Summary
L'applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.
Abstract
Nella microscopia elettronica criogenica (cryoEM), le macromolecole purificate vengono applicate a una griglia contenente una lamina di carbonio bucata; Le molecole vengono quindi tamponate per rimuovere il liquido in eccesso e congelate rapidamente in uno strato di ghiaccio vetroso spesso circa 20-100 nm, sospeso su fori di lamina larghi circa 1 μm. Il campione risultante viene ripreso utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica e, dopo l'elaborazione dell'immagine utilizzando un software adatto, è possibile determinare strutture a risoluzione quasi atomica. Nonostante l'adozione diffusa di cryoEM, la preparazione dei campioni rimane un grave collo di bottiglia nei flussi di lavoro di cryoEM, con gli utenti che spesso incontrano sfide legate ai campioni che si comportano male nel ghiaccio vitreo sospeso. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per modificare le griglie crioEM con un singolo strato continuo di grafene, che funge da superficie di supporto che spesso aumenta la densità delle particelle nell'area ripresa e può ridurre le interazioni tra le particelle e l'interfaccia aria-acqua. Qui, forniamo protocolli dettagliati per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM e per valutare rapidamente l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Inoltre, descriviamo un metodo basato su EM per confermare la presenza di grafene visualizzando il suo caratteristico modello di diffrazione. Infine, dimostriamo l'utilità di questi supporti di grafene ricostruendo rapidamente una mappa di densità con risoluzione di 2,7 Å di un complesso Cas9 utilizzando un campione puro a una concentrazione relativamente bassa.
Introduction
La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) si è evoluta in un metodo ampiamente utilizzato per la visualizzazione di macromolecole biologiche1. Alimentata dai progressi nel rilevamento diretto degli elettroni 2,3,4, nell'acquisizione dati5 e negli algoritmi di elaborazione delle immagini 6,7,8,9,10, la crioEM è ora in grado di produrre strutture 3D a risoluzione quasi atomica di un numero in rapida crescita di macromolecole11. Inoltre, sfruttando la natura a singola molecola dell'approccio, gli utenti possono determinare strutture multiple da un singolo campione 12,13,14,15, evidenziando la promessa di utilizzare i dati generati per comprendere insiemi strutturali eterogenei 16,17. Nonostante questi progressi, persistono colli di bottiglia nella preparazione della griglia dei campioni criogenici.
Per la caratterizzazione strutturale mediante crioEM, i campioni biologici devono essere ben dispersi in soluzione acquosa e quindi devono essere congelati attraverso un processo chiamato vetrificazione18,19. L'obiettivo è quello di catturare le particelle in uno strato uniformemente sottile di ghiaccio vetrificato sospeso attraverso fori regolarmente distanziati che sono tipicamente tagliati in uno strato di carbonio amorfo. Questa lamina di carbonio amorfo modellata è supportata da una griglia TEM che porta una maglia di barre di supporto in rame o oro. Nei flussi di lavoro standard, le griglie vengono rese idrofile utilizzando un trattamento al plasma a scarica luminosa prima dell'applicazione del campione. Il liquido in eccesso viene tamponato con carta da filtro, consentendo alla soluzione proteica di formare un sottile film liquido attraverso i fori che può essere prontamente vetrificato durante il surgelaggio. Le sfide più comuni includono la localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua (AWI) e la successiva denaturazione20,21,22 o l'adozione di orientamenti preferenziali 23,24,25, l'aderenza delle particelle alla lamina di carbonio piuttosto che migrare nei fori e il raggruppamento e l'aggregazione delle particelle all'interno dei fori 26. Lo spessore non uniforme del ghiaccio è un'altra preoccupazione; Il ghiaccio spesso può provocare livelli più elevati di rumore di fondo nelle micrografie a causa dell'aumento della dispersione di elettroni, mentre il ghiaccio estremamente sottile può escludere particelle più grandi27.
