Summary
Hier laten we de procedures zien voor het neerhalen van FAM83A ; de tests om de effecten ervan op proliferatie, migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen te detecteren; en de sensibilisatie van deze cellen voor cisplatine. Deze studie biedt een veelbelovend doelgen voor baarmoederhalskanker en een referentie voor verder geneesmiddelenonderzoek.
Abstract
De exploratie van tumordoelgenen is van het grootste belang voor de preventie en behandeling van baarmoederhalskanker. In deze studie schetsen we de stappen die betrokken zijn bij de identificatie van een tumordoelgen FAM83A bij baarmoederhalskanker. Ten eerste werd de Cancer Genome Atlas-dataset gebruikt om de expressie en prognostische significantie van FAM83A bij vrouwen te valideren. Een klein interfererend RNA (siRNA) werd gebruikt voor het uitschakelen van het FAM83A-gen in HeLa- en C33a-cellen . Vervolgens werd 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) kleuring uitgevoerd om de effecten op de proliferatiemogelijkheden van de tumorcellen te bepalen. Wondgenezing en poreuze membraaninsert-assays werden uitgevoerd om tumorcelmigratie en invasievermogen te evalueren.
Western blotting werd gebruikt om apoptose-gerelateerde eiwitniveaus te kwantificeren. JC-1-kleuring werd gebruikt om veranderingen in de mitochondriale functie te evalueren. Bovendien werd cisplatine (diaminedichloorplatina, DDP) interventie gebruikt om het therapeutisch potentieel van het doelgen te beoordelen. Flowcytometrie en kolonievormingstesten werden uitgevoerd om de antikankerkenmerken van het gen verder te valideren. Als gevolg hiervan bleek FAM83A-knockdown de proliferatie, migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen te remmen en deze cellen gevoelig te maken voor cisplatine. Deze uitgebreide methodologieën valideren gezamenlijk FAM83A als een tumor-geassocieerd doelgen, veelbelovend als een potentieel therapeutisch doelwit bij de preventie en behandeling van baarmoederhalskanker.
Introduction
Baarmoederhalskanker is een wereldwijd probleem, aangezien het wereldwijd een van de belangrijkste vormen van gynaecologische maligniteit is en de belangrijkste oorzaak is van kankergerelateerde sterfte bij vrouwen. Radicale chirurgie en chemoradiotherapie worden in verband gebracht met hoge genezingspercentages in de primaire fase. De behandelingsresultaten voor patiënten in een vergevorderd stadium van baarmoederhalskanker die gemetastaseerde ziekte ontwikkelen, zijn echter zeer ongunstig2. Daarom is het van cruciaal belang om de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen beter te begrijpen en potentiële therapeutische doelen voor de preventie en behandeling van deze ziekte te identificeren.
Het identificeren van doelgenen die betrokken zijn bij de progressie van kanker en het vinden van manieren om hun expressie of werking te remmen, bieden veelbelovende behandelingsopties. In deze studie identificeerden we FAM83 als een kankerverwekkend gen en onderzochten we verder de remmende effecten ervan op C33a- en HeLa-cellen. Oncogenen van de FAM83-familie (FAM83A-H) worden op grote schaal gerapporteerd bij menselijke kankers 3,4. Onlangs werd gemeld dat FAM83A wordt opgereguleerd bij longkanker5, borst6, eierstokkanker7 en pancreas8, wat aangeeft dat FAM83A een belangrijke rol speelt bij de progressie van kanker door het bevorderen van de proliferatie, invasie, stamcelachtige eigenschappen en resistentie tegen geneesmiddelen in de tumorcellen. Belangrijk is dat FAM83A werd geïdentificeerd als een van de nieuwe kandidaat-genen die geassocieerd zijn met progressie van cervicale laesies en carcinogenese9. Ondanks de bevestiging van verhoogde FAM83A-expressie in menselijke baarmoederhalskankercellen, blijven de specifieke impact en onderliggende mechanismen van FAM83A bij baarmoederhalskanker onduidelijk.
In deze studie schetsen we de protocollen die betrokken zijn bij de identificatie van FAM83A als een tumordoelgen bij baarmoederhalskanker en gebruiken we een klein interfererend RNA (siRNA) voor de knockdown van het FAM83A-gen in HeLa- en C33a-cellen . 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)-kleuring werd uitgevoerd om de effecten op de proliferatie van tumorcellen te bepalen, terwijl wondgenezing en poreuze membraaninsert-assays hielpen bij het evalueren van tumorcelmigratie en invasiecapaciteiten.
