Summary
Aqui, mostramos os procedimentos para knockdown do FAM83A ; os ensaios para detectar seus efeitos sobre a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical; e a sensibilização dessas células à cisplatina. Este estudo fornece um gene alvo promissor para o câncer cervical e uma referência para futuras pesquisas de drogas.
Abstract
A exploração de genes-alvo tumorais é de suma importância para a prevenção e tratamento do câncer cervical. Neste estudo, descrevemos as etapas envolvidas na identificação de um gene alvo tumoral FAM83A no câncer cervical. Primeiro, o conjunto de dados do Atlas do Genoma do Câncer foi empregado para validar a expressão e o significado prognóstico de FAM83A em mulheres. Um pequeno RNA de interferência (siRNA) foi usado para knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . Em seguida, a coloração de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi conduzida para determinar os efeitos sobre a capacidade de proliferação das células tumorais. Ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa foram realizados para avaliar a capacidade de migração e invasão de células tumorais.
Western blotting foi usado para quantificar os níveis de proteína relacionada à apoptose. A coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Além disso, a intervenção com cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP) foi utilizada para avaliar o potencial terapêutico do gene alvo. Citometria de fluxo e ensaios de formação de colônias foram conduzidos para validar ainda mais as características anticâncer do gene. Como resultado, o knockdown de FAM83A mostrou inibir a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical e sensibilizar essas células à cisplatina. Essas metodologias abrangentes validam coletivamente o FAM83A como um gene-alvo associado ao tumor, sendo promissor como um alvo terapêutico potencial na prevenção e tratamento do câncer cervical.
Introduction
O câncer do colo do útero é uma preocupação mundial, pois é um dos principais tipos de neoplasia ginecológica no mundo e é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer emmulheres1. A cirurgia radical e a quimiorradioterapia estão associadas a altas taxas de cura no estágio primário. No entanto, os resultados do tratamento para pacientes em estágio avançado de câncer de colo uterino que desenvolvem doença metastática são muito desfavoráveis2. Portanto, é crucial compreender melhor os mecanismos biológicos subjacentes à migração e invasão de células cancerosas do colo do útero e identificar potenciais alvos terapêuticos para a prevenção e tratamento desta doença.
Identificar genes-alvo envolvidos na progressão do câncer e encontrar maneiras de inibir sua expressão ou ação apresentam opções promissoras de tratamento. Neste estudo, identificamos FAM83 como um gene causador de câncer e investigamos seus efeitos inibitórios em células C33a e HeLa. Os oncogenes da família FAM83 (FAM83A-H) são amplamente relatados em cânceres humanos 3,4. Recentemente, foi relatado que o FAM83A é upregulated em cânceres de pulmão5, mama6, ovário7 e pâncreas8, indicando que o FAM83A desempenha um papel importante na progressão do câncer por meio da promoção da proliferação, invasão, características semelhantes a células-tronco e resistência a drogas nas células tumorais. É importante ressaltar que o FAM83A foi identificado como um dos novos genes candidatos associados à progressão da lesão cervical e carcinogênese9. Apesar da confirmação da expressão elevada de FAM83A em células humanas de câncer cervical, o impacto específico e os mecanismos subjacentes de FAM83A no câncer cervical permanecem obscuros.
Neste estudo, delineamos os protocolos envolvidos na identificação de FAM83A como um gene alvo tumoral em câncer cervical e usamos um pequeno RNA de interferência (siRNA) para o knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . A coloração com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi realizada para determinar os efeitos sobre a proliferação de células tumorais, enquanto os ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa ajudaram a avaliar a migração e a capacidade de invasão de células tumorais.
Western blotting foi realizado para determinar os níveis de proteínas relacionadas à apoptose, e a coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Assim, relatamos que o FAM83A desempenha um papel crítico na proliferação celular, metástase e invasão no câncer cervical. Através da disfunção mitocondrial e apoptose associadas à via PI3K/AKT, o knockdown FAM83A sensibilizou células de câncer cervical à cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP). Este estudo fornece um novo alvo para o câncer do colo do útero e possivelmente outros cânceres e uma referência para o desenvolvimento de estratégias para superar a resistência das células cancerosas a certas drogas quimioterápicas.