Per affrontare queste sfide, è stata utilizzata una varietà di sottili film di supporto per rivestire le superfici della griglia, consentendo alle particelle di riposare su questi supporti e, idealmente, evitare interazioni con l'interfaccia aria-acqua. I supporti in grafene si sono dimostrati molto promettenti, in parte grazie alla loro elevata resistenza meccanica unita alla loro minima sezione trasversale di scattering, che riduce il segnale di fondo aggiunto dallo strato di supporto28. Oltre al suo contributo minimo al rumore di fondo, il grafene presenta anche una notevole conduttività elettrica e termica29. È stato dimostrato che le griglie rivestite di grafene e ossido di grafene producono una maggiore densità di particelle, una distribuzione più uniforme delle particelle30 e una localizzazione ridotta all'AWI22. Inoltre, il grafene fornisce una superficie di supporto che può essere ulteriormente modificata per: 1) regolare le proprietà fisico-chimiche della superficie della griglia attraverso la funzionalizzazione 31,32,33; o 2) agenti leganti di coppia che facilitano la purificazione di affinità delle proteine di interesse 34,35,36.
In questo articolo, abbiamo modificato una procedura esistente per il rivestimento delle griglie cryoEM con un singolo strato uniforme di grafene30. Le modifiche mirano a ridurre al minimo la gestione della rete in tutto il protocollo, con l'obiettivo di aumentare la resa e la riproducibilità. Inoltre, discutiamo il nostro approccio per valutare l'efficacia di vari trattamenti UV/ozono nel rendere idrofile le griglie prima dell'immersione. Questa fase della preparazione dei campioni crioEM utilizzando griglie rivestite di grafene è fondamentale e abbiamo trovato utile il nostro metodo semplice per quantificare l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo l'utilità dell'impiego di griglie rivestite di grafene per la determinazione della struttura generando una ricostruzione 3D ad alta risoluzione di S. pyogenes Cas9 cataliticamente inattivo in complesso con RNA guida e DNA bersaglio.
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Protocol
1. Preparazione del grafene CVD
- Preparare la soluzione di incisione al grafene come descritto di seguito.
- Sciogliere 4,6 g di persolfato di ammonio (APS) in 20 mL di acqua di grado molecolare in un becher da 50 mL per una soluzione 1 M e coprire con un foglio di alluminio. Lasciare che l'APS si dissolva completamente mentre si procede al passaggio 1.2.
- Preparare una sezione di grafene CVD per il rivestimento in metacrilato di metile (MMA). Taglia con cura una sezione quadrata di grafene CVD. Trasferire il quadrato su un vetrino coprioggetto (50 mm x 24 mm) all'interno di una capsula di Petri pulita e coprire durante il trasporto alla centrifuga.
NOTA: Un quadrato di 18 mm x 18 mm dovrebbe produrre 25-36 griglie rivestite di grafene.
2. Rivestimento del grafene CVD con MMA
- Impostare le impostazioni della centrifuga su una centrifuga ad alta velocità di 60 s a 2.500 giri/min. Posizionare con cautela il grafene CVD sul mandrino di dimensioni appropriate.
NOTA: Idealmente, il grafene CVD si estenderà di 1-2 mm oltre il bordo del mandrino selezionato per impedire l'aspirazione di MMA nel sistema del vuoto. - Premere il pulsante Take/Absorb per innestare la pompa del vuoto e fissare il grafene CVD al mandrino. Applicare MMA al centro del quadrato di grafene CVD, chiudere il coperchio e premere immediatamente il pulsante Start/Stop . Per un quadrato di 18 mm x 18 mm di grafene CVD, sono sufficienti 40 μL di MMA.
- Una volta che la rotazione si è fermata, disinnestare la pompa del vuoto e recuperare con cautela il grafene CVD rivestito di MMA con una pinzetta. Capovolgere il grafene CVD in modo che il lato rivestito in MMA sia rivolto verso il basso e riposizionarlo sul vetrino coprioggetti.
3. Incisione al plasma del retro in grafene
- Trasferire il grafene CVD sul vetrino coprioggetti nello scaricatore di incandescenza e scaricarlo per 30 s a 25 mA utilizzando una pinzetta a punta piatta.