Western blotting werd uitgevoerd om de niveaus van apoptose-gerelateerde eiwitten te bepalen, en JC-1-kleuring werd gebruikt om mitochondriale functieveranderingen te evalueren. Zo meldden we dat FAM83A een cruciale rol speelt bij celproliferatie, metastase en invasie bij baarmoederhalskanker. Door middel van PI3K/AKT-pathway-geassocieerde mitochondriale disfunctie en apoptose, sloeg FAM83A baarmoederhalskankercellen uit voor cisplatine (diaminedichloorplatina, DDP). Deze studie biedt een nieuw doelwit voor baarmoederhalskanker en mogelijk andere vormen van kanker en een referentie voor de ontwikkeling van strategieën om de resistentie van kankercellen tegen bepaalde chemotherapeutische geneesmiddelen te overwinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie was volledig in overeenstemming met de publicatierichtlijnen van TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Gegevensbron en bioinformatica-analyse
- Verkrijg RNA-sequencinggegevens uit de Cancer Genome Atlas (TCGA)-database (https://cancergenome.nih.gov) voor clusteranalyse. Gebruik de GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), een webgebaseerde tool om ruwe RNA-Seq-gegevens van monsters van TCGA-projecten opnieuw te berekenen, om te screenen op kandidaat-doelwitten voor kankergeneesmiddelen met een standaard verwerkingspijplijn.
OPMERKING: De GEPIA-website is gratis beschikbaar voor alle gebruikers. - Ga naar de startpagina van de GEPIA-website en klik op Kankertypeanalyse, selecteer de optie Differentiële genenanalyse en stel de volgende parameters in: Kankernaam = CESE (gedefinieerd als cervicaal plaveiselcelcarcinoom en endocervicaal adenocarcinoom op deze webpagina), |Log2FC| Cutoff = 1, q-waarde Cutoff = 0.01, Differentiële methoden = ANOVA en Chromosomale Distributie = beide. Klik vervolgens op Lijst om een genenlijst te verkrijgen die differentiële expressie tussen tumor- en normale groepen laat zien.
OPMERKING: Het vereist een uitgebreid literatuuronderzoek om differentieel tot expressie gebrachte kandidaatgenen te identificeren. In deze studie richten we, rekening houdend met de achtergrond van de beschikbare literatuur, ons op het tumorgen van belang, FAM83A. - Onderzoek vervolgens de expressie van FAM83A in baarmoederhalskanker en normale weefsels met behulp van GEPIA door door te gaan naar de optie Expressie-doe-het-zelf op de website en Boxplot te selecteren als het kaarttype. Voer FAM83A in het veld genparameter in en stel de volgende parameters in: |Log2FC| Afkapwaarde = 1; q-waarde Cutoff = 0,01. Selecteer CESE als de naam van de kanker en Match TCGA normale gegevens voor het gegevensveld Matched Normal, waarbij alle andere instellingen op hun standaardinstellingen blijven staan. Klik op Plot en laat de website een boxplot genereren die de differentiële expressie van het FAM83A-gen weergeeft; Sla de boxplot op voor toekomstig gebruik en analyse.
- Analyseer ten slotte de algehele overleving van patiënten met tumoren met verschillende niveaus van FAM83A-expressie bij baarmoederhalskanker. Navigeer naar de optie Overlevingsplots op de website, stel het gen in op FAM83A en selecteer Totale overleving als analysetype. Voeg de tumornaam CESE toe, kies Maanden voor de aseenheden en laat alle andere parameters op hun standaardinstellingen staan. Klik op Plot en laat de website een grafiek met overlevingscurves genereren; Bewaar deze grafiek voor toekomstig gebruik en analyse.
- Houd rekening met zowel de differentiële expressie van FAM83A in tumoren als de correlatie met de overlevingsanalyse van de patiënt om FAM83A te identificeren als een potentieel therapeutisch doelwitgen bij baarmoederhalskanker.
2. Celgebaseerde experimenten
- Celkweek
- Kweek menselijke tumorcellijnen in het gemodificeerde medium bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor informatie over de cellijn en de componenten van het kweekmedium.
- Kweek menselijke tumorcellijnen in het gemodificeerde medium bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 .
- Cel transfectie
- Gebruik siRNA om de expressie van FAM83A in de cellen uit te schakelen.
OPMERKING: Zie tabel 1 voor de specifieke siRNA-sequentie. - Zaadcellen in platen met 6 putjes en incubeer met het mengsel van 50 nM si-FAM83A of siRNA-NC en 8 μL transfectiemiddel of slechts 8 μL transfectiemiddel gedurende 4-6 uur na het bereiken van 50%-70% confluentie. Voeg alleen serumvrije DMEM toe aan de negatieve controle.
- Vervang na de incubatie het medium met het transfectiemiddel door DMEM + 10% foetaal kalfsserum. Behandel verder 48 uur na transfectie gedurende 24 uur met 5 μM cisplatine (DDP) zoals bedoeld en oogst alle cellen voor totale RNA-extractie en qRT-PCR-analyse.
- Gebruik siRNA om de expressie van FAM83A in de cellen uit te schakelen.
3. EdU-detectie voor celproliferatietest
NOTITIE: Gebruik de EdU Cell Proliferation Kit om celproliferatie in vitro te beoordelen volgens de instructies van de fabrikant.
