Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Knockdown av FAM83A för att verifiera dess roll i livmoderhalscancercelltillväxt och cisplatinkänslighet

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65667
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Här visar vi procedurerna för FAM83A knockdown; Analyser för att upptäcka dess effekter på proliferation, migration och invasion av livmoderhalscancerceller. och sensibilisering av dessa celler för cisplatin. Denna studie ger en lovande målgen för livmoderhalscancer och en referens för vidare läkemedelsforskning.

Abstract

Utforskningen av tumörmålgener är av största vikt för förebyggande och behandling av livmoderhalscancer. I denna studie beskriver vi de steg som är involverade i identifieringen av en tumörmålgen FAM83A i livmoderhalscancer. Först användes Cancer Genome Atlas-datasetet för att validera uttrycket och den prognostiska betydelsen av FAM83A hos kvinnor. Ett litet interfererande RNA (siRNA) användes för att slå ut FAM83A-genen i HeLa- och C33a-celler . Därefter utfördes 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) färgning för att bestämma effekterna på tumörcellernas spridningsförmåga. Sårläkning och analyser av porösa membraninsatser utfördes för att utvärdera tumörcellers migrations- och invasionsförmåga.

Western blotting användes för att kvantifiera apoptosrelaterade proteinnivåer. JC-1-färgning användes för att utvärdera mitokondriella funktionsförändringar. Dessutom användes cisplatinintervention (diamindiklorplatina, DDP) för att bedöma målgenens terapeutiska potential. Flödescytometri och kolonibildningsanalyser utfördes för att ytterligare validera genens anticanceregenskaper. Som ett resultat av detta visade sig FAM83A-knockdown hämma proliferation, migration och invasion av livmoderhalscancerceller och sensibilisera dessa celler för cisplatin. Dessa omfattande metoder validerar tillsammans FAM83A som en tumörassocierad målgen, vilket är lovande som ett potentiellt terapeutiskt mål för förebyggande och behandling av livmoderhalscancer.

Introduction

Livmoderhalscancer är ett globalt problem eftersom det är en av de ledande typerna av gynekologisk malignitet i världen och är den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet hos kvinnor1. Radikal kirurgi och kemoradioterapi är förknippade med hög läkningsgrad i det primära skedet. Behandlingsresultaten för patienter i det framskridna stadiet av livmoderhalscancer som utvecklar metastaserad sjukdom är dock mycket ogynnsamma2. Därför är det viktigt att ytterligare förstå de biologiska mekanismerna bakom migration och invasion av livmoderhalscancerceller och identifiera potentiella terapeutiska mål för förebyggande och behandling av denna sjukdom.

Att identifiera målgener som är involverade i cancerprogression och hitta sätt att hämma deras uttryck eller verkan är lovande behandlingsalternativ. I denna studie identifierade vi FAM83 som en cancerframkallande gen och undersökte vidare dess hämmande effekter på C33a- och HeLa-celler. FAM83-familjens onkogener (FAM83A-H) rapporteras i stor utsträckning i cancer hos människa 3,4. Nyligen rapporterades FAM83A vara uppreglerad i lungcancer5, bröst6, äggstockar7 och bukspottkörtel8, vilket indikerar att FAM83A spelar en viktig roll i cancerprogression genom att främja proliferation, invasion, stamcellsliknande egenskaper och läkemedelsresistens i tumörcellerna. FAM83A identifierades som en av de nya kandidatgenerna som är associerade med progression av cervikala lesioner och carcinogenes9. Trots bekräftelsen av förhöjt FAM83A-uttryck i humana livmoderhalscancerceller, är den specifika effekten och de underliggande mekanismerna för FAM83A vid livmoderhalscancer fortfarande oklara.

I denna studie beskriver vi de protokoll som är involverade i identifieringen av FAM83A som en tumörmålgen vid livmoderhalscancer och använder ett litet interfererande RNA (siRNA) för knockdown av FAM83A-genen i HeLa- och C33a-celler . 5-Ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU) färgning utfördes för att bestämma effekterna på tumörcellsproliferation, medan sårläkning och porösa membraninsatsanalyser hjälpte till att utvärdera tumörcellmigration och invasionsförmåga.

Western blotting utfördes för att bestämma nivåerna av apoptosrelaterade proteiner, och JC-1-färgning användes för att utvärdera mitokondriella funktionsförändringar. Således rapporterade vi att FAM83A spelar en avgörande roll i cellproliferation, metastasering och invasion vid livmoderhalscancer. Genom PI3K/AKT-pathway-associerad mitokondriell dysfunktion och apoptos gjorde FAM83A knockdown livmoderhalscancerceller känsliga för cisplatin (diamindiklorplatina, DDP). Denna studie ger ett nytt mål för livmoderhalscancer och möjligen andra cancerformer och en referens för utveckling av strategier för att övervinna cancercellers resistens mot vissa kemoterapeutiska läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studien var helt i linje med TCGA:s (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines) publiceringsriktlinjer. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.