- Riportare il grafene CVD sul vetrino coprioggetto nella capsula di Petri e coprire durante il trasporto nell'area di incisione del rame. Il rivestimento MMA proteggerà lo strato superiore di grafene dall'incisione al plasma.
4. Taglio di quadrati di grafene CVD rivestiti in MMA delle dimensioni di una griglia
- Usa due paia di pinzette per sostenere il quadrato di grafene CVD. Prendere nota dell'orientamento del quadrato di grafene CVD, tenere il lato MMA rivolto verso l'alto mentre è attaccato alle pinzette (CRITICAL).
- Taglia il grafene CVD in quadrati di circa 3 mm x 3 mm. Usa due serie di pinze ad azione inversa per questo passaggio per tenere il quadrato di grafene CVD con il lato destro rivolto verso l'alto e ancorarlo in posizione, e anche per tenere il bordo di un quadrato di 3 mm x 3 mm dopo averlo tagliato lontano dal resto del quadrato.
5. Dissolvenza del substrato di rame dal grafene CVD rivestito di MMA
- Far galleggiare con cura ogni quadrato di 3 mm x 3 mm nella soluzione APS. Entrare in contatto con la superficie della soluzione APS prima di rilasciare ogni quadrato. Inclinare il becher in modo che ogni quadrato possa essere posizionato nella soluzione con un angolo poco profondo; In questo modo si garantisce che il quadrato non affondi.
- Coprire il becher con un foglio di alluminio e incubare per una notte a 25 °C.
6. Rimozione di pellicole MMA/grafene dall'APS
- Utilizzare un vetrino coprioggetti di dimensioni 12 mm x 50 mm ed estrarre i quadrati MMA/grafene dall'APS immergendo delicatamente il vetrino coprioggetti verticalmente nell'APS e quindi spostando lateralmente il vetrino coprioggetti in modo che sia adiacente a un quadrato MMA/grafene galleggiante.
- Rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto e assicurarsi che il quadrato aderisca completamente al lato del vetrino coprioggetto al momento della rimozione.
- Trasferire i quadrati di MMA/grafene in un becher pulito da 50 ml riempito con acqua di grado molecolare per 20 minuti. Immergere delicatamente il vetrino coprioggetto con un quadrato MMA/grafene attaccato verticalmente nell'acqua e assicurarsi che il quadrato si stacchi dal vetrino coprioggetto durante l'interazione con la superficie dell'acqua. Ripeti l'operazione per tutti i quadrati MMA/grafene.
7. Adesione del grafene alle griglie
- Usando una pinzetta ad azione negativa, immergi delicatamente una griglia verticalmente nell'acqua con il lato in carbonio rivolto verso un quadrato galleggiante MMA/grafene. Una volta a contatto con il quadrato, rimuovere con cautela la griglia e assicurarsi che il quadrato aderisca completamente al lato in carbonio della griglia al momento della rimozione. Ridurre al minimo il movimento laterale della griglia quando è immersa in acqua per evitare di danneggiare i quadrati della griglia (CRITICAL).
- Posizionare le griglie su un vetrino coprioggetti pulito con il lato MMA/grafene rivolto verso l'alto e asciugare all'aria per 1 o 2 minuti. Trasferire le griglie rivestite in grafene/MMA su una piastra riscaldante impostata a 130 °C utilizzando una pinzetta a punta piatta.
- Coprire con la parte superiore di una capsula di Petri di vetro e incubare per 20 min. Togliere dal fuoco e raffreddare a temperatura ambiente per 1 o 2 minuti.
ATTENZIONE: Prestare attenzione poiché la parte superiore della piastra di Petri sarà estremamente calda.
8. Sciogliere l'MMA con l'acetone
- Trasferire l'intero vetrino coprioggetti in una capsula di Petri riempita con 15 ml di acetone. Incubare per 30 min.
