Summary
Hier zeigen wir die Verfahren für den FAM83A-Knockdown ; die Assays zum Nachweis seiner Auswirkungen auf die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen; und die Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber Cisplatin. Diese Studie liefert ein vielversprechendes Zielgen für Gebärmutterhalskrebs und eine Referenz für die weitere Medikamentenforschung.
Abstract
Die Erforschung von Tumorzielgenen ist für die Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. In dieser Studie skizzieren wir die Schritte zur Identifizierung eines Tumor-Zielgens FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs. Zunächst wurde der Datensatz des Cancer Genome Atlas verwendet, um die Expression und prognostische Bedeutung von FAM83A bei Frauen zu validieren. Eine kleine interferierende RNA (siRNA) wurde für den Knockdown des FAM83A-Gens in HeLa- und C33a-Zellen verwendet. Als nächstes wurde eine 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Färbung durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Proliferationsfähigkeit der Tumorzellen zu bestimmen. Wundheilungs- und poröse Membraninsert-Assays wurden durchgeführt, um die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen zu bewerten.
Western Blot wurde verwendet, um Apoptose-assoziierte Proteinspiegel zu quantifizieren. Die JC-1-Färbung wurde verwendet, um Veränderungen der mitochondrialen Funktion zu bewerten. Darüber hinaus wurde die Intervention mit Cisplatin (Diamindichlorplatin, DDP) eingesetzt, um das therapeutische Potenzial des Zielgens zu bewerten. Durchflusszytometrie und Koloniebildungsassays wurden durchgeführt, um die krebshemmenden Eigenschaften des Gens weiter zu validieren. Infolgedessen wurde gezeigt, dass der FAM83A-Knockdown die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen hemmt und diese Zellen für Cisplatin sensibilisiert. Diese umfassenden Methoden validieren FAM83A als tumorassoziiertes Zielgen, das als potenzielles therapeutisches Ziel in der Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs vielversprechend ist.
Introduction
Gebärmutterhalskrebs ist ein globales Problem, da es eine der weltweit führenden Arten von gynäkologischen Malignomen ist und die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen ist1. Radikale Operationen und Radiochemotherapie sind mit hohen Heilungsraten im Primärstadium verbunden. Die Behandlungsergebnisse für Patientinnen im fortgeschrittenen Stadium des Gebärmutterhalskrebses, die eine metastasierende Erkrankung entwickeln, sind jedoch sehr ungünstig2. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die biologischen Mechanismen, die der Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen zugrunde liegen, besser zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele für die Vorbeugung und Behandlung dieser Krankheit zu identifizieren.
Die Identifizierung von Zielgenen, die an der Krebsprogression beteiligt sind, und die Suche nach Wegen, ihre Expression oder Wirkung zu hemmen, stellen vielversprechende Behandlungsoptionen dar. In dieser Studie identifizierten wir FAM83 als krebserregendes Gen und untersuchten seine hemmende Wirkung auf C33a- und HeLa-Zellen. Onkogene der FAM83-Familie (FAM83A-H) sind bei Krebserkrankungen beim Menschen weit verbreitet 3,4. Kürzlich wurde berichtet, dass FAM83A bei Lungenkrebs5,Brustkrebs 6, Eierstockkrebs7 und Bauchspeicheldrüsenkrebs8 hochreguliert ist, was darauf hindeutet, dass FAM83A eine wichtige Rolle bei der Krebsprogression spielt, indem es die Proliferation, Invasion, stammzellähnliche Merkmale und Arzneimittelresistenz in den Tumorzellen fördert. Wichtig ist, dass FAM83A als eines der neuen Kandidatengene identifiziert wurde, die mit der Progression zervikaler Läsionen und der Karzinogenese assoziiertsind 9. Trotz der Bestätigung einer erhöhten FAM83A-Expression in menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen sind die spezifischen Auswirkungen und die zugrunde liegenden Mechanismen von FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs nach wie vor unklar.
In dieser Studie skizzieren wir die Protokolle zur Identifizierung von FAM83A als Tumorzielgen bei Gebärmutterhalskrebs und verwenden eine kleine interferierende RNA (siRNA) für den Knockdown des FAM83A-Gens in HeLa- und C33a-Zellen . Eine 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Färbung wurde durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Tumorzellproliferation zu bestimmen, während Wundheilungs- und poröse Membraninsert-Assays dazu beitrugen, die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen zu bewerten.
Western Blot wurde durchgeführt, um die Konzentrationen von Apoptose-verwandten Proteinen zu bestimmen, und JC-1-Färbung wurde verwendet, um mitochondriale Funktionsänderungen zu bewerten. So berichteten wir, dass FAM83A eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, Metastasierung und Invasion bei Gebärmutterhalskrebs spielt. Durch PI3K/AKT-Signalweg-assoziierte mitochondriale Dysfunktion und Apoptose sensibilisierte FAM83A Gebärmutterhalskrebszellen für Cisplatin (Diamindichlorplatin, DDP). Diese Studie bietet ein neues Ziel für Gebärmutterhalskrebs und möglicherweise andere Krebsarten und eine Referenz für die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der Resistenz von Krebszellen gegen bestimmte Chemotherapeutika.