- Zaai de cellen in platen met 6 putjes en incubeer ze gedurende 2 uur met 10 μM EdU-oplossing. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) en permeabiliseer met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij RT.
- Verwijder de permeabilisatiebuffer en voeg 500 μL 1x reactieoplossing toe. Incubeer vervolgens 30 minuten bij RT in het donker voor nucleaire kleuring.
- Kleurcellen met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en visualiseer ze onder een fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 200x. Kleuring de kernen van de prolifererende cellen met EdU en onderzoek ze op rode fluorescentie.
- Gebruik ten slotte software om de resultaten te kwantificeren door ten minste 10 willekeurige velden te tellen en bereken de proliferatiesnelheden met behulp van de verhouding tussen de fluorescerende positieve cellen en het totale aantal cellen.
4. Wondgenezingstest
- Zaadcellen in platen met 6 putjes met een dichtheid van 2 × 105 cellen per putje.
- Wanneer de cellen 90% samenvloeiing bereiken, gebruikt u een steriele micropipetpunt van 10 μl om voorzichtig een lineaire kras in de monolaag van de cel te creëren. Spoel de putjes voorzichtig af met steriele PBS om losgeraakte cellen en vuil veroorzaakt door krassen te verwijderen.
- Incubeer de cellen verder in een medium dat 1% FBS bevat. Observeer en maak vervolgens foto's met de omgekeerde microscoop voor de genezing van het gewonde gebied na 12, 24 en 48 uur.
5. Poreuze membraaninzetstaaf assay
- Bereid een celsuspensie in celkweekmedium met de gewenste celconcentratie (met 4 × 104 cellen), inclusief getransfecteerde of controlecellen C33a-cellen en HeLa. Voeg de celsuspensie toe aan de bovenste kamer van de membraaninzetstukken en zorg voor een gelijkmatige verdeling. Voeg een compleet medium toe aan de onderste kamer.
- Gebruik na een incubatietijd van 24 uur methylalcohol en 0,1% kristalviolet voor respectievelijk de fixatie en kleuring van de cellen die naar de onderste kamers migreren.
- Gebruik een omgekeerde microscoop om foto's te maken en analyseer vervolgens het aantal migrerende cellen door ten minste 10 willekeurige velden te tellen met ImageJ.
- Voor de getalanalyse met ImageJ opent u de afbeelding in de ImageJ-software, gaat u naar het tabblad Afbeelding in het gereedschapsmenu, selecteert u Aanpassen en klikt u vervolgens op Drempelwaarde. Pas indien nodig de drempelinstellingen aan totdat alleen de cellen zichtbaar zijn tegen een witte achtergrond.
- Klik op Toepassen in het venster Drempel om deze instellingen op de afbeelding toe te passen. Selecteer nu de Toverstaf (overtrekken) tool op de werkbalk (bovenaan het venster).
- Klik op het gebied van de afbeelding waar de cellen zich bevinden om alle cellen in de afbeelding met drempelwaarde te selecteren. Nadat de cellen zijn gemarkeerd, gaat u naar Analyseren in het menu Gereedschap en klikt u vervolgens op Deeltjes analyseren. Voer in het venster Deeltjes analyseren de gewenste grootte (bijv. 0 - oneindig) en circulariteitswaarden (bijv. 0,00 - 1,00) in volgens de experimentele vereisten om alle cellen in de telling op te nemen.
- Klik op OK en wacht tot de software de cellen telt en er een nieuw venster verschijnt met de analyseresultaten.
6. Kolonievormingstest
- Zaad 2 × 105 cellen per putje van Si-NC- en Si-FAM83A-groepen in een plaat met 6 putjes met of zonder 5 μM cisplatine (DDP)-behandeling gedurende 24 uur.
- Na een periode van 24 uur medicamenteuze behandeling, maak de cellen los met 0,25% trypsine en resuspendeer ze in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) dat 10% FBS bevat. Zaai de geresuspendeerde cellen in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 1 × 103 cellen per putje en incubeer vervolgens in een 5% CO2 -incubator bij een temperatuur van 37 °C.
- Na de incubatie gedurende ~7-10 dagen wanneer kolonies zichtbaar zijn, fixeert u de cellen met 4% polyoxymethyleen en kleurt u ze gedurende 20 minuten met Giemsa-kleuringsoplossing.
- Was de cellen lichtjes en laat de platen aan de lucht drogen. Maak foto's van de kolonieclusters met een microscoop en tel het aantal kolonies dat meer dan 50 cellen bevat.
7. Mitochondriale membraandepolarisatie (MMP)-analyse met behulp van JC-1-kleurstof
- Zaad 1,2 × 106 tumorcellen van Si-NC- en Si-FAM83A-groepen in een plaat met zes putjes en kweek gedurende 24 uur met of zonder behandeling met 5 μM cisplatine (DDP).
- Incubeer met 1x JC-1 kleuringsoplossing gedurende 15-20 minuten onder 5% CO2 bij 37 °C met behulp van een mitochondriale membraanpotentiaaltestkit volgens de instructies van de fabrikant.