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Protocol
O estudo estava completamente de acordo com as diretrizes de publicação fornecidas pelo TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Fonte de dados e análise bioinformática
- Obter dados de sequenciamento de RNA do banco de dados (https://cancergenome.nih.gov) do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) para análise de agrupamento. Use o GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), uma ferramenta baseada na web para recalcular dados brutos de RNA-Seq de amostras de projetos TCGA, para rastrear alvos de drogas candidatas ao câncer com um pipeline de processamento padrão.
NOTA: O site do GEPIA está disponível gratuitamente para todos os usuários. - Acesse a página inicial do site do GEPIA e clique em Análise de Tipo de Câncer, selecione a opção Análise Diferencial de genes e defina os seguintes parâmetros: Nome do câncer = CESE (definido como carcinoma de células escamosas do colo do útero e adenocarcinoma endocervical nesta página), |Log2FC| Ponto de corte = 1, valor de q Cutoff = 0,01, Métodos Diferenciais = ANOVA e Distribuição Cromossômica = ambos. Em seguida, clique em Lista para obter uma lista de genes que mostre expressão diferencial entre grupos tumorais e normais.
NOTA: Requer uma extensa revisão da literatura para identificar genes candidatos diferencialmente expressos. Neste estudo, considerando o histórico da literatura disponível, enfocamos o gene tumoral de interesse, FAM83A. - Em seguida, examine a expressão de FAM83A no câncer cervical e tecidos normais usando GEPIA prosseguindo para a opção Expressão DIY no site e selecione Boxplot como o tipo de gráfico. Insira FAM83A no campo de parâmetro do gene e defina os seguintes parâmetros: |Log2FC| Valor de corte = 1; valor de q Ponto de corte = 0,01. Selecione CESE como o nome do câncer e Corresponder dados normais do TCGA para o campo de dados Normal Correspondente , deixando todas as outras configurações como padrão. Clique em Plotar e permitir que o site gere um boxplot representando a expressão diferencial do gene FAM83A ; Salve o boxplot para referência e análise futuras.
- Finalmente, analisar a sobrevida global de pacientes portadoras de tumores com diferentes níveis de expressão de FAM83A no câncer cervical. Navegue até a opção Gráficos de sobrevivência no site, defina o Gene como FAM83A e selecione Sobrevivência global como o tipo de análise. Adicione o nome do tumor CESE, escolha Meses para as Unidades do Eixo e deixe todos os outros parâmetros em suas configurações padrão. Clique em Plotar e deixe o site gerar um gráfico de curva de sobrevivência; Salve este gráfico para referência e análise futuras.
- Levar em consideração tanto a expressão diferencial de FAM83A em tumores quanto sua correlação com a análise de sobrevida de pacientes para identificar FAM83A como um potencial gene alvo terapêutico no câncer cervical.
2. Experimentos baseados em células
- Cultura celular
- Cultura de linhagens tumorais humanas em meio modificado a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO2 .
NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter informações sobre a linha celular e os componentes do meio de cultura.
- Cultura de linhagens tumorais humanas em meio modificado a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO2 .
- Transfecção celular
- Use siRNA para derrubar a expressão de FAM83A nas células.
NOTA: Consulte a Tabela 1 para a sequência específica de siRNA. - Células de sementes em placas de 6 poços e incubar com a mistura de 50 nM si-FAM83A ou siRNA-NC e 8 μL de agente de transfecção ou apenas 8 μL de agente de transfecção por 4-6 h após atingir 50%-70% de confluência. Adicionar apenas DMEM sem soro ao controle negativo.
- Após a incubação, substituir o meio contendo o agente transfeccionista por DMEM + 10% de soro fetal bovino. Além disso, 48 h após a transfecção, tratar com cisplatina 5 μM (DDP) por 24 h como pretendido e colher todas as células para extração de RNA total e análise de qRT-PCR.
- Use siRNA para derrubar a expressão de FAM83A nas células.
3. Detecção de EdU para ensaio de proliferação celular
NOTA: Use o Kit de Proliferação Celular EdU para avaliar a proliferação celular in vitro de acordo com as instruções do fabricante.