- Utilizzando una pipetta sierologica di vetro pulita, trasferire l'acetone, in cui sono state incubate le griglie, in un contenitore per rifiuti. Aggiungere con cautela 15 ml di acetone fresco alla capsula di Petri utilizzando una pipetta sierologica di vetro pulita. Incubare per 30 min.
- Ripetere questi passaggi di lavaggio per un totale di 3 lavaggi con acetone.
9. Rimozione dell'acetone residuo con isopropanolo
- Dopo 3 lavaggi con acetone, rimuovere l'acetone e sostituirlo con 15 mL di isopropanolo utilizzando una pipetta sierologica di vetro pulita. Incubare per 20 min.
- Ripetere 3 volte per un totale di 4 lavaggi con isopropanolo. Rimuovere con cautela le griglie dall'isopropanolo e asciugare all'aria su un vetrino coprioggetto pulito usando una pinzetta.
NOTA: L'isopropanolo residuo può rendere difficile il rilascio delle griglie dalle pinzette. Entrare in contatto tra la griglia e il vetrino coprioggetto pulito prima di rilasciare la griglia dalle pinzette può alleviare questo problema. - Evaporare le sostanze organiche residue trasferendo il vetrino coprioggetto con griglie rivestite di grafene su una piastra riscaldante impostata a 100 °C per 10 min. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare sottovuoto fino all'uso.
10. Trattamento UV/ozono di griglie rivestite di grafene
- Usando una pinzetta ad azione inversa, posiziona delicatamente le griglie in un'area di illuminazione pulita di un detergente UV/ozono con il lato rivestito di grafene rivolto verso l'alto.
- Chiudere l'area di illuminazione e accendere la macchina. Ruotare la manopola dell'ora sull'ora di trattamento designata per iniziare il trattamento UV/ozono delle griglie.
NOTA: La durata del trattamento è un parametro regolabile, con un trattamento eccessivo che potrebbe danneggiare la griglia. Han et al.30 raccomandano 10 minuti di trattamento UV/ozono e abbiamo anche trovato un trattamento di 10 minuti sufficiente. Vedere il passaggio 12 per indicazioni sulla regolazione di questo tempo di trattamento. - Procedere direttamente all'immersione di un campione crioEM sulle griglie trattate seguendo le fasi di immersione come descritto in Koh et al.37.
NOTA: Gli idrocarburi atmosferici possono accumularsi sulla superficie della griglia dopo il trattamento UV/ozono e aumentare l'idrofobicità della superficie del grafene38,39. Per evitare ciò, immergere immediatamente le griglie trattate con UV/ozono. Può essere vantaggioso trattare le griglie UV/ozono in lotti, ad esempio, trattare sei griglie UV/ozono e immergere immediatamente quelle sei griglie, quindi trattare UV/ozono un secondo lotto di griglie, seguito dall'immersione del secondo lotto.
11. Acquisizione di un'immagine di diffrazione
- Assicurarsi che il microscopio sia ben sintonizzato con l'illuminazione parallela stabilita e impostare la sfocatura finale a -0,2 μm.
- Inserire completamente lo schermo fluorescente e l'arresto del raggio. Entra in modalità diffrazione per visualizzare chiaramente i punti di diffrazione.
- Acquisisci un'immagine utilizzando una telecamera CCD e valutala utilizzando un software di analisi delle immagini.
NOTA: I punti di diffrazione più facilmente osservabili e identificabili generati da un monostrato di grafene sono 6 punti corrispondenti a una frequenza spaziale di 2,13 Å. Utilizzare uno strumento di misurazione per stimare la distanza dal centro del fascio diffratto a uno di questi punti di diffrazione in unità reciproche. In particolare 2,13 Å
0,47 Å-1.
0,47 Å-1.12. Valutazione dell'idrofilia della rete
- Preparare la configurazione dell'imaging. Individua un supporto per telefono, una superficie di imaging da tavolo, un telefono con fotocamera, un vetrino coprioggetti e una pellicola di paraffina. Le immagini mostrate qui sono state ottenute utilizzando un supporto per telefono e una superficie di imaging da tavolo che sono stati stampati in 3D utilizzando i file .stl forniti, ottenendo misurazioni dell'angolo di contatto più facilmente riproducibili e quantificabili (Figura supplementare 1A).