- Was de cellen en onderzoek ze onder een fluorescerende microscoop met een vergroting van 200x met behulp van excitatie- en emissiegolflengten voor JC-1 bij respectievelijk ~490 nm en 590 nm. Om de JC-1-fluorescentie te visualiseren, gebruikt u geschikte filters, zoals een blauw excitatiefilter (450-490 nm) en een rood emissiefilter (long-pass > 590 nm) om het uitgezonden fluorescentiesignaal selectief op te vangen.
8. Flowcytometrische analyse van mPTP
- Zaad 1,2 × 106 tumorcellen van Si-NC- en Si-FAM83A-groepen in een plaat met zes putjes en kweek gedurende 24 uur met of zonder behandeling met 5 μM cisplatine (DDP).
- Verwijder het kweekmedium uit de cellen, resuspendeer de cellen in PBS en voeg elk 300 μL (1x volume) Calcein AM-kleuringsoplossing en fluorescentie-blusoplossing toe om de cellen gelijkmatig te bedekken. Incubeer de cellen bij 37 °C in een tegen licht beschermde omgeving gedurende 30-45 minuten en vervang het medium door vers voorverwarmd kweekmedium bij 37 °C. Incubeer de cellen bij 37 °C in een tegen licht beschermde omgeving gedurende nog eens 30 minuten om volledige hydrolyse van Calceïne AM door intracellulaire esterasen te garanderen, wat resulteert in de vorming van intracellulaire groen-fluorescerende Calceïne.
- Verwijder het kweekmedium, was de cellen 2-3x met PBS en voeg detectiebuffer toe. Detecteer cel-mPTP met behulp van flowcytometrie en een excitatiegolflengte van 488 nm.
9. Flowcytometrie
- Zaad 1,2 × 106 tumorcellen van Si-NC- en Si-FAM83A-groepen in een plaat met zes putjes en kweek gedurende 24 uur met of zonder behandeling met 5 μM cisplatine (DDP).
- Na 24 uur medicamenteuze behandeling de cellen opnieuw suspenderen in 200 μl bindende bufferoplossing en voorzichtig 10 μl annexine V-FITC en 5 μl propidiumjodide (PI) door de celsuspensie mengen. Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten zonder licht en voeg 300 μL bindende bufferoplossing toe aan de cellen. Detecteer celapoptose met behulp van flowcytometrie bij een excitatiegolflengte van 488 nm.
10. RT-PCR-analyse
- Zaad 1,2 × 106 tumorcellen van Si-NC- en Si-FAM83A-groepen in een plaat met zes putjes en kweek gedurende 24 uur met of zonder behandeling met 5 μM cisplatine (DDP).
- Extraheer totaal RNA uit de tumorcellen met behulp van het RNA-extractiereagens en zet het geëxtraheerde RNA om in complementair DNA (cDNA) met de cDNA-synthesemix door te incuberen bij 42 °C gedurende 45 minuten en vervolgens bij 95 °C gedurende 5 minuten.
- Bereid het PCR-reactiemengsel voor dat DNA-polymerase, nucleotiden, buffer en de ontworpen genspecifieke primers bevat. Voeg de cDNA-sjabloon toe aan het reactiemengsel voor de realtime-PCR-reactie en voer PCR uit op het real-time kwantitatieve PCR-instrument met de volgende thermocyclusomstandigheden: denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 30 s, en de smeltcurvefase bij 95 °C gedurende 15 s; 60 °C gedurende 1 minuut en 95 °C gedurende 15 s. Kwantificeer de mRNA-niveaus met behulp van de 2−ΔΔCq-methode met behulp van GAPDH als interne controle.
OPMERKING: Het RT-PCR-reactiesysteem wordt weergegeven in tabel 1 en de primersequenties worden weergegeven in tabel 1.- Om de 2−ΔΔCq-waarde te berekenen, meet u de Cq-waarden voor het doelgen en het referentiegen (GAPDH) in de monsters. Bereken de ΔCq door de Cq-waarde van het referentiegen af te trekken van de Cq-waarde van het doelgen voor elk monster. Bereken de ΔΔCq door de ΔCq van een controlemonster af te trekken van de ΔCq van elk experimenteel monster. Bereken ten slotte de 2−ΔΔCq-waarde door 2 te verhogen tot de macht van de ΔΔCq-waarde.
NOTITIE: De Cq-waarde vertegenwoordigt het cyclusnummer waarbij het fluorescentiesignaal de ingestelde drempel bereikt.
- Om de 2−ΔΔCq-waarde te berekenen, meet u de Cq-waarden voor het doelgen en het referentiegen (GAPDH) in de monsters. Bereken de ΔCq door de Cq-waarde van het referentiegen af te trekken van de Cq-waarde van het doelgen voor elk monster. Bereken de ΔΔCq door de ΔCq van een controlemonster af te trekken van de ΔCq van elk experimenteel monster. Bereken ten slotte de 2−ΔΔCq-waarde door 2 te verhogen tot de macht van de ΔΔCq-waarde.
11. Western blot-analyse
- Zaad 1,2 × 106 tumorcellen van Si-NC- en Si-FAM83A-groepen in een plaat met zes putjes en kweek gedurende 24 uur met of zonder behandeling met 5 μM cisplatine (DDP).
- Verzamel de gekweekte cellen en was ze met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om eventuele resterende groeimedia of serum te verwijderen. Lyseer de cellen met behulp van RIPA Lysis Buffer met fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) om de cellulaire eiwitten vrij te maken. Incubeer de cellen enkele minuten op ijs om volledige lysis te garanderen en centrifugeer bij 4 °C, 12.000 × g gedurende 15 minuten. Verzamel het supernatans om de eiwitconcentratie te bepalen.
- Bepaal de eiwitconcentratie in het cellysaat met behulp van een BCA Protein Assay Kit volgens de instructies van de fabrikant. Meng het cellysaat met een laadbuffer en verwarm het mengsel gedurende 5-10 minuten op 95-100 °C om de eiwitten te denatureren en een gelijkmatige scheiding op de gel te garanderen.
- Laad van elk monster 30 μg totaal eiwit op een SDS-PAGE-gel en laat de SDS-PAGE draaien onder een constante spanning van 80 V. Stop de elektroforese wanneer het broomfenolblauw de bodem van de scheidingsgel bereikt.
- Breng de gescheiden eiwitten van de gel over op een polyvinyldifluoridemembraan met behulp van een nat overdrachtssysteem op een ijsbad met een stroom van 200 mA gedurende 1,5 uur.
- Blokkeer het membraan met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween-20-buffer (TBST) gedurende 1 uur bij RT en incubeer een nacht bij 4 °C met de respectieve antilichamen vermeld in de materiaaltabel.
- Was het membraan meerdere keren met TBST en incubeer met de secundaire antilichamen (Tabel met materialen) gedurende 1 uur bij RT, gevolgd door wassen met TBST. Visualiseer de eiwitbanden met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit en imagersysteem.
12. Statistische analyse
- Aangezien alle experimentele datapunten onafhankelijk zijn, presenteert u de gegevens als het gemiddelde ± SD. Voer statistische analyses uit.
- Gebruik eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) voor meerdere vergelijkingen en de test van Dunnett om elke groep te vergelijken met de controlegroep. Gebruik de t-toets van de leerling (ongepaarde tweezijdige) om twee groepen te vergelijken; beschouwen P < 0,05 als significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TCGA-database-analyse en PCR-validatie
Op basis van de TCGA-database-analyse hebben we een vergelijkende analyse uitgevoerd van mRNA-expressieniveaus in 306 baarmoederhalskankercelmonsters en 13 normale celmonsters om de differentiële expressie van FAM83A te onderzoeken. FAM83A werd opgereguleerd bij baarmoederhalskanker, terwijl de expressie ervan in normaal baarmoederhalsweefsel verwaarloosbaar was (Figuur 1A). Om meer inzicht te krijgen in de prognostische implicaties van FAM83A-expressie , hebben we een Kaplan-Meier-curveanalyse uitgevoerd. Opvallend was dat patiënten met een hogere FAM83A-expressie een duidelijk slechtere algehele overleving vertoonden (Figuur 1B). Om de rol van FAM83A bij baarmoederhalskanker te bepalen, onderzochten we FAM83A-expressieniveaus in twee baarmoederhalskankercellijnen, HeLa en C33a, evenals in een onsterfelijke baarmoederhalscellijn, End1/E6E7. Met behulp van qRT-PCR hebben we een significante overexpressie van FAM83A waargenomen in de HeLa- en C33a-cellijnen in vergelijking met de End1/E6E7-cellijn (Figuur 1C). Deze bevindingen onderstrepen het belang van FAM83A in de context van baarmoederhalskanker.
Proliferatie- en apoptose-experimenten om de biologische functie van FAM83A bij baarmoederhalskanker te verifiëren
Om de functionele rol van FAM83A bij baarmoederhalskanker te onderzoeken, gebruikten we siRNA-gemedieerde knockdown van FAM83A in C33a- en HeLa-cellen (Figuur 2A,B). Vervolgens beoordeelden we de impact van FAM83A-onderdrukking op celproliferatie. EdU-kleuring onthulde dat verminderde expressie van FAM83A de celproliferatie in zowel C33a- als HeLa-cellen aanzienlijk remde (Figuur 2C-F). Onsterfelijke kwaadaardige cellen worden geassocieerd met extreem lage apoptosepercentages10. Daarom werden de niveaus van anti- en proapoptotische eiwitten beoordeeld in de controle- en si-FAM83A-behandelde baarmoederhalskankercellen. Western blot-analyses toonden aan dat onderdrukte expressie van FAM83A de expressie van Bax- en gespleten caspase3-eiwitten (proapoptotische eiwitten) verhoogde, de expressie van Bcl-2 (anti-apoptotisch eiwit) verminderde en de afgifte van Cytc verhoogde (Figuur 2C-E), wat consistent is met de observatie dat anti-apoptotische eiwitten apoptose reguleren door de mitochondriale afgifte van Cytc te blokkeren (Figuur 2G-J)10. Gezamenlijk suggereerden deze gegevens dat FAM83A een belangrijke rol speelt bij het reguleren van de proliferatie en apoptose van baarmoederhalskankercellen.