1. Datakälla och bioinformatisk analys

  1. Skaffa RNA-sekvenseringsdata från databasen Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) för klusteranalys. Använd GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), ett webbaserat verktyg för att omberäkna rådata för RNA-Seq från prover från TCGA-projekt, för att screena för potentiella cancerläkemedelsmål med en standardbearbetningspipeline.
    OBS: GEPIA-webbplatsen är fritt tillgänglig för alla användare.
  2. Gå till GEPIA:s hemsida och klicka på Cancer Type Analysis, välj alternativet Differential genes analysis och ställ in följande parametrar: Cancer name = CESE (definieras som Cervikal skivepitelcancer och endocervikal adenocarcinom på denna webbsida), |Log2FC| Cutoff = 1, q-värde Cutoff = 0,01, Differentialmetoder = ANOVA, och Kromosomfördelning = båda. Klicka sedan på Lista för att få en genlista som visar differentiellt uttryck mellan tumör- och normala grupper.
    OBS: Det krävs en omfattande litteraturgenomgång för att identifiera differentiellt uttryckta kandidatgener. I denna studie, med utgångspunkt i den tillgängliga litteraturen, fokuserar vi på den tumörgen som är av intresse, FAM83A.
  3. Undersök sedan uttrycket av FAM83A i livmoderhalscancer och normal vävnad med hjälp av GEPIA genom att gå vidare till alternativet Expression DIY på webbplatsen och välj Boxplot som diagramtyp. Mata in FAM83A i fältet för genparametrar och ställ in följande parametrar: |Log2FC| Gränsvärde = 1; q-värde Cutoff = 0,01. Välj CESE som cancernamn och Matcha TCGA-normaldata för datafältet Matchad normal , och lämna alla andra inställningar som standard. Klicka på Plot och låt webbplatsen generera ett boxplot som representerar det differentiella uttrycket av FAM83A-genen ; Spara lådagrammet för framtida referens och analys.
  4. Slutligen analysera den totala överlevnaden hos patienter som bär tumörer med olika nivåer av FAM83A-uttryck i livmoderhalscancer. Navigera till alternativet Survival Plots på webbplatsen, ställ in genen på FAM83A och välj Overall Survival som analystyp. Lägg till tumörnamnet CESE, välj Månader för axelenheterna och lämna alla andra parametrar på standardinställningarna. Klicka på Plot och låt webbplatsen generera ett diagram över överlevnadskurvan; Spara det här diagrammet för framtida referens och analys.
  5. Ta hänsyn till både det differentiella uttrycket av FAM83A i tumörer och dess korrelation med patientöverlevnadsanalys för att identifiera FAM83A som en potentiell terapeutisk målgen vid livmoderhalscancer.

2. Cellbaserade experiment

  1. Cellodling
    1. Odla humana tumörcellinjer i det modifierade mediet vid 37 °C i en fuktad 5 % CO2 atmosfär.
      OBS: Se materialtabellen för cellinjeinformation och odlingsmediumkomponenter.
  2. Transfektion av celler
    1. Använd siRNA för att slå ner FAM83A-uttrycket i cellerna.
      OBS: Se tabell 1 för den specifika siRNA-sekvensen.
    2. Fröceller i 6-brunnsplattor och inkubera med blandningen av 50 nM si-FAM83A eller siRNA-NC och 8 μL transfektionsmedel eller endast 8 μL transfektionsmedel i 4-6 timmar efter att ha uppnått 50%-70% sammanflöde. Tillsätt endast serumfri DMEM till den negativa kontrollen.
    3. Efter inkubationen ersätts det medium som innehåller transfektionsmedlet med DMEM + 10 % fetalt kalvserum. Vidare, 48 timmar efter transfektion, behandla med 5 μM cisplatin (DDP) i 24 timmar som avsett och skörda alla celler för total RNA-extraktion och qRT-PCR-analys.

3. EdU-detektion för cellproliferationsanalys

OBS: Använd EdU Cell Proliferation Kit för att bedöma cellproliferation in vitro enligt tillverkarens instruktioner.

  1. Frö cellerna i 6-hålsplattor och inkubera dem med 10 μM EdU-lösning i 2 timmar. Fixera cellerna med 4 % paraformaldehyd i 15 min vid rumstemperatur (RT) och permeabilisera med 0,3 % Triton X-100 i PBS i 10 min vid RT.
  2. Ta bort permeabiliseringsbufferten och tillsätt 500 μl 1x reaktionslösning. Inkubera sedan i 30 minuter vid RT i mörker för kärnfärgning.
  3. Färga celler med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och visualisera dem under ett fluorescensmikroskop vid 200x förstoring. Färga kärnorna i de prolifererande cellerna med EdU och undersök dem för röd fluorescens.
  4. Slutligen kan du använda programvara för att kvantifiera resultaten genom att räkna minst 10 slumpmässiga fält och beräkna proliferationshastigheterna med hjälp av förhållandet mellan de fluorescerande positiva cellerna och de totala cellerna.