- Stendere un vetrino coprioggetto sulla superficie piana, quindi tagliare un quadrato di 1 cm per 1 cm di pellicola di paraffina e posizionarlo sul vetrino. Posizionare il telefono sul supporto, orientando il telefono in modo che la fotocamera sia in piano con il vetrino coprioggetti. Fissare il telefono in questa posizione utilizzando elastici (Figura supplementare 1B). Scattare una foto di esempio per verificare che la fotocamera sia allineata con la superficie di imaging.
- Subito dopo il trattamento UV/ozono delle griglie rivestite di grafene, posizionare una singola griglia sul quadrato di pellicola di paraffina sul vetrino coprioggetto. Assicurati che il lato del grafene sia rivolto verso l'alto. Aggiungere una goccia d'acqua da 2 μL al centro della superficie della griglia con una pipetta e scattare immediatamente una foto.
NOTA: Ripetere questo passaggio dopo: i) gli intervalli desiderati di trattamento UV/ozono per determinare una durata sufficiente del trattamento; o ii) intervalli di tempo desiderati dopo il trattamento UV/ozono per misurare quanto tempo dopo il trattamento la superficie della griglia mantiene il suo carattere idrofilo. - Calcola gli angoli di contatto dalle foto importandole in ImageJ43 e utilizzando il plug-in dell'angolo di contatto.
13. Analisi di singole particelle del set di dati complesso dCas9
NOTA: Tutta l'elaborazione delle immagini descritta in questo protocollo è stata eseguita utilizzando cryoSPARC versione 4.2.1.
- Pre-elaborazione dei filmati utilizzando i processi di correzione del movimento delle patch e di stima CTF delle patch. Eseguire il prelievo di particelle utilizzando il processo di selezione BLOB, utilizzando un blob sferico di diametro compreso tra 115 Å e 135 Å.
- Estrarre le particelle utilizzando il lavoro Estrai da micrografie, utilizzando il coefficiente di correlazione normalizzato (NCC) e le soglie di potenza che si ottengono circa 200-300 particelle per micrografia. Si noti che le soglie appropriate e il numero di particelle risultante possono variare e gli utenti devono ispezionare la qualità del prelievo attraverso una serie di micrografie per identificare le condizioni adatte.
- Eseguire ricostruzioni iniziali multiclasse utilizzando il processo di ricostruzione Ab-initio, che richiede tre classi. Due delle tre classi conterranno probabilmente particelle non Cas9, compresi i contaminanti superficiali. Selezionare la classe simile a dCas9 per un'ulteriore elaborazione.
NOTA: Ulteriori cicli di ricostruzione Ab-initio multiclasse o raffinamento eterogeneo possono essere applicati per perfezionare ulteriormente la pila di particelle. - Eseguite l'affinamento 3D utilizzando il lavoro di rifinitura non uniforme selezionando i parametri di default. Stimare la risoluzione della ricostruzione utilizzando i lavori di convalida (FSC) e ThreeDFSC, utilizzando le mappe e la maschera del perfezionamento 3D finale.
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Representative Results
La fabbricazione di successo di griglie crioEM rivestite di grafene utilizzando l'apparecchiatura (Figura 1) e il protocollo (Figura 2) qui delineati si tradurrà in un monostrato di grafene che copre i fori della lamina che può essere confermato dal suo caratteristico modello di diffrazione. Per promuovere l'adsorbimento delle proteine sulla superficie del grafene, il trattamento UV/ozono può essere utilizzato per rendere la superficie idrofila installando gruppi funzionali contenenti ossigeno. Tuttavia, i contaminanti idrocarburici presenti nell'aria possono adsorbirsi sulla superficie del grafene già 5 minuti dopo il trattamento UV/ozono e contrastare questo effetto38,39. È importante sottolineare che sia la durata del trattamento UV/ozono che il tempo trascorso tra il trattamento e l'immersione possono influire sulla qualità del campione. Dimostriamo questi effetti utilizzando un metodo semplice per valutare il carattere idrofilo della griglia rivestita in base all'angolo di contatto della superficie (Figura 3; vedere il punto 12).