Wondgenezing en poreuze membraaninsert-assays om de biologische functie van FAM83A bij baarmoederhalskanker te verifiëren
Wondgenezings- en membraaninsert-assays werden uitgevoerd om de effecten van FAM83A-onderdrukking op de migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat baarmoederhalskankercellen met onderdrukte FAM83A-expressie minder efficiënt migreerden (Figuur 3A-D) en binnendrongen (Figuur 3E-H) dan de controlecellen.
Effecten op de mitochondriale functie en PI3K/AKT-signaleringsroute
Gezien de rol van PI3K/AKT in de inductie van celapoptose, wilden we bepalen of de onderdrukking van FAM83A-expressie de constitutieve fosforylering van de PI3K/Akt/mTOR-route bij baarmoederhalskanker zou remmen. Onderdrukking van FAM83A remde significant de belangrijkste gefosforyleerde eiwitniveaus in de PI3K/Akt/mTOR-route, waaronder p-PI3K, p-Akt en p-mTOR in c333a- en HeLa-cellen (Figuur 4A-D). Mitochondriën zijn de organellen die verantwoordelijk zijn voor het cellulaire metabolisme en de inductie van celapoptose. Steeds meer bewijs geeft aan dat apoptose van kankercellen mitochondriale disfunctie omvat via de intrinsieke mitochondriale route als gevolg van verbeterde mitochondriale permeabiliteit en de afgifte van proapoptotische moleculen zoals Cytc in het cytoplasma10. De PI3K/AKT-route zou de translocatie van Bax in de mitochondriën kunnen reguleren, waardoor Cytc-afgifte wordt geïnduceerd als reactie op apoptotische stimuli. Daarom is het denkbaar dat de oncogene componenten van de PI3K-AKT-signaleringsroute de apoptose van cellen rechtstreeks reguleren door het mitochondriaal gedrag te beïnvloeden. Daarom werd een live-cell mitochondriale permeabiliteit overgangsporie (mPTP) -test uitgevoerd om de mitochondriale status te bepalen. mPTP-opening wordt in verband gebracht met apoptotische en necrotische celdood11. In deze test wordt een groene fluorescerende kleurstof (calceïne AM) vastgehouden in het cytoplasma en de mitochondriën wanneer de mPTP wordt gesloten, terwijl de kleurstof in het cytoplasma wordt gedoofd door CoCl2, waardoor alleen de intensieve fluorescentie in de mitochondriën overblijft. De resultaten toonden aan dat celpopulaties met intense groene fluorescentie in de mitochondriën significant afnamen na FAM83A-onderdrukking, wat wijst op een geopende mPTP (Figuur 4E,F). Verder onderzochten we de veranderingen in de mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) met behulp van JC-1-kleuring. JC-1 vormt aggregaten (rode fluorescentie) in levende cellen die intacte mitochondriën bevatten met een hoog membraanpotentiaal en monomeren (groene fluorescentie) onder laag MMP in apoptotische cellen. De onderdrukking van FAM83A verminderde MMP geleidelijk (Figuur 4G).
Analyse van de gevoeligheid voor geneesmiddelen voor proliferatie en invasie
Chemotherapie op basis van cisplatine (DDP) is een standaardbehandelingsstrategie voor baarmoederhalskanker. Chemorest blijft echter een uitdaging. We onderzochten de rol van FAM83A bij de behandeling van baarmoederhalskanker met cisplatine. Controle-, si-NC-behandelde en si-FAM83A-behandelde HeLa-cellen werden behandeld met of zonder 5 μM cisplatine12. Verder werden de effecten van FAM83A-onderdrukking op de levensvatbaarheid van cellen beoordeeld. DDP induceerde een significanter remmend effect op de proliferatie van HeLa-cellen na FAM83A-onderdrukking , vergeleken met alleen DDP-behandeling (Figuur 5A en Figuur 5C). Na de behandeling van baarmoederhalskankercellen met 5 μM cisplatine, remde FAM83A-onderdrukking ook de celinvasie (Figuur 5B en Figuur 5D).