4. Analys av sårläkning

  1. Fröceller i 6-brunnars plattor med en densitet av 2 × 105 celler per brunn.
  2. När cellerna uppnår 90 % sammanflöde, använd en steril 10 μL mikropipettspets för att försiktigt skapa en linjär repa i cellmonolagret. Skölj försiktigt brunnarna med steril PBS för att ta bort eventuella lossnade celler och skräp som orsakats av repor.
  3. Inkubera sedan cellerna i medium som innehåller 1% FBS. Observera och ta sedan bilder med det inverterade mikroskopet för läkning av det sårade området vid 12, 24 och 48 timmar.

5. Analys av porös membraninsats

  1. Bered en cellsuspension i cellodlingsmedium vid önskad cellkoncentration (innehållande 4 × 104 celler), inklusive transfekterade C33a-celler eller kontrollceller och HeLa. Tillsätt cellsuspensionen till den övre kammaren på membraninsatserna, vilket säkerställer en jämn fördelning. Tillsätt hela mediet till den nedre kammaren.
  2. Efter inkubation i 24 timmar används metylalkohol och 0,1 % kristallviolett för fixering respektive färgning av cellerna som migrerar till de nedre kamrarna.
  3. Använd ett inverterat mikroskop för att ta bilder och analysera sedan antalet migrerande celler genom att räkna minst 10 slumpmässiga fält med ImageJ.
    1. För nummeranalysen med ImageJ, öppna bilden i ImageJ-programvaran, gå till fliken Bild i verktygsmenyn, välj Justera och klicka sedan på Tröskel. Justera tröskelinställningarna, om det behövs, tills endast cellerna är synliga mot en vit bakgrund.
    2. Klicka på Verkställ i fönstret Tröskelvärde för att tillämpa dessa inställningar på bilden. Välj nu verktyget Trollstav (spårning) från verktygsfältet (högst upp i fönstret).
    3. Klicka på det område i bilden där cellerna finns för att markera alla celler i den tröskelförsedda bilden. När cellerna är markerade, gå till Analysera i verktygsmenyn och klicka sedan på Analysera partiklar. I fönstret Analysera partiklar anger du önskad storlek (t.ex. 0 - oändlighet) och cirkularitetsvärden (t.ex. 0,00 - 1,00) enligt de experimentella kraven för att inkludera alla celler i räkningen.
    4. Klicka på OK och vänta tills programmet räknar cellerna och tills ett nytt fönster visas med analysresultaten.

6. Analys av kolonibildning

  1. Sådd av 2 × 105 celler per brunn i grupperna Si-NC och Si-FAM83A i en platta med 6 brunnar med eller utan behandling med 5 μM cisplatin (DDP) i 24 timmar.
  2. Efter en 24 timmars läkemedelsbehandling lösgör man cellerna med 0,25 % trypsin och återsuspenderar dem i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10 % FBS. Frö de återsuspenderade cellerna i en 6-hålsplatta med en densitet av 1 × 103 celler per brunn och inkubera sedan i en 5 % CO2 -inkubator vid en temperatur av 37 °C.
  3. Efter inkubationen i ~7-10 dagar när kolonier är synliga, fixera cellerna med 4% polyoximetylen och färga dem med Giemsa-färgningslösning i 20 minuter.
  4. Tvätta cellerna lätt och låt plattorna lufttorka. Ta bilder av koloniklustren med mikroskop och räkna antalet kolonier som innehåller mer än 50 celler.

7. Analys av mitokondriell membrandepolarisering (MMP) med JC-1-färgämne

  1. Frö 1,2 × 106 tumörceller från Si-NC- och Si-FAM83A-grupperna till en platta med sex brunnar och odla i 24 timmar med eller utan 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
  2. Inkubera med 1x JC-1 färgningslösning i 15-20 minuter under 5 %CO 2 vid 37 °C med hjälp av en mitokondriell membranpotentialanalyssats enligt tillverkarens instruktioner.
  3. Tvätta cellerna och undersök dem i ett fluorescerande mikroskop vid 200x förstoring med excitations- och emissionsvåglängder för JC-1 vid ~490 nm respektive 590 nm. För att visualisera JC-1-fluorescensen, använd lämpliga filter, såsom ett blått excitationsfilter (450-490 nm) och ett rött emissionsfilter (långpass > 590 nm) för att selektivt fånga den emitterade fluorescenssignalen.