Per dimostrare l'uso di supporti di grafene nella crioEM a singola particella, abbiamo applicato un'endonucleasi di DNA guidata da RNA cataliticamente inattiva S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 in complesso con sgRNA e DNA bersaglio su griglie rivestite di grafene, ha raccolto un set di dati cryoEM da queste griglie e ha eseguito l'analisi di singole particelle7. Le griglie rivestite di grafene contenevano costantemente ~300 particelle per micrografia con un ingrandimento di 0,654 Å/pix utilizzando un microscopio da 300 keV dotato di un rivelatore di elettroni diretti K3 (Figura 4A-E). Una sessione di raccolta dati di 8 ore con un'inclinazione del palco di +18° ha prodotto 2.963 filmati e 324.439 particelle in una pila finale curata. Utilizzando queste particelle, abbiamo generato una ricostruzione 3D che, una volta perfezionata, ha prodotto una mappa di densità con una risoluzione stimata di 2,7 Å e un adeguato campionamento angolare per evitare artefatti anisotropi (Figura 5). Un modello atomico (PDB 6o0z)41 è stato agganciato a questa mappa, e perfezionato usando ISOLDE42. I residui R63-L82 di questo modello atomico adattato sono visualizzati con la raffinata mappa di densità cryoEM, che evidenzia la densità della catena laterale risolta (Figura 5B). Quando si confronta lo stesso campione e la stessa concentrazione (250 ng/μL) applicati a griglie identiche prive di grafene, non sono state osservate particelle (Figura 4F,G). Questa osservazione evidenzia l'efficacia del supporto in grafene nel consentire la visualizzazione di particelle da campioni a bassa concentrazione.
Figura 1: Attrezzatura necessaria. Attrezzature e strumenti di laboratorio necessari per la fabbricazione di griglie di grafene utilizzando il protocollo descritto in questo articolo. Gli articoli e la loro quantità sono mostrati ed etichettati di conseguenza. I reagenti necessari che non sono mostrati includono: grafene CVD, metilmetacrilato EL-6 (MMA), persolfato di ammonio (APS), acetone, isopropanolo, etanolo, acqua di grado molecolare. Gli strumenti necessari che non sono mostrati includono: spin coater, scaricatore di bagliore, piastra riscaldante, essiccatore sottovuoto e termometro. Tutti gli elementi richiesti sono dettagliati nell'Indice dei materiali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema del processo di fabbricazione della griglia di grafene. Il grafene è rivestito con un sottile strato di metilmetacrilato EL-6 (MMA) utilizzando uno spin coater (fase 2). Il grafene sul lato opposto della lamina di rame viene rimosso tramite incisione al plasma (fase 3). Il persolfato di ammonio (APS) viene quindi utilizzato per incidere il rame (passaggi 4-5). La pellicola MMA-grafene viene posizionata sulla superficie della griglia (passaggio 6-7). Infine, l'MMA viene sciolto durante una serie di lavaggi con solventi organici (passaggi 8-9). I passaggi indicati sopra le frecce corrispondono ai passaggi numerati descritti nella sezione dei protocolli. Questo metodo è stato adattato da Han et al.30. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione dell'idrofilia superficiale della griglia in funzione della durata del trattamento UV/ozono e del tempo trascorso dopo il trattamento. (A) Angoli di contatto misurati tracciati in funzione della durata del trattamento. La diminuzione degli angoli di contatto è coerente con l'aumento dell'idrofilia (griglia non trattata: 78°; 20 min: 37°). Angoli di contatto misurati con ImageJ43. (B) Angoli di contatto misurati tracciati in funzione del tempo, post-trattamento (0 min: 45°; 60 min: 74°). La griglia misurata nel decorso del tempo post-trattamento è stata trattata con raggi UV/ozono per 12 minuti, come indicato dall'asterisco. Ogni misurazione post-trattamento è stata eseguita sulla stessa griglia, con il campione rimosso assorbendo tra una misurazione e l'altra. Si prevede che gli angoli di contatto specifici misurati varino in funzione delle condizioni ambientali del laboratorio e si consiglia agli utenti di eseguire esperimenti simili nei loro laboratori per identificare le condizioni adatte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative di griglie di controllo rivestite di grafene e griglie di controllo non rivestite. (A-C) Immagini rappresentative dell'atlante, del quadrato della griglia e del foro di lamina di griglie di carbonio bucato rivestite di grafene scattate su un microscopio da 300 keV dotato di un rivelatore di elettroni diretti K3. (D) Micrografia CryoEM di S. pyogenes dCas9 in complesso con sgRNA e DNA bersaglio (complesso alla concentrazione di 250 ng/μL) su griglia di carbonio bucato rivestita di grafene. (E) Immagine di diffrazione da griglia ripresa in pannelli (A-D). La freccia arancione indica una posizione corrispondente a una frequenza spaziale di 2,13 Å. Un campione identico a quello del pannello (D) è stato applicato a (F) trattamento UV/ozono e (G) griglie di carbonio bucato scaricate senza grafene. Le micrografie CryoEM visualizzate sono rappresentative di ciascuna griglia e non mostrano particelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Ricostruzione CryoEM di un complesso Cas9 da griglie rivestite di grafene. (A) Mappa di densità CryoEM dalla ricostruzione 3D del dCas9 di S. pyogenes in complesso con sgRNA e DNA bersaglio. (B) I residui R63-L82 di un modello montato sono raffigurati all'interno della densità semitrasparente di crioEM, con un sottoinsieme di catene laterali visibili etichettate. (C) Curve di correlazione del guscio di Fourier (FSC) delle mappe non mascherate, debolmente e strettamente mascherate. (D) Istogramma e grafico FSC direzionale basato sul metodo 3DFSC23. Per ulteriori informazioni, vedere la Figura 2 supplementare e il passaggio 13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 1 supplementare: Supporto per imaging dell'angolo di contatto. (A) Un supporto per fotocamera stampato in 3D e un supporto per imaging da tavolo per fissare la fotocamera in una posizione che allinea la fotocamera in piano con il vetrino coprioggetto. (B) La griglia viene posizionata sul vetrino coprioggetto sopra un pezzo quadrato di pellicola di paraffina di 1 cm x 1 cm. Il supporto per immagini raffigurato è stato stampato in 3D utilizzando i file .stl forniti (Supplementary Coding File 1 e Supplementary Coding File 2) e può essere facilmente modificato per adattarsi alla maggior parte dei dispositivi. Fare clic qui per scaricare il file.
Figura 2 supplementare: Flusso di lavoro per l'elaborazione delle immagini. Flusso di lavoro di elaborazione per il complesso dCas9. Vengono indicati i nomi dei processi, i dettagli dei lavori e i parametri non predefiniti (in corsivo). Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 1: Vengono forniti file CAD stereolitografici in formato STL per facilitare la stampa 3D del supporto della fotocamera (camera_stand_v1.stl). Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 2: I file CAD stereolitografici in formato STL sono forniti per facilitare la stampa 3D del supporto per imaging da tavolo (slide_mount_v1.stl) e fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
La preparazione dei campioni CryoEM comporta una serie di sfide tecniche, con la maggior parte dei flussi di lavoro che richiedono ai ricercatori di manipolare manualmente le griglie fragili con estrema cura per evitare di danneggiarle. Inoltre, l'idoneità di qualsiasi campione alla vetrificazione è imprevedibile; Le particelle spesso interagiscono con l'interfaccia aria-acqua o con la lamina di supporto solida che si sovrappone alle griglie, il che può portare le particelle ad adottare gli orientamenti preferiti o a non riuscire a entrare nei fori di imaging a meno che non vengano applicate concentrazioni proteiche molto elevate24. La sovrapposizione di griglie crioEM bucherellate con un monostrato continuo di grafene si è dimostrata estremamente promettente nel migliorare la distribuzione delle particelle sulle micrografie, nell'aumentare il numero di particelle a basse concentrazioni e nel ridurre gli orientamenti preferiti guidati dalle interazioni all'interfaccia aria-acqua30.