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Protocol
Die Studie entsprach vollständig den Publikationsrichtlinien der TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Datenquellen- und bioinformatische Analyse
- Beziehen Sie RNA-Sequenzierungsdaten aus der Datenbank des Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) für die Clusteranalyse. Verwenden Sie GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), ein webbasiertes Tool zur Neuberechnung von RNA-Seq-Rohdaten von Proben aus TCGA-Projekten, um mit einer Standard-Verarbeitungspipeline nach potenziellen Zielmolekülen für Krebsmedikamente zu suchen.
HINWEIS: Die GEPIA-Website ist für alle Nutzer frei zugänglich. - Rufen Sie die Homepage der GEPIA-Website auf und klicken Sie auf Krebstypanalyse, wählen Sie die Option Differentielle Genanalyse und stellen Sie die folgenden Parameter ein: Krebsname = CESE (definiert als zervikales Plattenepithelkarzinom und endozervikales Adenokarzinom auf dieser Webseite), |Log2FC| Cutoff = 1, q-Wert Cutoff = 0,01, differentielle Methoden = ANOVA und chromosomale Verteilung = beides. Klicken Sie dann auf Liste, um eine Genliste zu erhalten, die die unterschiedliche Expression zwischen Tumor- und Normalgruppen zeigt.
HINWEIS: Es erfordert eine umfangreiche Literaturrecherche, um differentiell exprimierte Kandidatengene zu identifizieren. In dieser Studie konzentrieren wir uns unter Berücksichtigung des Hintergrunds der verfügbaren Literatur auf das interessierende Tumorgen FAM83A. - Untersuchen Sie dann die Expression von FAM83A in Gebärmutterhalskrebs und normalem Gewebe mit GATTIA, indem Sie auf der Website zur Option Expression DIY gehen und Boxplot als Diagrammtyp auswählen. Geben Sie FAM83A in das Feld Genparameter ein und stellen Sie die folgenden Parameter ein: |Log2FC| Grenzwert = 1; q-Wert Cutoff = 0,01. Wählen Sie CESE als Krebsnamen und TCGA-Normaldaten abgleichen für das Datenfeld "Übereinstimmende Normale " aus, wobei alle anderen Einstellungen auf den Standardeinstellungen belassen werden. Klicken Sie auf Plot und erlauben Sie der Website, einen Boxplot zu erstellen, der die differentielle Expression des FAM83A-Gens darstellt. Speichern Sie den Boxplot zum späteren Nachschlagen und Analysieren.
- Schließlich wird das Gesamtüberleben von Patientinnen mit Tumoren mit unterschiedlicher FAM83A-Expression bei Gebärmutterhalskrebs analysiert. Navigieren Sie auf der Website zur Option Survival Plots, setzen Sie das Gen auf FAM83A und wählen Sie Overall Survival als Analysetyp aus. Fügen Sie den Tumornamen CESE hinzu, wählen Sie Monate für die Achseneinheiten und belassen Sie alle anderen Parameter auf ihren Standardeinstellungen. Klicken Sie auf Plot und lassen Sie die Website ein Überlebenskurvendiagramm erstellen. Speichern Sie dieses Diagramm zum späteren Nachschlagen und Analysieren.
- Berücksichtigen Sie sowohl die differentielle Expression von FAM83A in Tumoren als auch seine Korrelation mit der Überlebensanalyse von Patienten, um FAM83A als potenzielles therapeutisches Zielgen bei Gebärmutterhalskrebs zu identifizieren.
2. Zellbasierte Experimente
- Zellkultur
- Kultivierung humaner Tumorzelllinien im modifizierten Medium bei 37 °C in einer befeuchteten 5%igenCO2-Atmosphäre .
HINWEIS: Informationen zu Zelllinien und Komponenten des Kulturmediums finden Sie in der Materialtabelle .
- Kultivierung humaner Tumorzelllinien im modifizierten Medium bei 37 °C in einer befeuchteten 5%igenCO2-Atmosphäre .
- Transfektion von Zellen
- Verwenden Sie siRNA, um die FAM83A-Expression in den Zellen zu unterbinden.
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die spezifische siRNA-Sequenz. - Die Samenzellen werden in 6-Well-Platten abgefüllt und mit der Mischung aus 50 nM si-FAM83A oder siRNA-NC und 8 μl Transfektionsmittel oder nur 8 μl Transfektionsmittel für 4-6 h inkubiert, nachdem eine Konfluenz von 50 % bis 70 % erreicht wurde. Geben Sie nur serumfreies DMEM in die Negativkontrolle.
- Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium, das das Transfektionsmittel enthält, durch DMEM + 10% fetales Kälberserum. Behandeln Sie 48 Stunden nach der Transfektion wie vorgesehen 24 Stunden lang mit 5 μM Cisplatin (DDP) und ernten Sie alle Zellen für die Gesamt-RNA-Extraktion und die qRT-PCR-Analyse.
- Verwenden Sie siRNA, um die FAM83A-Expression in den Zellen zu unterbinden.
3. EdU-Nachweis für den Zellproliferationsassay
HINWEIS: Verwenden Sie das EdU Cell Proliferation Kit, um die Zellproliferation in vitro gemäß den Anweisungen des Herstellers zu beurteilen.
- Die Zellen werden in 6-Well-Platten ausgesät und 2 h lang mit 10 μM EdU-Lösung inkubiert. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und permeabilisieren Sie mit 0,3 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei RT.
- Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer und fügen Sie 500 μl 1x Reaktionslösung hinzu. Dann 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln inkubieren, um die Kernfärbung zu gewährleisten.
- Färben Sie Zellen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und visualisieren Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Färben Sie die Zellkerne der proliferierenden Zellen mit EdU und untersuchen Sie sie auf rote Fluoreszenz.
- Verwenden Sie schließlich eine Software, um die Ergebnisse zu quantifizieren, indem Sie mindestens 10 zufällige Felder zählen und die Proliferationsraten anhand des Verhältnisses der fluoreszenzpositiven Zellen zur Gesamtzahl der Zellen berechnen.
4. Wundheilungs-Assay
- Samenzellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Well.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, verwenden Sie eine sterile 10-μl-Mikropipettenspitze, um vorsichtig einen linearen Kratzer in der Zellmonoschicht zu erzeugen. Spülen Sie die Vertiefungen vorsichtig mit sterilem PBS, um alle abgelösten Zellen und Ablagerungen zu entfernen, die durch Kratzen verursacht wurden.
- Anschließend werden die Zellen in einem Medium mit 1 % FBS inkubiert. Beobachten und fotografieren Sie dann mit dem invertierten Mikroskop die Heilung der verwundeten Region um 12, 24 und 48 Uhr.
5. Assay für poröse Membraneinsätze
- Es wird eine Zellsuspension in Zellkulturmedium in der gewünschten Zellkonzentration (mit 4 × 104 Zellen) hergestellt, einschließlich transfizierter oder kontrollierter C33a-Zellen und HeLa. Geben Sie die Zellsuspension in die obere Kammer der Membraneinsätze und sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung. Füllen Sie das komplette Medium in die untere Kammer.
- Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden werden Methylalkohol und 0,1 % Kristallviolett für die Fixierung bzw. Färbung der in die unteren Kammern wandernden Zellen verwendet.
- Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um Bilder aufzunehmen, und analysieren Sie dann die Anzahl der wandernden Zellen, indem Sie mindestens 10 zufällige Felder mit ImageJ zählen.
- Für die Zahlenanalyse mit ImageJ öffnen Sie das Bild in der ImageJ-Software, gehen Sie im Werkzeugmenü auf die Registerkarte Bild , wählen Sie Anpassen und klicken Sie dann auf Schwellenwert. Passen Sie die Schwellenwerteinstellungen bei Bedarf an, bis nur noch die Zellen vor weißem Hintergrund sichtbar sind.
- Klicken Sie im Fenster Schwellenwert auf Anwenden, um diese Einstellungen auf das Bild anzuwenden. Wählen Sie nun das Werkzeug Zauberstab (Nachzeichnen) in der Symbolleiste (oben im Fenster) aus.
- Klicken Sie auf den Bereich des Bildes, in dem sich die Zellen befinden, um alle Zellen im Bild mit Schwellenwert auszuwählen. Nachdem die Zellen markiert wurden, gehen Sie im Menü "Werkzeug" zu "Analysieren" und klicken Sie dann auf "Partikel analysieren". Geben Sie im Fenster "Partikel analysieren" die gewünschten Werte für die Größe (z. B. 0 - unendlich) und die Zirkularität (z. B. 0,00 - 1,00) gemäß den experimentellen Anforderungen ein, um alle Zellen in die Zählung einzubeziehen.
- Klicken Sie auf OK und warten Sie, bis die Software die Zellen gezählt hat und ein neues Fenster mit den Analyseergebnissen angezeigt wird.
6. Assay der Koloniebildung
- 2 × 105 Zellen Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen pro Well in eine 6-Well-Platte mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung für 24 h bringen.
- Nach einer 24-stündigen medikamentösen Behandlung werden die Zellen mit 0,25 % Trypsin abgetrennt und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % FBS resuspendiert. Die resuspendierten Zellen werden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 103 Zellen pro Well ausgesät und dann in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert.
- Nach der Inkubation für ~7-10 Tage, wenn die Kolonien sichtbar sind, fixieren Sie die Zellen mit 4% Polyoxymethylen und färben Sie sie 20 Minuten lang mit Giemsa-Färbelösung.
- Waschen Sie die Zellen leicht und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen. Machen Sie Bilder der Koloniecluster mit dem Mikroskop und zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die mehr als 50 Zellen enthalten.
7. Analyse der mitochondrialen Membrandepolarisation (MMP) mit dem Farbstoff JC-1
- 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
- Inkubieren Sie mit 1x JC-1-Färbelösung für 15-20 Minuten unter 5 % CO2 bei 37 °C unter Verwendung eines mitochondrialen Membranpotential-Assay-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Waschen Sie die Zellen und untersuchen Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängen für JC-1 bei ~490 nm bzw. 590 nm. Um die JC-1-Fluoreszenz sichtbar zu machen, verwenden Sie geeignete Filter, wie z. B. einen blauen Anregungsfilter (450-490 nm) und einen roten Emissionsfilter (Langpass > 590 nm), um das emittierte Fluoreszenzsignal selektiv einzufangen.