8. Flödescytometrisk analys av mPTP

  1. Frö 1,2 × 106 tumörceller från Si-NC- och Si-FAM83A-grupperna till en platta med sex brunnar och odla i 24 timmar med eller utan 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
  2. Ta bort odlingsmediet från cellerna, återsuspendera cellerna i PBS och tillsätt 300 μL vardera (1 volym) Calcein AM-färgningslösning och fluorescenssläckande arbetslösning för att täcka cellerna jämnt. Inkubera cellerna vid 37 °C i en ljusskyddad miljö i 30–45 minuter och ersätt mediet med ett färskt förvärmt odlingsmedium vid 37 °C. Inkubera cellerna vid 37 °C i en ljusskyddad miljö i ytterligare 30 minuter för att säkerställa fullständig hydrolys av Calcein AM med intracellulära esteraser, vilket resulterar i generering av intracellulärt grönfluorescerande kalcein.
  3. Ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna 2-3 gånger med PBS och tillsätt detektionsbuffert. Detektera cell-mPTP med hjälp av flödescytometri och en excitationsvåglängd på 488 nm.

9. Flödescytometri

  1. Frö 1,2 × 106 tumörceller från Si-NC- och Si-FAM83A-grupperna till en platta med sex brunnar och odla i 24 timmar med eller utan 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
  2. Efter 24 timmars läkemedelsbehandling suspenderas cellerna på nytt i 200 μl bindande buffertlösning och 10 μl annexin V-FITC och 5 μl propidiumjodid (PI) blandas försiktigt i cellsuspensionen. Inkubera blandningen i 15 minuter utan ljus och tillsätt 300 μl bindande buffertlösning till cellerna. Detektera cellapoptos med hjälp av flödescytometri vid en excitationsvåglängd på 488 nm.

10. RT-PCR-analys

  1. Frö 1,2 × 106 tumörceller från Si-NC- och Si-FAM83A-grupperna till en platta med sex brunnar och odla i 24 timmar med eller utan 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
  2. Extrahera totalt RNA från tumörcellerna med hjälp av RNA-extraktionsreagenset och omvandla det extraherade RNA:t till komplementärt DNA (cDNA) med cDNA-syntesblandningen genom inkubation vid 42 °C i 45 minuter och sedan vid 95 °C i 5 minuter.
  3. Bered PCR-reaktionsblandningen som innehåller DNA-polymeras, nukleotider, buffert och de designade genspecifika primers. Tillsätt cDNA-mallen till reaktionsblandningen för realtids-PCR-reaktionen och utför PCR på det kvantitativa realtids-PCR-instrumentet med följande termocykelbetingelser: denaturering vid 95 °C i 30 s, följt av 40 cykler med 95 °C i 5 s och 60 °C i 30 s, och smältkurvan vid 95 °C i 15 s. 60 °C i 1 min och 95 °C i 15 s. Kvantifiera mRNA-nivåerna med hjälp av 2−ΔΔCq− metoden med GAPDH som intern kontroll.
    OBS: RT-PCR-reaktionssystemet visas i tabell 1 och primersekvenserna visas i tabell 1.
    1. För att beräkna 2−ΔΔCq− värdet, mät Cq−värdena för målgenen och referensgenen (GAPDH) i proverna. Beräkna ΔCq genom att subtrahera referensgenens Cq-värde från målgenens Cq-värde för varje prov. Beräkna ΔΔCq genom att subtrahera ΔCq för ett kontrollprov från ΔCq för varje experimentprov. Beräkna slutligen 2−ΔΔCq− värdet genom att upphöja 2 upphöjt till ΔΔCq−värdet.
      OBS: Cq-värdet representerar cykelnumret vid vilket fluorescenssignalen når det inställda tröskelvärdet.

11. Western blot-analys

  1. Frö 1,2 × 106 tumörceller från Si-NC- och Si-FAM83A-grupperna till en platta med sex brunnar och odla i 24 timmar med eller utan 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
  2. Samla in de odlade cellerna och tvätta dem med iskall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att avlägsna eventuella kvarvarande odlingssubstrat eller serum. Lysera cellerna med hjälp av RIPA Lysis Buffer som innehåller fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) för att frigöra de cellulära proteinerna. Inkubera cellerna på is i några minuter för att säkerställa fullständig lys och centrifugera vid 4 °C, 12 000 × g i 15 minuter. Samla in supernatanten för att bestämma dess proteinkoncentration.
  3. Bestäm proteinkoncentrationen i celllysatet med hjälp av ett BCA-proteinanalyskit enligt tillverkarens instruktioner. Blanda celllysatet med en laddningsbuffert och värm blandningen vid 95-100 °C i 5-10 minuter för att denaturera proteinerna och säkerställa en jämn separation på gelen.
  4. Från varje prov tillsätts 30 μg totalt protein i en SDS-PAGE-gel och SDS-PAGE körs under en konstant spänning på 80 V. Avbryt elektroforesen när bromfenolblått når botten av separationsgelen.
  5. Överför de separerade proteinerna från gelen till ett polyvinyldifluoridmembran med hjälp av ett våtöverföringssystem i ett isbad med en ström på 200 mA i 1,5 timmar.
  6. Blockera membranet med 5 % fettfri mjölk i Tris-buffrad koksaltlösning med 0,05 % Tween-20-buffert (TBST) i 1 timme vid RT och inkubera över natten vid 4 °C med respektive antikroppar som anges i materialförteckningen.
  7. Tvätta membranet flera gånger med TBST och inkubera med de sekundära antikropparna (Materialförteckning) i 1 timme vid RT, följt av tvättning med TBST. Visualisera proteinbanden med hjälp av ett förbättrat kemiluminescensdetektionskit och imager-system.