- Semeando as células em placas de 6 poços e incubando-as com solução de EdU 10 μM por 2 h. Fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente (TR) e permeabilizar com Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min em TR.
- Remova o tampão de permeabilização e adicione 500 μL de solução de reação 1x. Em seguida, incubar por 30 min no RT no escuro para coloração nuclear.
- Corar células com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e visualizá-las em microscópio de fluorescência com aumento de 200x. Manchar os núcleos das células em proliferação com EdU e examiná-los para fluorescência vermelha.
- Finalmente, utilizar um software para quantificar os resultados contando pelo menos 10 campos aleatórios e calcular as taxas de proliferação usando a razão entre as células fluorescentes-positivas e o total de células.
4. Ensaio de cicatrização de feridas
- Células de sementes em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 105 células por poço.
- Quando as células atingirem 90% de confluência, use uma ponta de micropipeta estéril de 10 μL para criar suavemente um risco linear na monocamada celular. Enxágue suavemente os poços com PBS estéril para remover quaisquer células destacadas e detritos causados por arranhões.
- Além disso, incubar as células em meio contendo 1% de SFB. Em seguida, observar e tirar imagens com o microscópio invertido para a cicatrização da região ferida em 12, 24 e 48 h.
5. Ensaio de inserção de membrana porosa
- Preparar uma suspensão celular em meio de cultura celular na concentração celular desejada (contendo 4 × 104 células), incluindo células C33a transfectadas ou controle e HeLa. Adicione a suspensão celular à câmara superior das inserções de membrana, garantindo uma distribuição uniforme. Adicione o meio completo à câmara inferior.
- Após incubação por 24 h, utilizar álcool metílico e violeta de cristal 0,1% para fixação e coloração das células migratórias para as câmaras inferiores, respectivamente.
- Use um microscópio invertido para tirar imagens e, em seguida, analisar o número de células migratórias contando pelo menos 10 campos aleatórios com ImageJ.
- Para a análise numérica com o ImageJ, abra a imagem no software ImageJ, vá para a guia Imagem no menu da ferramenta, selecione Ajustar e clique em Limite. Ajuste as configurações de limite, se necessário, até que apenas as células fiquem visíveis em um plano de fundo branco.
- Clique em Aplicar na janela Limite para aplicar essas configurações à imagem. Agora, selecione a ferramenta Varinha (rastreamento) na barra de ferramentas (localizada na parte superior da janela).
- Clique na área da imagem onde as células estão localizadas para selecionar todas as células na imagem limitada. Depois que as células estiverem realçadas, vá para Analisar no menu Ferramenta e, em seguida, clique em Analisar partículas. Na janela Analisar partículas, insira o tamanho desejado (por exemplo, 0 - infinito) e os valores de circularidade (por exemplo, 0,00 - 1,00) de acordo com os requisitos experimentais para incluir todas as células na contagem.
- Clique em OK e aguarde até que o software conte as células e que uma nova janela apareça com os resultados da análise.
6. Ensaio de formação de colônias
- A semente 2 × 105 células por poço dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em uma placa de 6 poços com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM por 24 h.
- Após um período de 24 horas de tratamento medicamentoso, separar as células usando tripsina a 0,25% e ressuspendê-las em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de SFB. Semeando as células ressuspensas em uma placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 103 células por poço e, em seguida, incubar em uma incubadora de 5% de CO2 a uma temperatura de 37 °C.
- Após a incubação por ~7-10 dias quando as colônias estiverem visíveis, fixar as células com Polioximetileno a 4% e corá-las com solução corante de Giemsa por 20 min.
- Lave levemente as células e deixe as placas secarem ao ar. Tire imagens dos aglomerados de colônias ao microscópio e conte o número de colônias que contêm mais de 50 células.
7. Análise da despolarização da membrana mitocondrial (MMP) utilizando o corante JC-1
- Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
- Incubar com 1x solução corante JC-1 durante 15-20 minutos a 5% de CO2 a 37 °C utilizando um kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial de acordo com as instruções do fabricante.