Un limite dei protocolli di rivestimento in grafene esistenti per le griglie crioEM è l'ampia manipolazione manuale richiesta per il processo di rivestimento, che può compromettere la qualità e aumentare la variabilità da rete a griglia. In questo lavoro descriviamo lievi modifiche ad un protocollo esistente per il rivestimento di griglie crioEM con un monostrato di grafene30.
I passaggi critici all'interno di questo protocollo includono il rivestimento del grafene CVD con MMA, la dissoluzione del substrato di rame grafene CVD in APS e l'applicazione del grafene alle griglie crioEM. Abbiamo modificato il protocollo originale per ridurre al minimo le manipolazioni manuali delle griglie rivestite scambiando i solventi all'interno della stessa capsula di Petri, invece di gestire e trasferire singolarmente le griglie in un nuovo contenitore di solventi per ogni fase di lavaggio, con l'obiettivo di aumentare la resa di griglie intatte, di alta qualità e rivestite di grafene. Mentre ci siamo sforzati di ridurre al minimo le manipolazioni delle griglie rivestite di grafene, riconosciamo che l'applicazione manuale di singoli quadrati di grafene alle griglie cryoEM è intrinsecamente impegnativa e che è prevista una certa variabilità da griglia a griglia.
Le griglie rivestite di grafene richiedono in genere un trattamento UV/ozono per rendere la superficie idrofila per l'applicazione del campione. La durata del trattamento UV/ozono e il tempo trascorso dopo il trattamento e prima dell'immersione possono influire sull'idrofilia della griglia e, in ultima analisi, sulla qualità del campione. Oltre al protocollo di fabbricazione della griglia, descriviamo una tecnica per valutare l'idrofilia della griglia dopo il trattamento UV/ozono. Nella procedura, l'angolo di contatto superficiale di un campione applicato viene utilizzato come indicatore del carattere idrofilo della griglia rivestita 20,44. Vengono forniti progetti per stampare in 3D a basso costo un supporto per imaging a griglia personalizzato che utilizza una semplice fotocamera del telefono cellulare per stimare l'angolo di contatto della superficie.
Infine, descriviamo i risultati ottenuti utilizzando questo protocollo per determinare la struttura crioEM 2.7 Å dell'endonucleasi del DNA guidato da RNA cataliticamente inattivo, S. pyogenes Cas9 in complesso con sgRNA e DNAbersaglio 40. In assenza di grafene, non sono state osservate particelle nei fori di lamina alle concentrazioni complesse utilizzate (250 ng/μL). Al contrario, le griglie rivestite di grafene hanno perforato particelle ad alta densità, consentendo una facile ricostruzione 3D di una mappa ad alta risoluzione da 2.961 micrografie. Nel loro insieme, questi dati evidenziano il valore dell'applicazione di monostrati di grafene alle griglie cryoEM per l'analisi di singole particelle.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Acknowledgments
I campioni sono stati preparati e sottoposti a imaging presso la CryoEM Facility di MIT.nano su microscopi acquisiti grazie alla Arnold and Mabel Beckman Foundation. I dispositivi di imaging dell'angolo di contatto sono stati stampati presso il Metropolis Maker Space del MIT. Ringraziamo i laboratori di Nieng Yan e Yimo Han e il personale del MIT.nano per il loro supporto durante l'adozione di questo metodo. In particolare, estendiamo i nostri ringraziamenti alle dottoresse Guanhui Gao e Sarah Sterling per le loro approfondite discussioni e feedback. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e NSF-CAREER grant 2046778. La ricerca nel laboratorio di Davis è sostenuta dalla Alfred P. Sloan Foundation, dal James H. Ferry Fund, dalla MIT J-Clinic e dalla Whitehead Family.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
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