12. Statistisk analys

  1. Eftersom alla experimentella datapunkter kommer att vara oberoende av varandra, presentera data som medelvärdet ± SD. Utför statistisk analys.
  2. Använd envägsanalys av varians (ANOVA) för multipla jämförelser och Dunnetts test för att jämföra varje grupp med kontrollgruppen. Använd Students t-test (oparat tvåsidigt) för att jämföra två grupper; anser att P < 0,05 är signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TCGA-databasanalys och PCR-validering

Från TCGA-databasanalysen genomförde vi en jämförande analys av mRNA-uttrycksnivåer i 306 cellprover från livmoderhalscancer och 13 normala cellprover för att undersöka det differentiella uttrycket av FAM83A. FAM83A var uppreglerad vid livmoderhalscancer, medan dess uttryck i normal livmoderhalsvävnad var försumbart (Figur 1A). För att få ytterligare insikter i de prognostiska implikationerna av FAM83A-uttryck utförde vi en Kaplan-Meier-kurvanalys. Slående är att patienter med högre FAM83A-uttryck uppvisade en markant sämre total överlevnad (Figur 1B). För att bestämma FAM83A :s roll vid livmoderhalscancer undersökte vi FAM83A-uttrycksnivåerna i två livmoderhalscancercellinjer, HeLa och C33a, samt i en odödliggjord livmoderhalscellinje, End1/E6E7. Med hjälp av qRT-PCR observerade vi ett signifikant överuttryck av FAM83A i HeLa- och C33a-cellinjerna jämfört med End1/E6E7-cellinjen (Figur 1C). Dessa fynd understryker betydelsen av FAM83A i samband med livmoderhalscancer.

Proliferations- och apoptosexperiment för att verifiera den biologiska funktionen av FAM83A vid livmoderhalscancer

För att undersöka FAM83A:s funktionella roll i livmoderhalscancer använde vi siRNA-medierad knockdown av FAM83A i C33a- och HeLa-celler (Figur 2A,B). Vi utvärderade sedan effekten av FAM83A-suppression på cellproliferation. EdU-färgning visade att minskat uttryck av FAM83A signifikant hämmade cellproliferation i både C33a- och HeLa-celler (Figur 2C-F). Odödliga maligna celler är associerade med extremt låg apoptosfrekvens10. Därför utvärderades nivåerna av anti- och proapoptotiska proteiner i kontroll- och si-FAM83A-behandlade livmoderhalscancerceller. Western blot-analyser visade att undertryckt uttryck av FAM83A ökade uttrycket av Bax och klyvda kaspas3-proteiner (proapoptotiska proteiner), minskade uttrycket av Bcl-2 (antiapoptotiskt protein) och ökade Cytc-frisättningen (Figur 2C-E), vilket överensstämmer med observationen att antiapoptotiska proteiner reglerar apoptos genom att blockera mitokondriell frisättning av Cytc (Figur 2G-J)10. Sammantaget tyder dessa data på att FAM83A spelar en viktig roll i regleringen av cellproliferation och apoptos i livmoderhalscancer.

Sårläknings- och porösa membraninterventionsanalyser för att verifiera den biologiska funktionen av FAM83A vid livmoderhalscancer

Sårläknings- och membraninsatsanalyser utfördes för att undersöka effekterna av FAM83A-hämning på migration och invasion av livmoderhalscancerceller. Resultaten visade att livmoderhalscancerceller med hämmat FAM83A-uttryck migrerade (Figur 3A-D) och invaderade (Figur 3E-H) mindre effektivt än kontrollcellerna.