- Lave as células e examine-as em microscópio fluorescente com aumento de 200x usando comprimentos de onda de excitação e emissão para JC-1 a ~490 nm e 590 nm, respectivamente. Para visualizar a fluorescência JC-1, use filtros apropriados, como um filtro de excitação azul (450-490 nm) e um filtro de emissão vermelho (passa-longa > 590 nm) para capturar seletivamente o sinal de fluorescência emitido.
8. Análise por citometria de fluxo do PTPm
- Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
- Remova o meio de cultura das células, ressuspenda as células em PBS e adicione 300 μL cada (1x volume) de solução corante Calcein AM e solução de trabalho de resfriamento de fluorescência para cobrir as células uniformemente. Incubar as células a 37 °C em um ambiente protegido à luz por 30-45 min e substituir o meio por meio de cultura fresco pré-aquecido a 37 °C. Incubar as células a 37 °C em um ambiente protegido contra a luz por mais 30 min para garantir a hidrólise completa da Calceína AM por esterases intracelulares, resultando na geração de Calceína verde-fluorescente intracelular.
- Retire o meio de cultura, lave as células 2-3x com PBS e adicione o tampão de detecção. Detectar mPTP celular usando citometria de fluxo e um comprimento de onda de excitação de 488 nm.
9. Citometria de fluxo
- Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
- Após 24 h de tratamento medicamentoso, ressuspenda as células em 200 μL de solução tampão de ligação e misture suavemente 10 μL de Anexina V-FITC e 5 μL de iodeto de propídio (PI) na suspensão celular. Incubar a mistura durante 15 minutos, evitando a luz, e adicionar 300 μL de solução tampão de ligação às células. Detectar apoptose celular usando citometria de fluxo em um comprimento de onda de excitação de 488 nm.
10. Análise RT-PCR
- Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
- Extrair o RNA total das células tumorais usando o reagente de extração de RNA e converter o RNA extraído em DNA complementar (cDNA) com o cDNA Synthesis Mix, incubando a 42 °C por 45 min e depois a 95 °C por 5 min.
- Preparar a mistura de reação de PCR contendo DNA polimerase, nucleotídeos, tampão e os primers gene-específicos projetados. Adicionar o molde de cDNA à mistura de reação para a reação de PCR em tempo real e realizar a PCR no instrumento de PCR quantitativo em tempo real com as seguintes condições de termociclagem: desnaturação a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C para 5 s e 60 °C para 30 s, e o estágio da curva de fusão a 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min e 95 °C por 15 s. Quantificar os níveis de RNAm usando o método 2−ΔΔCq usando GAPDH como controle interno.
OBS: O sistema de reação RT-PCR é mostrado na Tabela 1, e as sequências de primers são mostradas na Tabela 1.- Para calcular o valor de 2−ΔΔCq , meça os valores de Cq para o gene alvo e o gene de referência (GAPDH) nas amostras. Calcular o ΔCq subtraindo o valor de Cq do gene de referência do valor de Cq do gene alvo para cada amostra. Calcular o ΔΔCq subtraindo o ΔCq de uma amostra controle do ΔCq de cada amostra experimental. Finalmente, calcule o valor de 2−ΔΔCq elevando 2 para a potência do valor de ΔΔCq.
Observação : O valor Cq representa o número do ciclo no qual o sinal de fluorescência atinge o limite definido.
- Para calcular o valor de 2−ΔΔCq , meça os valores de Cq para o gene alvo e o gene de referência (GAPDH) nas amostras. Calcular o ΔCq subtraindo o valor de Cq do gene de referência do valor de Cq do gene alvo para cada amostra. Calcular o ΔΔCq subtraindo o ΔCq de uma amostra controle do ΔCq de cada amostra experimental. Finalmente, calcule o valor de 2−ΔΔCq elevando 2 para a potência do valor de ΔΔCq.
11. Análise de Western blot
- Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
- Coletar as células cultivadas e lavá-las com solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) para remover qualquer meio de crescimento residual ou soro. Lisar as células usando RIPA Lysis Buffer contendo fluoreto de fenilmetil sulfonila (PMSF) para liberar as proteínas celulares. Incubar as células no gelo por alguns minutos para garantir a lise completa e centrifugar a 4 °C, 12.000 × g por 15 min. Coletar o sobrenadante para determinar sua concentração de proteínas.