8. Durchflusszytometrische Analyse von mPTP
- 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
- Entfernen Sie das Kulturmedium von den Zellen, resuspendieren Sie die Zellen in PBS und fügen Sie jeweils 300 μl (1x Volumen) Calcein-AM-Färbelösung und Fluoreszenzlösch-Arbeitslösung hinzu, um die Zellen gleichmäßig zu bedecken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer lichtgeschützten Umgebung für 30-45 Minuten und ersetzen Sie das Medium durch frisches, vorgewärmtes Nährmedium bei 37 °C. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer lichtgeschützten Umgebung für weitere 30 Minuten, um eine vollständige Hydrolyse von Calcein AM durch intrazelluläre Esterasen zu gewährleisten, was zur Bildung von intrazellulärem grün fluoreszierendem Calcein führt.
- Entfernen Sie das Nährmedium, waschen Sie die Zellen 2-3x mit PBS und fügen Sie Nachweispuffer hinzu. Nachweis von Zell-mPTP mittels Durchflusszytometrie und einer Anregungswellenlänge von 488 nm.
9. Durchflusszytometrie
- 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
- Nach 24 Stunden medikamentöser Behandlung werden die Zellen in 200 μl Bindungspufferlösung resuspendiert und 10 μl Annexin V-FITC und 5 μl Propidiumiodid (PI) vorsichtig in die Zellsuspension gemischt. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang unter Vermeidung von Licht und geben Sie 300 μl Bindungspufferlösung zu den Zellen. Nachweis der Zellapoptose mittels Durchflusszytometrie bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm.
10. RT-PCR-Analyse
- 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
- Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den Tumorzellen mit dem RNA-Extraktionsreagenz und wandeln Sie die extrahierte RNA mit dem cDNA-Synthese-Mix in komplementäre DNA (cDNA) um, indem Sie 45 Minuten lang bei 42 °C und dann 5 Minuten lang bei 95 °C inkubieren.
- Bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung vor, die DNA-Polymerase, Nukleotide, Puffer und die entworfenen genspezifischen Primer enthält. Die cDNA-Matrize wird für die Real-Time-PCR-Reaktion zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und die PCR auf dem quantitativen Real-Time-PCR-Gerät unter den folgenden Thermocycling-Bedingungen durchgeführt: Denaturierung bei 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s und 60 °C für 30 s und der Schmelzkurvenstufe bei 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 Minute und 95 °C für 15 s. Quantifizierung der mRNA-Spiegel mit der 2−ΔΔCq-Methode unter Verwendung von GAPDH als interne Kontrolle.
HINWEIS: Das RT-PCR-Reaktionssystem ist in Tabelle 1 dargestellt, und die Primersequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt.- Um den 2−ΔΔCq− Wert zu berechnen, werden die Cq−Werte für das Zielgen und das Referenzgen (GAPDH) in den Proben gemessen. Berechnen Sie den ΔCq-Wert, indem Sie den Cq-Wert des Referenzgens vom Cq-Wert des Zielgens für jede Probe subtrahieren. Berechnen Sie das ΔΔCq, indem Sie das ΔCq einer Kontrollprobe vom ΔCq jeder experimentellen Probe subtrahieren. Berechnen Sie schließlich den 2−ΔΔCq− Wert, indem Sie 2 hoch zum ΔΔCq−Wert erhöhen.
HINWEIS: Der Cq-Wert stellt die Zykluszahl dar, bei der das Fluoreszenzsignal den eingestellten Schwellenwert erreicht.
- Um den 2−ΔΔCq− Wert zu berechnen, werden die Cq−Werte für das Zielgen und das Referenzgen (GAPDH) in den Proben gemessen. Berechnen Sie den ΔCq-Wert, indem Sie den Cq-Wert des Referenzgens vom Cq-Wert des Zielgens für jede Probe subtrahieren. Berechnen Sie das ΔΔCq, indem Sie das ΔCq einer Kontrollprobe vom ΔCq jeder experimentellen Probe subtrahieren. Berechnen Sie schließlich den 2−ΔΔCq− Wert, indem Sie 2 hoch zum ΔΔCq−Wert erhöhen.
11. Western-Blot-Analyse
- 1,2 × 106 Tumorzellen aus Si-NC- und Si-FAM83A-Gruppen in eine Sechs-Well-Platte gesät und 24 Stunden lang mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP)-Behandlung kultiviert.
- Sammeln Sie die kultivierten Zellen und waschen Sie sie mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um alle verbleibenden Wachstumsmedien oder Serumreste zu entfernen. Lysieren Sie die Zellen mit RIPA-Lysepuffer, der Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält, um die zellulären Proteine freizusetzen. Die Zellen werden einige Minuten lang auf Eis inkubiert, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten, und bei 4 °C 12.000 × g für 15 Minuten zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand, um seine Proteinkonzentration zu bestimmen.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration im Zelllysat mit einem BCA Protein Assay Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mischen Sie das Zelllysat mit einem Beladungspuffer und erhitzen Sie die Mischung bei 95-100 °C für 5-10 Minuten, um die Proteine zu denaturieren und eine gleichmäßige Trennung auf dem Gel zu gewährleisten.
- Von jeder Probe werden 30 μg Gesamtprotein auf ein SDS-PAGE-Gel geladen und das SDS-PAGE unter einer konstanten Spannung von 80 V betrieben. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn das Bromphenolblau den Boden des Trenngels erreicht.
- Die abgetrennten Proteine aus dem Gel werden mit einem Nasstransfersystem in einem Eisbad mit einem Strom von 200 mA für 1,5 h auf eine Polyvinyldifluorid-Membran übertragen.
- Blockieren Sie die Membran mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20-Puffer (TBST) für 1 Stunde bei RT und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit den entsprechenden Antikörpern, die in der Materialtabelle angegeben sind.
- Waschen Sie die Membran mehrmals mit TBST und inkubieren Sie mit den sekundären Antikörpern (Materialtabelle) 1 h bei RT, gefolgt von einem Waschen mit TBST. Visualisieren Sie die Proteinbanden mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Detektionskit und einem Imager-System.
12. Statistische Analyse
- Da alle experimentellen Datenpunkte unabhängig sind, stellen Sie die Daten als Mittelwert ± SD dar. Führen Sie eine statistische Analyse durch.
- Verwenden Sie die unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) für Mehrfachvergleiche und den Dunnett-Test, um jede Gruppe mit der Kontrollgruppe zu vergleichen. Verwenden Sie den t-Test des Schülers (ungepaarter zweiseitiger Test), um zwei Gruppen zu vergleichen. P < 0,05 als signifikant erachten.
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Representative Results
TCGA-Datenbankanalyse und PCR-Validierung
Ausgehend von der TCGA-Datenbankanalyse führten wir eine vergleichende Analyse der mRNA-Expressionsniveaus in 306 Gebärmutterhalskrebs-Zellproben und 13 normalen Zellproben durch, um die differentielle Expression von FAM83A zu untersuchen. FAM83A war bei Gebärmutterhalskrebs hochreguliert, während seine Expression im normalen Gebärmutterhalsgewebe vernachlässigbar war (Abbildung 1A). Um weitere Einblicke in die prognostischen Implikationen der FAM83A-Expression zu erhalten, führten wir eine Kaplan-Meier-Kurvenanalyse durch. Auffallend ist, dass Patienten mit einer höheren FAM83A-Expression ein deutlich schlechteres Gesamtüberleben aufwiesen (Abbildung 1B). Um die Rolle von FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs zu bestimmen, untersuchten wir die FAM83A-Expression in zwei Zelllinien des Gebärmutterhalskrebses, HeLa und C33a, sowie in einer immortalisierten Gebärmutterhalszelllinie, End1/E6E7. Mittels qRT-PCR beobachteten wir eine signifikante Überexpression von FAM83A in den HeLa- und C33a-Zelllinien im Vergleich zur End1/E6E7-Zelllinie (Abbildung 1C). Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von FAM83A im Zusammenhang mit Gebärmutterhalskrebs.
Proliferations- und Apoptoseexperimente zur Überprüfung der biologischen Funktion von FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs
Um die funktionelle Rolle von FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs zu untersuchen, haben wir den siRNA-vermittelten Knockdown von FAM83A in C33a- und HeLa-Zellen verwendet (Abbildung 2A,B). Anschließend untersuchten wir den Einfluss der FAM83A-Unterdrückung auf die Zellproliferation. Die EdU-Färbung zeigte, dass eine verminderte Expression von FAM83A die Zellproliferation sowohl in C33a- als auch in HeLa-Zellen signifikant hemmte (Abbildung 2C-F). Unsterbliche maligne Zellen sind mit extrem niedrigen Apoptoseraten assoziiert10. Daher wurden die Konzentrationen von anti- und proapoptotischen Proteinen in den Kontroll- und si-FAM83A-behandelten Gebärmutterhalskrebszellen bestimmt. Western-Blot-Analysen zeigten, dass die unterdrückte Expression von FAM83A die Expression von Bax- und gespaltenen Caspase3-Proteinen (proapoptotische Proteine) erhöhte, die Expression von Bcl-2 (antiapoptotisches Protein) verringerte und die Cytc-Freisetzung erhöhte (Abbildung 2C-E), was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass antiapoptotische Proteine die Apoptose regulieren, indem sie die mitochondriale Freisetzung von Cytc blockieren (Abbildung 2G-J)10. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass FAM83A eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Proliferation und Apoptose von Gebärmutterhalskrebszellen spielt.
Wundheilende und poröse Membraneinsatz-Assays zur Überprüfung der biologischen Funktion von FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs
Wundheilungs- und Membraninsert-Assays wurden durchgeführt, um die Auswirkungen der FAM83A-Suppression auf die Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass Gebärmutterhalskrebszellen mit unterdrückter FAM83A-Expression weniger effizient migrierten (Abbildung 3A-D) und eindrangen (Abbildung 3E-H) als die Kontrollzellen.
Auswirkungen auf die mitochondriale Funktion und den PI3K/AKT-Signalweg
Angesichts der Rolle von PI3K/AKT bei der Induktion der Zellapoptose wollten wir herausfinden, ob die Unterdrückung der FAM83A-Expression die konstitutive Phosphorylierung des PI3K/Akt/mTOR-Signalwegs bei Gebärmutterhalskrebs hemmen würde. Die Unterdrückung von FAM83A hemmte signifikant die wichtigsten phosphorylierten Proteinspiegel im PI3K/Akt/mTOR-Signalweg, einschließlich p-PI3K, p-Akt und p-mTOR in c333a- und HeLa-Zellen (Abbildung 4A-D). Mitochondrien sind die Organellen, die für den Zellstoffwechsel und die Induktion der Zellapoptose verantwortlich sind. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die Apoptose von Krebszellen eine mitochondriale Dysfunktion über den intrinsischen mitochondrialen Signalweg aufgrund einer erhöhten mitochondrialen Permeabilität und der Freisetzung proapoptotischer Moleküle wie Cytc in das Zytoplasma beinhaltet10. Der PI3K/AKT-Signalweg könnte die Translokation von Bax in die Mitochondrien regulieren und die Freisetzung von Cytc als Reaktion auf apoptotische Stimuli induzieren. Daher ist es denkbar, dass die onkogenen Komponenten des PI3K-AKT-Signalwegs die Zellapoptose direkt regulieren, indem sie das mitochondriale Verhalten beeinflussen. Daher wurde ein Lebendzell-mitochondrialer Permeabilitäts-Übergangsporen-Assay (mPTP) durchgeführt, um den mitochondrialen Status zu bestimmen. Die Öffnung von mPTP ist mit dem apoptotischen und nekrotischen Zelltod assoziiert11. In diesem Assay wird ein grün fluoreszierender Farbstoff (Calcein AM) im Zytoplasma und in den Mitochondrien zurückgehalten, wenn das mPTP geschlossen ist, während der Farbstoff im Zytoplasma durch CoCl2 gelöscht wird, so dass nur die intensive Fluoreszenz in den Mitochondrien übrig bleibt. Die Ergebnisse zeigten, dass Zellpopulationen mit intensiver grüner Fluoreszenz in den Mitochondrien nach FAM83A-Suppression signifikant abnahmen, was auf ein geöffnetes mPTP hindeutet (Abbildung 4E,F). Des Weiteren untersuchten wir die Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) mittels JC-1-Färbung. JC-1 bildet Aggregate (rote Fluoreszenz) in lebenden Zellen, die intakte Mitochondrien mit hohem Membranpotential und Monomere (grüne Fluoreszenz) unter niedrigem MMP in apoptotischen Zellen enthalten. Die Unterdrückung von FAM83A nahm das MMP allmählich ab (Abbildung 4G).
Analyse der Empfindlichkeit von Arzneimitteln für Proliferation und Invasion
Die Cisplatin (DDP)-basierte Chemotherapie ist eine Standardbehandlungsstrategie für Gebärmutterhalskrebs. Die Chemoresistenz bleibt jedoch eine Herausforderung. Wir untersuchten die Rolle von FAM83A bei der Behandlung von Gebärmutterhalskrebs mit Cisplatin. Kontroll-, si-NC-behandelte und si-FAM83A-behandelte HeLa-Zellen wurden mit oder ohne 5 μM Cisplatin12 behandelt. Des Weiteren wurden die Auswirkungen der FAM83A-Suppression auf die Zellviabilität untersucht. DDP induzierte eine signifikantere hemmende Wirkung auf die Proliferation von HeLa-Zellen nach FAM83A-Suppression im Vergleich zur reinen DDP-Behandlung (Abbildung 5A und Abbildung 5C). Nach der Behandlung von Gebärmutterhalskrebszellen mit 5 μM Cisplatin hemmte die FAM83A-Suppression auch die Zellinvasion (Abbildung 5B und Abbildung 5D).
Analyse der Arzneimittelempfindlichkeit für die mitochondriale Funktion
Durch die Behandlung von Si-NC-behandelten und si-FAM83A-behandelten HeLa-Zellen mit oder ohne 5 μM Cisplatin (DDP) wurde das mitochondriale Membranpotential (MMP) und die durch den Zelltod verursachte mitochondriale Schädigung mittels JC-1-Färbung bewertet. DDP induzierte mehr mitochondriale Schäden, was sich in einer Abnahme des JC-1-Monomeranteils nach FAM83A-Knockdown im Vergleich zur reinen DDP-Behandlung zeigte (Abbildung 6A und Abbildung 6D). Nach der Behandlung von Gebärmutterhalskrebszellen mit 5 μM Cisplatin hemmte der FAM83A-Knockdown auch die Koloniebildung (Abbildung 6B und Abbildung 6E) und verbesserte die Zellapoptose (Abbildung 6C und Abbildung 6F). Darüber hinaus erhöhte der FAM83A-Knockdown in Gegenwart von DDP deutlich die Expression von proapoptotischen Proteinen, Bax und gespaltener Caspase3, förderte die Cytc-Freisetzung und verringerte die Bcl-2-Expression (Abbildung 6G,H). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass FAM83A Knockdown Gebärmutterhalskrebszellen durch Apoptose-Induktion für DDP sensibilisiert.
Abbildung 1: FAM83A-Überexpression in Gebärmutterhalskrebszellen und Korrelation mit schlechterer Prognose. (A) Boxplot-Analyse der mRNA-Spiegel von FAM83A in Gebärmutterhalskrebsproben. (B) Kaplan-Meier-Analyse der FAM83A-Expression zur Bestimmung des Gesamtüberlebens bei Patientinnen mit Gebärmutterhalskrebs. (C) Relative mRNA-Spiegel von FAM83A in den Gebärmutterhalskrebs-Zelllinien HeLa und C33a und der humanen immortalisierten Gebärmutterhals-Zelllinie End1/E6E7. Die Daten werden als Mittelwert ± SD für drei unabhängige Experimente dargestellt. *P < 0,05 im Vergleich zu End1/E6E7-Zellen mit Einweg-ANOVA. Abkürzungen: CESE = Zervikales Plattenepithelkarzinom und endozervikales Adenokarzinom; HR = Hazard Ratio. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswirkungen der Suppression von FAM83A auf die Proliferation und Apoptose von Gebärmutterhalskrebs. C33a- und HeLa-Zellen wurden mit FAM83A-spezifischen siRNAs transfiziert. (A,B) mRNA-Spiegel von FAM83A wurden in Gebärmutterhalskrebs-Zelllinien mittels qRT-PCR bestimmt.Die Zellproliferation in (C) C33a- und (D) HeLa-Zellen wurde mit dem EdU-Assay bestimmt. (E,F) Die EDU-Fluoreszenzbilder von C33a- und Hela-Zellen. (G-J) Western-Blot-Analyse zur Untersuchung der Konzentrationen von Apoptose-bezogenen Proteinen, einschließlich Cytc, Bcl-2, Bax, Caspase3 und Cleaved-Caspase-3; GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD für drei unabhängige Experimente dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001 im Vergleich zu Kontrollzellen mit Einweg-ANOVA. Abkürzungen: NC = Negativkontrolle; EdU = 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin; CytC = Cytochrom C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Wirkung von FAM83A auf die Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen in vitro. (A-D) Ein Wundheilungsassay wurde durchgeführt, um die Zellmigration zu beurteilen. Die Bilder wurden um 0, 24 und 48 Uhr aufgenommen. (E-H) Transwell-Assays wurden durchgeführt, um die Zellinvasion zu untersuchen. Maßstabsbalken = 100 μm (E,F). Die Daten werden als Mittelwert ± SD für drei unabhängige Experimente dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001 im Vergleich zu Kontrollzellen mit Einweg-ANOVA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Wirkung der FAM83A-Unterdrückung auf den PI3K/AKT/mTOR-Signalweg und die mitochondriale Funktion. (A-D) Western-Blot-Analyse zur Bestimmung der Proteingehalte des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs in C33a- und HeLa-Zellen nach FAM83A-Suppression. (E-H) Analyse des Potenzials der mitochondrialen Membran mittels JC-1-Färbung. JC-1-Aggregate wurden rot und JC-1-Monomere grün gefärbt, was auf ein niedrigeres MMP hinweist. (I,J) Die mitochondriale Permeabilität wurde mit einem mPTP-Kit und Durchflusszytometrie beurteilt. Maßstabsbalken = 50 μm (E, F). Die Daten werden als Mittelwert ± SD für drei unabhängige Experimente dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 im Vergleich zu Kontrollzellen mit Einweg-ANOVA. Abkürzungen: MMP = mitochondriales Membranpotential; mPTP = Übergangspore der mitochondrialen Permeabilität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Auswirkungen der FAM83A-Suppression auf die Hemmung durch DDP auf die Zellproliferation und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen. HeLa-Zellen wurden mit si-NC oder si-FAM83A transfiziert und mit oder ohne 5 μM DDP behandelt. (A,C) Wirkung von DDP auf die Zellproliferation in Kontroll-, si-NC-behandelten und si-FAM83-behandelten HeLa-Zellen. (B,D) Wirkung von DDP auf die Zellinvasion in kontrollierten, si-NC-behandelten und si-FAM83-behandelten HeLa-Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD für drei unabhängige Experimente dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 im Vergleich zu den Kontrollzellen. &&P < 0,01; &&&P < 0,001 im Vergleich zu DDP bei Verwendung von One-Way-ANOVA. Abkürzungen: DDP = Diaminedichlorplatin; EdU = 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Auswirkungen der FAM83A-Unterdrückung auf die Auswirkungen von DDP auf die Apoptose in Gebärmutterhalskrebszellen. HeLa-Zellen wurden mit si-NC oder si-FAM83A transfiziert und mit oder ohne 5 μM DDP behandelt. (A,D) MMP-Analyse mittels JC-1-Färbung. (B,E) Ergebnisse des Klonens von Platten. (C,F) Durchflusszytometrie zum Nachweis von Apoptoseraten in verschiedenen Behandlungsgruppen. (G,H) Western-Blot-Analyse von Mitochondrien-verwandten apoptotischen Proteinen, einschließlich Bcl-2, Bax, Cytc und der nachgeschalteten gespaltenen Caspase-3. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD für drei unabhängige Experimente dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 im Vergleich zu den Kontrollzellen. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001 im Vergleich zu DDP bei Verwendung von One-Way-ANOVA. Abkürzungen: DDP = Diaminedichlorplatin; EdU = 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: siRNA, qRTPCR-Primer und der in dieser Studie verwendete qRT-PCR-Reaktionsaufbau. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die Untersuchung von Tumor-Zielgenen ist sowohl für die Prävention als auch für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. Das Verständnis der spezifischen Gene, die eine wichtige Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Gebärmutterhalskrebs spielen, bietet wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Krankheit. Darüber hinaus kann die Identifizierung dieser Zielgene zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien und zielgerichteter Therapien führen. In dieser Studie beschreiben wir den Einsatz der TCGA-Datensatzanalyse, um FAM83A als Zielgen zu identifizieren und seine mechanistische Rolle bei Gebärmutterhalskrebs zu untersuchen. Wir beobachten eine signifikant hohe Expression von FAM83A in Gebärmutterhalskrebszellen, die mit einer schlechten Prognose von Patientinnen mit Gebärmutterhalskrebs einhergeht. Eine Reihe von zellbasierten Experimenten ergab eine hohe FAM83A-Expression in Gebärmutterhalskrebszellen, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Zellproliferation, -migration und -invasion spielt. Die Unterdrückung der FAM83A-Expression hemmte die Proliferation und Migration und förderte die Apoptose in Gebärmutterhalskrebszellen.
Die Konstruktion von FAM83A-Knockdown-Zelllinien für Gebärmutterhalskrebs ist der kritischste Schritt in dieser Studie. siRNAs werden entsprechend der Zielgensequenzen entworfen und validiert, um ihre Wirksamkeit sicherzustellen. Des Weiteren werden die Zelllinien des Gebärmutterhalskrebses mittels siRNA transfiziert. Die Erfolgsrate der Plasmidtransfektion ist entscheidend für nachfolgende Experimente, die eine strenge Kontrolle der Zelldichte und der Plasmiddichte erfordern. Darüber hinaus wird die Transfektionseffizienz unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um sicherzustellen, dass nachfolgende Experimente durchgeführt werden können. Western Blotting und qRT-PCR-Ergebnisse bestätigen, dass die Hemmung von FAM83A den PI3K/AKT-Signalweg unterdrückt und eine mitochondriale Dysfunktion induziert. Wir stellen die Hypothese auf, dass der Mechanismus die Hemmung der Translokation von Bax aus dem Zytoplasma in die Mitochondrien durch PI3K/AKT beinhaltet, was das Überleben der Zelle fördert13.
Fortschritte in der Behandlung von Gebärmutterhalskrebs haben es ermöglicht, neue Zielmoleküle zu entwickeln. Die Identifizierung eines neuen Onkogens kann therapeutisch eingesetzt werden, um die klinische Prognose von zervikalen Malignomen zu verbessern14,15. In dieser Studie gelang es uns, ein FAM83A-Knockdown-System in HeLa- und C33a-Zellen zu konstruieren und die Auswirkungen des FAM83A-Knockdowns auf Gebärmutterhalskrebszellen auf zellulärer Ebene zu verifizieren. Wir schlagen vor, dass die Hemmung von FAM83A zur Behandlung von Gebärmutterhalskrebs eingesetzt werden kann.
Diese Studie weist jedoch einige Einschränkungen auf. Erstens führt diese Studie nur ein Gen-Screening über die Datenbank durch und es fehlen pathologische Daten von klinischen Patienten. Zweitens hat diese Studie die Wirkung nur in vitro validiert, und weitere In-vivo-Studien waren erforderlich, um die Ergebnisse zu verifizieren. Nichtsdestotrotz können die in dieser Studie entwickelten Methoden der Zielgenidentifikation, des Gen-Knockouts und der zellulären Validierung zur Identifizierung gezielter therapeutischer Loci Forschungsideen für die Entdeckung und Validierung von Zielgenen für andere Krankheiten liefern.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FAM83A überexprimiert war und mit einer schlechteren Prognose bei Gebärmutterhalskrebs korrelierte. FAM83A reguliert die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen. Unterdrückung der FAM83A-induzierten mitochondrialen Dysfunktion und Apoptose, Sensibilisierung von Gebärmutterhalskrebszellen für Cisplatin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass FAM83A ein geeignetes Forschungsziel für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs ist. Diese Studie trug zu den Fortschritten in der adjuvanten Chemotherapie bei, die darauf abzielt, die Prognose von Patientinnen mit Gebärmutterhalskrebs zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation unterstützt (Nr. 2020HC06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
References
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