Effekter på mitokondriell funktion och PI3K/AKT-signalväg

Med tanke på PI3K/AKT:s roll i induktion av cellapoptos syftade vi till att avgöra om undertryckandet av FAM83A-uttryck skulle hämma den konstitutiva fosforyleringen av PI3K/Akt/mTOR-vägen i livmoderhalscancer. Undertryckande av FAM83A hämmade signifikant de viktigaste fosforylerade proteinnivåerna i PI3K/Akt/mTOR-vägen inklusive p-PI3K, p-Akt och p-mTOR i c333a- och HeLa-celler (Figur 4A-D). Mitokondrier är de organeller som ansvarar för cellulär metabolism och induktion av cellapoptos. Ackumulerande bevis tyder på att cancercellsapoptos involverar mitokondriell dysfunktion genom den inneboende mitokondriella vägen på grund av förbättrad mitokondriell permeabilitet och frisättning av proapoptotiska molekyler såsom Cytc i cytoplasman10. PI3K/AKT-vägen kan reglera translokationen av Bax in i mitokondrierna, vilket inducerar Cytc-frisättning som svar på apoptotiska stimuli. Därför är det tänkbart att de onkogena komponenterna i PI3K-AKT-signalvägen reglerar cellapoptos direkt genom att påverka mitokondriellt beteende. Således utfördes en mitokondriell permeabilitetsövergångsporanalys (mPTP) för levande celler för att bestämma mitokondriell status. mPTP-öppning är förknippad med apoptotisk och nekrotisk celldöd11. I denna analys behålls ett grönt fluorescerande färgämne (calcein AM) i cytoplasman och mitokondrierna när mPTP är stängt, medan färgämnet i cytoplasman släcks av CoCl2, vilket endast lämnar den intensiva fluorescensen i mitokondrierna. Resultaten visade att cellpopulationer med intensiv grön fluorescens i mitokondrierna minskade signifikant efter FAM83A-suppression, vilket indikerar en öppen mPTP (Figur 4E,F). Vidare undersökte vi förändringarna i mitokondriemembranpotentialen (ΔΨm) med hjälp av JC-1-färgning. JC-1 bildar aggregat (röd fluorescens) i levande celler som innehåller intakta mitokondrier med hög membranpotential och monomerer (grön fluorescens) under låg MMP i apoptotiska celler. FAM83A-undertryckning minskade gradvis MMP (figur 4G).

Känslighetsanalys av narkotika för spridning och invasion

Cisplatin (DDP)-baserad kemoterapi är en standardbehandlingsstrategi för livmoderhalscancer. Kemoresistens är dock fortfarande en utmaning. Vi undersökte FAM83A :s roll vid behandling av livmoderhalscancer med hjälp av cisplatin. Kontroll-, si-NC-behandlade och si-FAM83A-behandlade HeLa-celler behandlades med eller utan 5 μM cisplatin12. Vidare utvärderades effekterna av FAM83A-suppression på cellviabilitet. DDP inducerade en mer signifikant hämmande effekt på proliferationen av HeLa-celler efter FAM83A-suppression , jämfört med enbart DDP-behandling (Figur 5A och Figur 5C). Efter behandling av livmoderhalscancerceller med 5 μM cisplatin hämmade FAM83A-suppression även cellinvasion (Figur 5B och Figur 5D).

Läkemedelskänslighetsanalys för mitokondriell funktion

Genom att behandla Si-NC-behandlade och si-FAM83A-behandlade HeLa-celler med eller utan 5 μM cisplatin (DDP) utvärderade vi mitokondriemembranpotentialen (MMP) och bedömde mitokondriella skador orsakade av celldöd med JC-1-färgning. DDP inducerade mer mitokondriell skada, vilket avslöjades av en minskning av JC-1-monomerprocenten efter FAM83A-knockdown, jämfört med endast DDP-behandling (Figur 6A och Figur 6D). Efter behandling av livmoderhalscancerceller med 5 μM cisplatin hämmade FAM83A-knockdown också kolonibildning (Figur 6B och Figur 6E) och ökad cellapoptos (Figur 6C och Figur 6F). Dessutom ökade FAM83A-knockdown i närvaro av DDP markant uttrycket av proapoptotiska proteiner, Bax och klyvt kaspas3, främjade Cytc-frisättning och minskade Bcl-2-uttrycket (Figur 6G,H). Dessa resultat indikerade att FAM83A-knockdown sensibiliserade livmoderhalscancerceller för DDP via apoptosinduktion.