- Determine a concentração de proteína no lisado celular usando um Kit de Ensaio de Proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante. Misture o lisado celular com um tampão de carga e aqueça a mistura a 95-100 °C por 5-10 min para desnaturar as proteínas e garantir uma separação uniforme no gel.
- De cada amostra, carregar 30 μg de proteína total em um gel SDS-PAGE e executar o SDS-PAGE sob uma tensão constante de 80 V. Pare a eletroforese quando o azul de bromofenol atingir o fundo do gel de separação.
- Transfira as proteínas separadas do gel para uma membrana de polivinildifluoreto usando um sistema de transferência úmido em um banho de gelo com uma corrente de 200 mA por 1,5 h.
- Bloquear a membrana com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tween-20 a 0,05% (TBST) por 1 h no TR e incubar durante a noite a 4 °C com os respectivos anticorpos administrados na Tabela de Materiais.
- Lavar a membrana várias vezes com TBST e incubar com os anticorpos secundários (Tabela de Materiais) por 1 h no TR, seguido de lavagem com TBST. Visualize as bandas de proteínas usando um kit de detecção de quimioluminescência aprimorado e um sistema de imagem.
12. Análise estatística
- Como todos os pontos de dados experimentais serão independentes, apresente os dados como média ± DP.
- Utilizar análise de variância (ANOVA) one-way para comparações múltiplas e teste de Dunnett para comparar cada grupo com o grupo controle. Utilizar o teste t de Student (bicaudal não pareado) para comparar dois grupos; consideram P < 0,05 significativo.
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Representative Results
Análise do banco de dados TCGA e validação do PCR
A partir da análise do banco de dados TCGA, realizamos uma análise comparativa dos níveis de expressão de RNAm em 306 amostras de células de câncer cervical e 13 amostras de células normais para investigar a expressão diferencial de FAM83A. O FAM83A foi regulado para cima no câncer cervical, enquanto sua expressão no tecido cervical normal foi desprezível (Figura 1A). Para obter mais informações sobre as implicações prognósticas da expressão de FAM83A , realizamos uma análise da curva de Kaplan-Meier. Surpreendentemente, os pacientes com maior expressão de FAM83A apresentaram sobrevida global marcadamente pior (Figura 1B). Para determinar o papel de FAM83A no câncer cervical, examinamos os níveis de expressão de FAM83A em duas linhagens de células de câncer cervical, HeLa e C33a, bem como em uma linhagem celular cervical imortalizada, End1/E6E7. Usando qRT-PCR, observamos uma superexpressão significativa de FAM83A nas linhagens HeLa e C33a em comparação com a linhagem celular End1/E6E7 (Figura 1C). Esses achados reforçam a importância do FAM83A no contexto do câncer cervical.
Experimentos de proliferação e apoptose para verificar a função biológica do FAM83A no câncer cervical
Para investigar o papel funcional do FAM83A no câncer cervical, utilizamos knockdown de FAM83A mediado por siRNA em células C33a e HeLa (Figura 2A,B). Em seguida, avaliamos o impacto da supressão do FAM83A na proliferação celular. A coloração de EdU revelou que a diminuição da expressão de FAM83A inibiu significativamente a proliferação celular em células C33a e HeLa (Figura 2C-F). Células malignas imortais estão associadas a taxas de apoptose extremamentebaixas10. Portanto, os níveis de proteínas anti e pró-apoptóticas foram avaliados nas células de câncer cervical controle e tratadas com si-FAM83A. Análises de Western blot revelaram que a expressão suprimida de FAM83A aumentou a expressão de Bax e caspase3 clivada (proteínas pró-apoptóticas), diminuiu a expressão de Bcl-2 (proteína antiapoptótica) e aumentou a liberação de Cytc (Figura 2C-E), o que é consistente com a observação de que as proteínas antiapoptóticas regulam a apoptose bloqueando a liberação mitocondrial de Cytc (Figura 2G-J)10. Coletivamente, esses dados sugerem que o FAM83A desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular e apoptose do câncer cervical.
Ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa para verificar a função biológica do FAM83A no câncer cervical
Ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana foram realizados para explorar os efeitos da supressão de FAM83A na migração e invasão de células de câncer cervical. Os resultados revelaram que as células cancerosas do colo do útero com expressão suprimida de FAM83A migraram (Figura 3A-D) e invadiram (Figura 3E-H) de forma menos eficiente que as células controle.
Efeitos na função mitocondrial e na via de sinalização PI3K/AKT
Dado o papel da PI3K/AKT na indução da apoptose celular, nosso objetivo foi determinar se a supressão da expressão de FAM83A inibiria a fosforilação constitutiva da via PI3K/Akt/mTOR no câncer cervical. A supressão de FAM83A inibiu significativamente os níveis de proteína fosforilada chave na via PI3K/Akt/mTOR, incluindo p-PI3K, p-Akt e p-mTOR em células c333a e HeLa (Figura 4A-D). As mitocôndrias são as organelas responsáveis pelo metabolismo celular e indução da apoptose celular. Evidências acumuladas indicam que a apoptose de células cancerosas envolve disfunção mitocondrial através da via mitocondrial intrínseca devido ao aumento da permeabilidade mitocondrial e à liberação de moléculas pró-apoptóticas como Cytc no citoplasma10. A via PI3K/AKT poderia regular a translocação de Bax para as mitocôndrias, induzindo a liberação de Cytc em resposta a estímulos apoptóticos. Portanto, é concebível que os componentes oncogênicos da via de sinalização PI3K-AKT regulem diretamente a apoptose celular, influenciando o comportamento mitocondrial. Assim, um ensaio de poros de transição de permeabilidade mitocondrial de células vivas (PTPm) foi realizado para determinar o status mitocondrial. A abertura do PTPm está associada à morte celular apoptótica e necrótica11. Neste ensaio, um corante verde fluorescente (calceína AM) é retido no citoplasma e nas mitocôndrias quando o PTPm é fechado, enquanto o corante no citoplasma é extinguido por CoCl2, deixando apenas a fluorescência intensiva na mitocôndria. Os resultados revelaram que as populações celulares com intensa fluorescência verde nas mitocôndrias diminuíram significativamente após a supressão do FAM83A, indicando uma mPTP aberta (Figura 4E,F). Além disso, examinamos as alterações no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) usando a coloração JC-1. JC-1 forma agregados (fluorescência vermelha) em células vivas contendo mitocôndrias intactas com alto potencial de membrana e monômeros (fluorescência verde) sob baixa MMP em células apoptóticas. A supressão do FAM83A diminuiu gradualmente a MMP (Figura 4G).
Análise de sensibilidade a drogas para proliferação e invasão
A quimioterapia baseada em cisplatina (DDP) é uma estratégia de tratamento padrão para o câncer cervical. No entanto, a quimiorresistência permanece um desafio. Investigamos o papel do FAM83A no tratamento do câncer cervical com cisplatina. Células HeLa controle, tratadas com si-NC e com si-FAM83A foram tratadas com ou sem cisplatina 5 μM12. Além disso, os efeitos da supressão de FAM83A sobre a viabilidade celular foram avaliados. A DDP induziu um efeito inibitório mais significativo sobre a proliferação de células HeLa após a supressão de FAM83A , em comparação com apenas o tratamento com DDP (Figura 5A e Figura 5C). Após o tratamento de células de câncer cervical com cisplatina 5 μM, a supressão de FAM83A também inibiu a invasão celular (Figura 5B e Figura 5D).
Análise da sensibilidade a drogas para função mitocondrial
Ao tratar células HeLa tratadas com Si-NC e si-FAM83A com ou sem cisplatina 5 μM (DDP), avaliamos o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e avaliamos o dano mitocondrial causado pela morte celular usando a coloração JC-1. A DDP induziu mais danos mitocondriais, como revelado por uma diminuição na porcentagem de monômero JC-1 após o knockdown de FAM83A, em comparação com apenas o tratamento com DDP (Figura 6A e Figura 6D). Após o tratamento das células do câncer cervical com cisplatina 5 μM, o knockdown da FAM83A também inibiu a formação de colônias (Figura 6B e Figura 6E) e aumentou a apoptose celular (Figura 6C e Figura 6F). Além disso, o knockdown de FAM83A na presença de DDP aumentou acentuadamente a expressão de proteínas pró-apoptóticas, Bax e caspase clivada3, promoveu liberação de Cytc e diminuiu a expressão de Bcl-2 (Figura 6G,H). Estes resultados indicaram que o knockdown FAM83A sensibilizou células de câncer cervical à DDP via indução de apoptose.