Analyse van de gevoeligheid voor geneesmiddelen voor de mitochondriale functie
Door met Si-NC behandelde en si-FAM83A-behandelde HeLa-cellen te behandelen met of zonder 5 μM cisplatine (DDP), evalueerden we het mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) en beoordeelden we de mitochondriale schade veroorzaakt door celdood met behulp van JC-1-kleuring. DDP veroorzaakte meer mitochondriale schade, zoals blijkt uit een afname van het JC-1-monomeerpercentage na FAM83A-knockdown, vergeleken met alleen DDP-behandeling (Figuur 6A en Figuur 6D). Na de behandeling van baarmoederhalskankercellen met 5 μM cisplatine, remde FAM83A knockdown ook de kolonievorming (Figuur 6B en Figuur 6E) en verbeterde celapoptose (Figuur 6C en Figuur 6F). Bovendien verhoogde FAM83A-knockdown in aanwezigheid van DDP de expressie van proapoptotische eiwitten, Bax en gespleten caspase3 aanzienlijk, bevorderde het de afgifte van Cytc en verminderde het de expressie van Bcl-2 (Figuur 6G,H). Deze resultaten gaven aan dat FAM83A baarmoederhalskankercellen via apoptose-inductie gevoelig maakte voor DDP.
Figuur 1: FAM83A overexpressie in baarmoederhalskankercellen en correlatie met slechtere prognose. (A) Boxplot-analyse van de mRNA-niveaus van FAM83A in baarmoederhalskankermonsters. (B) Kaplan-Meier-analyse van FAM83A-expressie voor de bepaling van de totale overleving bij patiënten met baarmoederhalskanker. (C) Relatieve mRNA-niveaus van FAM83A in baarmoederhalskankercellijnen HeLa en C33a en menselijke onsterfelijke baarmoederhalscellijn End1/E6E7. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD voor drie onafhankelijke experimenten. *P < 0,05, vergeleken met End1/E6E7-cellen die eenrichtings-ANOVA gebruiken. Afkortingen: CESE = Cervicaal plaveiselcelcarcinoom en endocervicaal adenocarcinoom; HR = hazard ratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effecten van onderdrukking van FAM83A op de proliferatie en apoptose van baarmoederhalskanker. C33a- en HeLa-cellen werden getransfecteerd met FAM83A-specifieke siRNA's. (A,B) mRNA-niveaus van FAM83A werden beoordeeld in baarmoederhalskankercellijnen met behulp van qRT-PCR.Celproliferatie in (C) C33a- en (D) HeLa-cellen werd bepaald met behulp van de EdU-test. (E,F) De EDU-fluorescentiebeelden van C33a- en Hela-cellen. (G-J) Western blot-analyse voor het onderzoeken van de niveaus van apoptose-gerelateerde eiwitten, waaronder Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 en cleaved-caspase-3; GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD voor drie onafhankelijke experimenten. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, vergeleken met controlecellen die eenrichtings-ANOVA gebruiken. Afkortingen: NC = negatieve controle; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; CytC = cytochroom C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effect van FAM83A op de migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen in vitro. (A-D) Wondgenezingstest werd uitgevoerd om de celmigratie te beoordelen. De beelden werden genomen om 0, 24 en 48 uur. (E-H) Transwell-tests werden uitgevoerd om celinvasie te onderzoeken. Schaalbalken = 100 μm (E,F). De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD voor drie onafhankelijke experimenten. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, vergeleken met controlecellen die eenrichtings-ANOVA gebruiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effect van FAM83A-onderdrukking op de PI3K/AKT/mTOR-route en de mitochondriale functie. (A-D) Western blot-analyse om de niveaus van eiwitten uit de PI3K/AKT/mTOR-route in C33a- en HeLa-cellen te bepalen na FAM83A-onderdrukking. (E-H) Mitochondriale membraanpotentiaalanalyse met behulp van JC-1-kleuring. JC-1-aggregaten werden rood gekleurd en JC-1-monomeren werden groen gekleurd, wat wijst op een lagere MMP. (I,J) De mitochondriale permeabiliteit werd beoordeeld met behulp van een mPTP-kit en flowcytometrie. Schaalbalken = 50 μm (E, F). De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD voor drie onafhankelijke experimenten. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, vergeleken met controlecellen die eenrichtings-ANOVA gebruiken. Afkortingen: MMP = mitochondriale membraanpotentiaal; mPTP = mitochondriale permeabiliteit overgangsporie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effecten van FAM83A-onderdrukking op remming door DDP op celproliferatie en invasie van baarmoederhalskankercellen. HeLa-cellen werden getransfecteerd met si-NC of si-FAM83A en behandeld met of zonder 5 μM DDP. (A,C) Effect van DDP op de celproliferatie in controle, si-NC-behandelde en si-FAM83-behandelde HeLa-cellen. (B,D) Effect van DDP op de celinvasie in controle, si-NC-behandelde en si-FAM83-behandelde HeLa-cellen. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD voor drie onafhankelijke experimenten. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 in vergelijking met de controlecellen. &&P < 0,01; &&&P < 0,001, vergeleken met DDP met eenrichtings-ANOVA. Afkortingen: DDP = diaminedichloorplatina; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Effecten van FAM83A-onderdrukking op de effecten van DDP op apoptose in baarmoederhalskankercellen. HeLa-cellen werden getransfecteerd met si-NC of si-FAM83A en behandeld met of zonder 5 μM DDP. (A,D) MMP-analyse met behulp van JC-1-kleuring. (B,E) Resultaten van het klonen van platen. (C,F) Flowcytometrie detecteert apoptosepercentages in verschillende behandelingsgroepen. (G,H) Western blot-analyse van mitochondriën-gerelateerde apoptotische eiwitten, waaronder Bcl-2, Bax, Cytc en het stroomafwaarts gespleten caspase-3. GAPDH werd gebruikt als laadcontrole. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD voor drie onafhankelijke experimenten. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 in vergelijking met de controlecellen. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001, vergeleken met DDP met eenrichtings-ANOVA. Afkortingen: DDP = diaminedichloorplatina; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: siRNA, qRTPCR-primers en de qRT-PCR-reactieopstelling die in deze studie is gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het onderzoek naar tumordoelgenen is van het grootste belang voor zowel de preventie als de behandeling van baarmoederhalskanker. Inzicht in de specifieke genen die een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling en progressie van baarmoederhalskanker biedt waardevol inzicht in de onderliggende moleculaire mechanismen van de ziekte. Bovendien kan het identificeren van deze doelgenen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën en gerichte therapieën. In deze studie beschrijven we het gebruik van TCGA-datasetanalyse om FAM83A als doelgen te identificeren en de mechanistische rol ervan bij baarmoederhalskanker te onderzoeken. We zien een significant hoge expressie van FAM83A in baarmoederhalskankercellen, wat geassocieerd is met een slechte prognose van patiënten met baarmoederhalskanker. Een reeks celgebaseerde experimenten onthulde een hoge FAM83A-expressie in baarmoederhalskankercellen, die een cruciale rol speelt bij het reguleren van celproliferatie, migratie en invasie. Onderdrukking van FAM83A-expressie remde proliferatie en migratie en bevorderde apoptose in baarmoederhalskankercellen.
Het construeren van FAM83A-knockdown baarmoederhalskankercellijnen is de meest kritische stap in deze studie. siRNA's worden ontworpen en gevalideerd op basis van de doelgensequenties om hun effectiviteit te garanderen. Verder worden de baarmoederhalskankercellijnen getransfecteerd met behulp van siRNA. Het slagingspercentage van plasmidetransfectie is cruciaal voor volgende experimenten, die een strikte controle van de celdichtheid en plasmidedichtheid vereisen. Verder wordt de transfectie-efficiëntie waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop om ervoor te zorgen dat latere experimenten kunnen worden uitgevoerd. Western blotting en qRT-PCR resultaten bevestigen dat de remming van FAM83A de PI3K/AKT route onderdrukte en mitochondriale disfunctie induceerde. Onze hypothese is dat het mechanisme de remming van de translocatie van Bax van het cytoplasma naar de mitochondriën door PI3K/AKT inhoudt, watde overleving van cellen bevordert.
Vooruitgang in de behandeling van baarmoederhalskanker heeft het mogelijk gemaakt om nieuwe doelmoleculen te ontwikkelen. De identificatie van een nieuw oncogen kan therapeutisch worden toegepast om de klinische prognose van cervicale maligniteiten te verbeteren14,15. In deze studie hebben we met succes een FAM83A-knockdown-systeem gebouwd in HeLa- en C33a-cellen en de effecten van FAM83A-knockdown op baarmoederhalskankercellen op cellulair niveau geverifieerd. We stellen voor dat de remming van FAM83A kan worden gebruikt om baarmoederhalskanker te behandelen.
Deze studie heeft echter enkele beperkingen. Ten eerste voert deze studie alleen genscreening uit via de database en ontbreken pathologische gegevens van klinische patiënten. Ten tweede heeft deze studie het effect alleen in vitro gevalideerd en waren verdere in vivo studies nodig om de resultaten te verifiëren. Desalniettemin kunnen de methoden van doelgenidentificatie, gen-knock-out en cellulaire validatie om gerichte therapeutische loci te identificeren die in deze studie zijn uitgewerkt, onderzoeksideeën opleveren voor de ontdekking en validatie van doelgenen voor andere ziekten.
Samengevat werd FAM83A tot overexpressie gebracht en gecorreleerd met een slechtere prognose bij baarmoederhalskanker. FAM83A reguleert de proliferatie, migratie en invasie van baarmoederhalskankercellen. Onderdrukking van FAM83A-geïnduceerde mitochondriale disfunctie en apoptose, sensibilisering van baarmoederhalskankercellen voor cisplatine. Deze resultaten gaven aan dat FAM83A een geschikt onderzoeksdoel is voor de behandeling van baarmoederhalskanker. Deze studie droeg bij aan de vooruitgang in adjuvante chemotherapie gericht op het verbeteren van de prognose van patiënten met baarmoederhalskanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenverstrengeling in dit werk.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (nr. 2020HC06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L.
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L.
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