Figure 1
Figur 1: Överuttryck av FAM83A i livmoderhalscancerceller och korrelation med sämre prognos. (A) Boxplot-analys av mRNA-nivåerna av FAM83A i livmoderhalscancerprover. (B) Kaplan-Meier-analys av FAM83A-uttryck för bestämning av total överlevnad hos patienter med livmoderhalscancer. (C) Relativa mRNA-nivåer av FAM83A i livmoderhalscancercellinjerna HeLa och C33a och human immortaliserad cervikal cellinje End1/E6E7. Data presenteras som medelvärdet ± SD för tre oberoende experiment. *P < 0,05, jämfört med End1/E6E7-celler med envägs ANOVA. Förkortningar: CESE = Cervikal skivepitelcancer och endocervikalt adenokarcinom; HR = riskkvot. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Effekter av hämning av FAM83A på proliferation och apoptos av livmoderhalscancer. C33a- och HeLa-celler transfekterades med FAM83A-specifika siRNA. (A,B) mRNA-nivåer av FAM83A utvärderades i livmoderhalscancercellinjer med hjälp av qRT-PCR.Cellproliferation i (C) C33a- och (D) HeLa-celler bestämdes med hjälp av EdU-analysen. (E,F) EDU-fluorescensbilder av C33a- och Hela-celler. (G-J) Western blot-analys för att undersöka nivåerna av apoptosrelaterade proteiner, inklusive Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 och cleaved-caspase-3; GAPDH användes som lastningskontroll. Data presenteras som medelvärdet ± SD för tre oberoende experiment. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, jämfört med kontrollceller som använder envägs ANOVA. Förkortningar: NC = negativ kontroll; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin, CytC = cytokrom C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Effekt av FAM83A på migration och invasion av livmoderhalscancerceller in vitro. (A-D) Sårläkningsanalys utfördes för att bedöma cellmigration. Bilderna togs vid 0, 24 och 48 timmar. (E-H) Transwell-analyser utfördes för att undersöka cellinvasionen. Skalstaplar = 100 μm (E,F). Data presenteras som medelvärdet ± SD för tre oberoende experiment. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, jämfört med kontrollceller som använder envägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Effekt av FAM83A-suppression på PI3K/AKT/mTOR-vägen och mitokondriell funktion. (A-D) Western blot-analys för att bestämma nivåerna av proteiner från PI3K/AKT/mTOR-vägen i C33a- och HeLa-celler efter FAM83A-suppression. (E-H) Mitokondriell membranpotentialanalys med JC-1-färgning. JC-1-aggregat färgades i rött och JC-1-monomerer färgades i grönt, vilket indikerar en lägre MMP. (I,J) Mitokondriell permeabilitet bedömdes med hjälp av ett mPTP-kit och flödescytometri. Skalstaplar = 50 μm (E, F). Data presenteras som medelvärdet ± SD för tre oberoende experiment. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, jämfört med kontrollceller som använder envägs ANOVA. Förkortningar: MMP = mitokondriell membranpotential; mPTP = mitokondriell permeabilitetsövergångspor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Effekter av FAM83A-hämning på hämning av DDP på cellproliferation och invasion av livmoderhalscancerceller. HeLa-celler transfekterades med si-NC eller si-FAM83A och behandlades med eller utan 5 μM DDP. (A,C) Effekt av DDP på cellproliferation i kontroll, si-NC-behandlade och si-FAM83-behandlade HeLa-celler. (B,D) Effekt av DDP på cellinvasionen i kontroll, si-NC-behandlade och si-FAM83-behandlade HeLa-celler. Data presenteras som medelvärdet ± SD för tre oberoende experiment. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, jämfört med kontrollcellerna. &&P < 0,01; &&&P < 0,001, jämfört med DDP med envägs ANOVA. Förkortningar: DDP = diamindiklorplatina; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Effekter av FAM83A-suppression på effekterna av DDP på apoptos i livmoderhalscancerceller. HeLa-celler transfekterades med si-NC eller si-FAM83A och behandlades med eller utan 5 μM DDP. (A,D) MMP-analys med JC-1-färgning. (B,E) Resultat av plattkloning. (C,F) Flödescytometri som detekterar apoptosfrekvenser i olika behandlingsgrupper. (G,H) Western blot-analys av mitokondrierelaterade apoptotiska proteiner, inklusive Bcl-2, Bax, Cytc och nedströms klyvt kaspas-3. GAPDH användes som lastningskontroll. Data presenteras som medelvärdet ± SD för tre oberoende experiment. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, jämfört med kontrollcellerna. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001, jämfört med DDP med envägs ANOVA. Förkortningar: DDP = diamindiklorplatina; EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: siRNA, qRTPCR-primrar och qRT-PCR-reaktionsuppställningen som användes i denna studie. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att undersöka tumörens målgener är av yttersta vikt för både prevention och behandling av livmoderhalscancer. Att förstå de specifika gener som spelar en viktig roll i utvecklingen och progressionen av livmoderhalscancer ger värdefull insikt i de underliggande molekylära mekanismerna för sjukdomen. Dessutom kan identifieringen av dessa målgener leda till utveckling av nya terapeutiska strategier och riktade terapier. I denna studie beskriver vi användningen av TCGA-datasetanalys för att identifiera FAM83A som en målgen och undersöka dess mekanistiska roller i livmoderhalscancer. Vi observerar ett signifikant högt uttryck av FAM83A i livmoderhalscancerceller, vilket är associerat med dålig prognos för patienter med livmoderhalscancer. En serie cellbaserade experiment avslöjade högt FAM83A-uttryck i livmoderhalscancerceller, vilket spelar en avgörande roll för att reglera cellproliferation, migration och invasion. Undertryckande av FAM83A-uttryck hämmade proliferation och migration och främjade apoptos i livmoderhalscancerceller.