Figura 1: Superexpressão de FAM83A em células de câncer cervical e correlação com pior prognóstico. (A) Análise em boxplot dos níveis de RNAm de FAM83A em amostras de câncer cervical. (B) Análise de Kaplan-Meier da expressão de FAM83A para determinação da sobrevida global em pacientes com câncer cervical. (C) Níveis relativos de RNAm de FAM83A em linhagens celulares de câncer cervical HeLa e C33a e linhagens humanas imortalizadas de células cervicais End1/E6E7. Os dados são apresentados como média ± DP para três experimentos independentes. *P < 0,05, em comparação com células End1/E6E7 usando ANOVA unidirecional. Abreviações: CESE = Carcinoma epidermóide cervical e adenocarcinoma endocervical; HR = razão de risco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos da supressão do FAM83A sobre a proliferação e apoptose do câncer cervical. As células C33a e HeLa foram transfectadas com siRNAs específicos para FAM83A. Os níveis de mRNA (A,B) de FAM83A foram avaliados em linhagens de células de câncer cervical usando qRT-PCR.A proliferação celular em (C) células C33a e (D) HeLa foi determinada usando o ensaio de EdU. (E,F) As imagens de fluorescência EDU das células C33a e Hela. (G-J) Análise de Western blot para examinar os níveis de proteínas relacionadas à apoptose, incluindo Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 e clivada-caspase-3; O GAPDH foi utilizado como controle de carregamento. Os dados são apresentados como média ± DP para três experimentos independentes. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, em comparação com células controle usando ANOVA unidirecional. Abreviações: NC = controle negativo; EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; CytC = citocromo C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito do FAM83A na migração e invasão de células de câncer cervical in vitro. (A-D) Ensaio de cicatrização de feridas foi realizado para avaliar a migração celular. As imagens foram obtidas às 0, 24 e 48 h. (E-H) Foram realizados ensaios de Transwell para examinar a invasão celular. Barras de escala = 100 μm (E,F). Os dados são apresentados como média ± DP para três experimentos independentes. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, em comparação com células controle usando ANOVA unidirecional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito da supressão do FAM83A na via PI3K/AKT/mTOR e na função mitocondrial. (A-D) Análise de Western blot para determinar os níveis de proteínas da via PI3K/AKT/mTOR em células C33a e HeLa após supressão de FAM83A. (E-H) Análise do potencial de membrana mitocondrial pela coloração JC-1. Os agregados de JC-1 foram corados em vermelho, e os monômeros de JC-1 foram corados em verde, indicando uma menor MMP. (I,J) A permeabilidade mitocondrial foi avaliada usando um kit de PTPm e citometria de fluxo. Barras de escala = 50 μm (E, F). Os dados são apresentados como média ± DP para três experimentos independentes. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, em comparação com células controle usando ANOVA one-way. Abreviações: MMP = potencial de membrana mitocondrial; mPTP = poro de transição da permeabilidade mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos da supressão do FAM83A na inibição por DDP na proliferação celular e invasão de células de câncer cervical. As células HeLa foram transfectadas com si-NC ou si-FAM83A e tratadas com ou sem 5 μM de DDP. (A,C) Efeito do DDP sobre a proliferação celular em células HeLa controladas, tratadas com si-NC e si-FAM83. (B,D) Efeito da DDP sobre a invasão celular em células HeLa de controle, tratadas com si-NC e com si-FAM83. Os dados são apresentados como média ± DP para três experimentos independentes. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, em comparação com as células controle. &&P < 0,01; &&P < 0,001, em comparação com DDP usando ANOVA unidirecional. Abreviaturas: DDP = diaminedicloroplatina; EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeitos da supressão do FAM83A sobre os efeitos do DDP na apoptose em células de câncer cervical. As células HeLa foram transfectadas com si-NC ou si-FAM83A e tratadas com ou sem 5 μM de DDP. (A,D) Análise de MMP pela coloração JC-1. (B,E) Resultados da clonagem de placas. (C,F) A citometria de fluxo detecta taxas de apoptose em diferentes grupos de tratamento. (G,H) Análise de Western blot de proteínas apoptóticas relacionadas à mitocôndria, incluindo Bcl-2, Bax, Cytc e caspase-3 clivada a jusante. O GAPDH foi utilizado como controle de carregamento. Os dados são apresentados como média ± DP para três experimentos independentes. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, em comparação com as células controle. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001, em comparação com DDP usando ANOVA unidirecional. Abreviaturas: DDP = diaminedicloroplatina; EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: SiRNA, primers qRTPCR e configuração da reação qRT-PCR utilizados neste estudo. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
A investigação de genes-alvo tumorais é de extrema importância tanto para a prevenção quanto para o tratamento do câncer cervical. A compreensão dos genes específicos que desempenham um papel significativo no desenvolvimento e progressão do câncer cervical fornece informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes da doença. Além disso, a identificação desses genes-alvo pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e terapias-alvo. Neste estudo, descrevemos o uso da análise de conjunto de dados TCGA para identificar FAM83A como um gene alvo e investigar seu papel mecanicista no câncer cervical. Observamos uma expressão significativamente alta de FAM83A em células de câncer cervical, que está associada a mau prognóstico de pacientes com câncer cervical. Uma série de experimentos baseados em células revelou alta expressão de FAM83A em células de câncer cervical, que desempenha um papel crítico na regulação da proliferação, migração e invasão celular. A supressão da expressão de FAM83A inibiu a proliferação e migração e promoveu apoptose em células de câncer cervical.
A construção de linhagens celulares de câncer cervical knockdown FAM83A é a etapa mais crítica deste estudo. Os siRNAs são projetados e validados de acordo com as sequências gênicas alvo para garantir sua eficácia. Além disso, as linhagens celulares do câncer cervical são transfectadas usando siRNA. A taxa de sucesso da transfecção de plasmídios é crucial para experimentos subsequentes, que requerem controle rigoroso da densidade celular e plasmidial. Além disso, a eficiência da transfecção é observada sob um microscópio de fluorescência para garantir que experimentos subsequentes possam ser realizados. Os resultados de Western blotting e qRT-PCR confirmam que a inibição da FAM83A suprimiu a via PI3K/AKT e induziu disfunção mitocondrial. Hipotetizamos que o mecanismo envolve a inibição da translocação de Bax do citoplasma para a mitocôndria pela PI3K/AKT, o que promove a sobrevivênciacelular13.
Os avanços no tratamento do câncer do colo do útero possibilitaram o desenvolvimento de novas moléculas-alvo. A identificação de um novo oncogene pode ser aplicada terapeuticamente para melhorar o prognóstico clínico das neoplasiascervicais 14,15. Neste estudo, construímos com sucesso um sistema knockdown FAM83A em células HeLa e C33a e verificamos os efeitos do knockdown FAM83A em células de câncer cervical em nível celular. Propomos que a inibição da FAM83A pode ser usada no tratamento do câncer cervical.
No entanto, este estudo apresenta algumas limitações. Primeiro, este estudo só realiza triagem gênica através do banco de dados e carece de dados patológicos de pacientes clínicos. Em segundo lugar, este estudo apenas validou o efeito in vitro, e mais estudos in vivo foram necessários para verificar os resultados. No entanto, os métodos de identificação de genes alvo, knockout gênico e validação celular para identificação de loci terapêuticos direcionados elaborados neste estudo podem fornecer ideias de pesquisa para a descoberta e validação de genes-alvo para outras doenças.
Em resumo, FAM83A foi superexpresso e correlacionado com um pior prognóstico no câncer cervical. FAM83A regula a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical. Supressão da disfunção mitocondrial e apoptose induzida por FAM83A, sensibilizando células de câncer cervical à cisplatina. Esses resultados indicaram que o FAM83A é um alvo de pesquisa adequado para o tratamento do câncer cervical. Este estudo contribuiu para os avanços da quimioterapia adjuvante visando melhorar o prognóstico de pacientes com câncer cervical.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação do Departamento de Ciência e Tecnologia de Jingzhou (nº 2020HC06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
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