafenkvadrater til kryoEM-nett er iboende utfordrende, og at det forventes noe grid-to-grid-variabilitet.
Grafenbelagte rister krever vanligvis UV / ozonbehandling for å gjøre overflaten hydrofil for prøveapplikasjon. Varigheten av UV/ozon-behandlingen og tiden som har gått etter behandling og før stup, kan påvirke netthydrofiliteten og til syvende og sist prøvekvaliteten. I tillegg til protokollen for nettfabrikasjon beskriver vi en teknikk for å vurdere grid-hydrofilitet etter UV/ozon-behandling. I prosedyren brukes overflatekontaktvinkelen til en påført prøve som en indikator på den hydrofile karakteren til det belagte rutenettet20,44. Design leveres for å billig 3D-printe en tilpasset rutenettbildemontering som bruker et enkelt mobiltelefonkamera for å estimere overflatekontaktvinkelen.
Til slutt beskriver vi resultater oppnådd ved å bruke denne protokollen for å bestemme 2.7 Å cryoEM-strukturen til den katalytisk inaktive RNA-guidede DNA-endonukleasen, S. pyogenes Cas9 i kompleks med sgRNA og mål-DNA40. I fravær av grafen ble det ikke observert partikler i foliehull ved de komplekse konsentrasjonene som ble brukt (250 ng / μL). I motsetning til dette har grafenbelagte rutenett partikler med høy tetthet, noe som muliggjør lett 3D-rekonstruksjon av et høyoppløselig kart fra 2,961 mikrografer. Samlet sett fremhever disse dataene verdien av å bruke grafenmonolag til kryoEM-rutenett for enkeltpartikkelanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Prøver ble utarbeidet og avbildet på CryoEM-anlegget i MIT.nano på mikroskoper anskaffet takket være Arnold og Mabel Beckman Foundation. Kontaktvinkelbildeenheter ble skrevet ut på MIT Metropolis Maker Space. Vi takker laboratoriene til Nieng Yan og Yimo Han, og ansatte ved MIT.nano for deres støtte gjennom vedtakelsen av denne metoden. Spesielt takker vi Dr. Guanhui Gao og Sarah Sterling for deres innsiktsfulle diskusjoner og tilbakemeldinger. Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendene R01-GM144542, 5T32-GM007287 og NSF-CAREER grant 2046778. Forskning i Davis-laboratoriet støttes av Alfred P. Sloan Foundation, James H. Ferry Fund, MIT J-Clinic og Whitehead Family.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Dubochet, J.
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S.
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