Att konstruera FAM83A-knockdown livmoderhalscancercellinjer är det mest kritiska steget i denna studie. siRNA designas och valideras enligt målgensekvenserna för att säkerställa deras effektivitet. Vidare transfekteras livmoderhalscancercellinjerna med hjälp av siRNA. Framgångsgraden för plasmidtransfektion är avgörande för efterföljande experiment, som kräver strikt kontroll av celltäthet och plasmiddensitet. Vidare observeras transfektionseffektiviteten under ett fluorescensmikroskop för att säkerställa att efterföljande experiment kan utföras. Western blotting och qRT-PCR-resultat bekräftar att hämningen av FAM83A undertryckte PI3K/AKT-vägen och inducerade mitokondriell dysfunktion. Vår hypotes är att mekanismen involverar hämning av translokationen av Bax från cytoplasman till mitokondrierna av PI3K/AKT, vilket främjar cellöverlevnad13.

Framsteg inom behandling av livmoderhalscancer har gjort det möjligt att utveckla nya målmolekyler. Identifieringen av en ny onkogen kan användas terapeutiskt för att förbättra den kliniska prognosen för cervikala maligniteter 14,15. I denna studie konstruerade vi framgångsrikt ett FAM83A-knockdown-system i HeLa- och C33a-celler och verifierade effekterna av FAM83A-knockdown på livmoderhalscancerceller på cellnivå. Vi föreslår att hämningen av FAM83A kan användas för att behandla livmoderhalscancer.

Denna studie har dock vissa begränsningar. För det första utför denna studie endast genscreening via databasen och saknar patologiska data från kliniska patienter. För det andra har denna studie endast validerat effekten in vitro, och ytterligare in vivo-studier behövdes för att verifiera resultaten. Icke desto mindre kan metoderna för identifiering av målgener, genknockout och cellulär validering för att identifiera riktade terapeutiska loci som utvecklats i denna studie ge forskningsidéer för upptäckt och validering av målgener för andra sjukdomar.

Sammanfattningsvis var FAM83A överuttryckt och korrelerat med en sämre prognos vid livmoderhalscancer. FAM83A reglerar proliferation, migration och invasion av livmoderhalscancerceller. Undertryckande av FAM83A-inducerad mitokondriell dysfunktion och apoptos, sensibiliserande livmoderhalscancerceller för cisplatin. Dessa resultat indikerade att FAM83A är ett lämpligt forskningsobjekt för behandling av livmoderhalscancer. Denna studie bidrog till framstegen inom adjuvant kemoterapi som syftar till att förbättra prognosen för patienter med livmoderhalscancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna redovisar inga intressekonflikter i detta arbete.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (nr 2020HC06).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and Medium Formulation
C33a American Type Culture Collection
Hela American Type Culture Collection
Modified medium 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT 4691, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Bcl2  26593-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:1,000
Caspase 3 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:2,000
cleaved-caspase3 abs132005; Absin Bioscience Inc. ‘1:1,000
Cytc 10993-1-AP; Proteintech Group ‘1:1,000
GAPDH  10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. ‘1:8,000
mTOR 2983, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
PI3K 4292, Cell Signaling Technology Inc ‘1:1,000
p-AKT  4060, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448) #5536, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit 17366, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Secondary antibodies GB23303, Servicebio ‘1:2,000
Materials
6-well plate Corning, NPY
Alexa Fluor 555 Beyotime
BCA Protein assay kit  Beyotime, China  P0011
ChemiDoc XRS Imager System  BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit  Servicebio, Inc.,China cat. no. G2014
Fluorescence microscope  Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix  11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope  Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts  Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit  Beyotime, China
PMSF  ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China #ST506
Real-time quantitative PCR instrument  Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer  Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent Invitrogen 15596026
TRIzol reagent  Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro  plus 6.0  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
  3. Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
  4. Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
  5. Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
  6. Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
  7. Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
  8. Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
  9. Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
  10. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
  11. Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
  12. Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
  13. Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
  14. Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
  15. Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 204 FAM83A livmoderhalscancer apoptos mitokondrier dysfunktion DDP
Knockdown av <em>FAM83A</em> för att verifiera dess roll i livmoderhalscancercelltillväxt och cisplatinkänslighet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang,… More

Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang, Y. Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity. J. Vis. Exp. (204), e65667, doi:10.3791/65667 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter