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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Knockdown di FAM83A per verificare il suo ruolo nella crescita delle cellule tumorali cervicali e nella sensibilità al cisplatino

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65667
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Qui, mostriamo le procedure per l'abbattimento di FAM83A ; i saggi per rilevare i suoi effetti sulla proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero; e la sensibilizzazione di queste cellule al cisplatino. Questo studio fornisce un promettente gene bersaglio per il cancro cervicale e un riferimento per ulteriori ricerche farmacologiche.

Abstract

L'esplorazione dei geni bersaglio del tumore è di fondamentale importanza per la prevenzione e il trattamento del cancro cervicale. In questo studio, delineiamo i passaggi coinvolti nell'identificazione di un gene bersaglio tumorale FAM83A nel cancro cervicale. In primo luogo, il set di dati Cancer Genome Atlas è stato utilizzato per convalidare l'espressione e il significato prognostico di FAM83A nelle donne. Un piccolo RNA interferente (siRNA) è stato utilizzato per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . Successivamente, è stata condotta la colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) per determinare gli effetti sulle capacità di proliferazione delle cellule tumorali. Sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e di inserimento di membrane porose per valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.

Il Western blotting è stato utilizzato per quantificare i livelli proteici correlati all'apoptosi. La colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Inoltre, l'intervento di cisplatino (diamminedicloroplatino, DDP) è stato utilizzato per valutare il potenziale terapeutico del gene bersaglio. Sono stati condotti saggi di citometria a flusso e di formazione di colonie per convalidare ulteriormente le caratteristiche antitumorali del gene. Di conseguenza, è stato dimostrato che il knockdown di FAM83A inibisce la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali e sensibilizza queste cellule al cisplatino. Queste metodologie complete convalidano collettivamente FAM83A come gene bersaglio associato al tumore, promettente come potenziale bersaglio terapeutico nella prevenzione e nel trattamento del cancro cervicale.

Introduction

Il cancro cervicale è una preoccupazione globale in quanto è uno dei principali tipi di neoplasie ginecologiche maligne in tutto il mondo ed è la principale causa di mortalità correlata al cancro nelle donne1. La chirurgia radicale e la chemioradioterapia sono associate ad alti tassi di guarigione nella fase primaria. Tuttavia, i risultati del trattamento per le pazienti in fase avanzata di carcinoma cervicale che sviluppano una malattia metastatica sono molto sfavorevoli2. Pertanto, è fondamentale comprendere ulteriormente i meccanismi biologici alla base della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero e identificare potenziali bersagli terapeutici per la prevenzione e il trattamento di questa malattia.

L'identificazione dei geni bersaglio coinvolti nella progressione del cancro e la ricerca di modi per inibirne l'espressione o l'azione presentano opzioni terapeutiche promettenti. In questo studio, abbiamo identificato FAM83 come gene cancerogeno e abbiamo ulteriormente studiato i suoi effetti inibitori sulle cellule C33a e HeLa. Gli oncogeni della famiglia FAM83 (FAM83A-H) sono ampiamente riportati nei tumori umani 3,4. Recentemente, FAM83A è stato segnalato per essere upregolato nei tumori del polmone5, della mammella6, dell'ovaio7 e del pancreas8, indicando che FAM83A svolge un ruolo importante nella progressione del cancro attraverso la promozione della proliferazione, dell'invasione, dei tratti simili alle cellule staminali e della resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali. È importante sottolineare che FAM83A è stato identificato come uno dei nuovi geni candidati associati alla progressione della lesione cervicale e alla carcinogenesi9. Nonostante la conferma di un'elevata espressione di FAM83A nelle cellule tumorali cervicali umane, l'impatto specifico e i meccanismi sottostanti di FAM83A nel cancro cervicale rimangono poco chiari.

In questo studio, delineiamo i protocolli coinvolti nell'identificazione di FAM83A come gene bersaglio del tumore nel cancro cervicale e utilizziamo un piccolo RNA interferente (siRNA) per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . La colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) è stata eseguita per determinare gli effetti sulla proliferazione delle cellule tumorali, mentre la guarigione delle ferite e i saggi di inserimento della membrana porosa hanno contribuito a valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.

Il Western blotting è stato eseguito per determinare i livelli di proteine correlate all'apoptosi e la colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Pertanto, abbiamo riferito che FAM83A svolge un ruolo critico nella proliferazione cellulare, nelle metastasi e nell'invasione nel cancro cervicale. Attraverso la disfunzione mitocondriale e l'apoptosi associate alla via PI3K/AKT, il knockdown di FAM83A ha sensibilizzato le cellule tumorali cervicali al cisplatino (diamminesdicloroplatino, DDP). Questo studio fornisce un nuovo bersaglio per il cancro cervicale e possibilmente altri tumori e un riferimento per lo sviluppo di strategie per superare la resistenza delle cellule tumorali a determinati farmaci chemioterapici.

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Protocol

Lo studio è stato completamente conforme alle linee guida di pubblicazione fornite dal TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Fonte dei dati e analisi bioinformatica

  1. Ottieni i dati di sequenziamento dell'RNA dal database Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) per l'analisi dei cluster. Utilizzare GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), uno strumento basato sul web per ricalcolare i dati grezzi RNA-Seq dei campioni provenienti dai progetti TCGA, per lo screening di bersagli di farmaci antitumorali candidati con una pipeline di elaborazione standard.
    NOTA: Il sito web GEPIA è disponibile gratuitamente per tutti gli utenti.
  2. Accedere alla home page del sito web GEPIA e fare clic su Analisi del tipo di cancro, selezionare l'opzione Analisi dei geni differenziali e impostare i seguenti parametri: Nome del cancro = CESE (definito come carcinoma a cellule squamose cervicale e adenocarcinoma endocervicale in questa pagina web), |Log2FC| Cutoff = 1, Cutoff del valore q = 0,01, Metodi differenziali = ANOVA e Distribuzione cromosomica = entrambi. Quindi, fare clic su Elenco per ottenere un elenco di geni che mostra l'espressione differenziale tra i gruppi tumorali e normali.
    NOTA: Richiede un'ampia revisione della letteratura per identificare i geni candidati differenzialmente espressi. In questo studio, considerando il background della letteratura disponibile, ci concentriamo sul gene tumorale di interesse, FAM83A.
  3. Quindi, esaminare l'espressione di FAM83A nel cancro cervicale e nei tessuti normali utilizzando GEPIA procedendo all'opzione Espressione fai-da-te sul sito Web e selezionare Boxplot come tipo di grafico. Inserire FAM83A nel campo dei parametri del gene e impostare i seguenti parametri: |Log2FC| Valore limite = 1; valore q Cutoff = 0,01. Selezionare CESE come nome del cancro e Corrispondenza dati TCGA normali per il campo dati Normale corrispondente , lasciando tutte le altre impostazioni predefinite. Clicca su Plot e consenti al sito web di generare un boxplot che rappresenti l'espressione differenziale del gene FAM83A ; Salvare il boxplot per riferimento e analisi futuri.
  4. Infine, analizzare la sopravvivenza globale di pazienti portatori di tumori con diversi livelli di espressione di FAM83A nel carcinoma cervicale. Passare all'opzione Grafici di sopravvivenza sul sito Web, impostare il gene su FAM83A e selezionare Sopravvivenza globale come tipo di analisi. Aggiungere il nome del tumore CESE, scegliere Mesi per le unità dell'asse e lasciare tutti gli altri parametri alle impostazioni predefinite. Fai clic su Traccia e lascia che il sito Web generi un grafico della curva di sopravvivenza; Salvare questo grafico per riferimento e analisi future.
  5. Prendere in considerazione sia l'espressione differenziale di FAM83A nei tumori che la sua correlazione con l'analisi della sopravvivenza dei pazienti per identificare FAM83A come potenziale gene bersaglio terapeutico nel cancro cervicale.

2. Esperimenti basati su cellule

  1. Colture cellulari
    1. Coltura di linee cellulari tumorali umane nel terreno modificato a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 .
      NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le informazioni sulla linea cellulare e i componenti del terreno di coltura.
  2. Trasfezione cellulare
    1. Usa il siRNA per abbattere l'espressione di FAM83A nelle cellule.
      NOTA: Vedere la Tabella 1 per la sequenza specifica di siRNA.
    2. Cellule seme in piastre a 6 pozzetti e incubare con la miscela di 50 nM si-FAM83A o siRNA-NC e 8 μL di agente di trasfezione o solo 8 μL di agente di trasfezione per 4-6 ore dopo aver raggiunto il 50%-70% di confluenza. Aggiungere solo DMEM senza siero al controllo negativo.
    3. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno contenente l'agente di trasfezione con DMEM + 10% di siero fetale di vitello. Inoltre, 48 ore dopo la trasfezione, trattare con 5 μM di cisplatino (DDP) per 24 ore come previsto e prelevare tutte le cellule per l'estrazione dell'RNA totale e l'analisi qRT-PCR.

3. Rilevamento di EdU per il saggio di proliferazione cellulare

NOTA: Utilizzare il kit di proliferazione cellulare EdU per valutare la proliferazione cellulare in vitro secondo le istruzioni del produttore.

  1. Seminare le cellule in piastre a 6 pozzetti e incubarle con una soluzione di EdU da 10 μM per 2 ore. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti a RT.
  2. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione e aggiungere 500 μL di soluzione di reazione 1x. Quindi, incubare per 30 minuti a RT al buio per la colorazione nucleare.
  3. Colorare le cellule con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e visualizzarle al microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 200x. Colorare i nuclei delle cellule proliferanti con EdU ed esaminarli per la fluorescenza rossa.
  4. Infine, utilizzare un software per quantificare i risultati contando almeno 10 campi casuali e calcolare i tassi di proliferazione utilizzando il rapporto tra le cellule fluorescenti-positive e le cellule totali.

4. Saggio di guarigione delle ferite

  1. Cellule seme in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2 × 105 cellule per pozzetto.
  2. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, utilizzare un puntale sterile per micropipette da 10 μL per creare delicatamente un graffio lineare nel monostrato cellulare. Sciacquare delicatamente i pozzetti con PBS sterile per rimuovere eventuali cellule staccate e detriti causati da graffi.
  3. Inoltre, incubare le cellule in un terreno contenente l'1% di FBS. Quindi, osserva e scatta immagini con il microscopio invertito per la guarigione della regione ferita a 12, 24 e 48 ore.

5. Saggio dell'inserto a membrana porosa

  1. Preparare una sospensione cellulare in terreno di coltura cellulare alla concentrazione cellulare desiderata (contenente 4 × 104 cellule), comprese le cellule C33a trasfettate o di controllo e l'HeLa. Aggiungere la sospensione cellulare nella camera superiore degli inserti a membrana, garantendo una distribuzione uniforme. Aggiungere il terreno completo nella camera inferiore.
  2. Dopo un'incubazione di 24 ore, utilizzare alcol metilico e violetto cristallino allo 0,1% per la fissazione e la colorazione delle cellule che migrano rispettivamente nelle camere inferiori.
  3. Usa un microscopio invertito per scattare immagini e quindi analizzare il numero di cellule che migrano contando almeno 10 campi casuali con ImageJ.
    1. Per l'analisi dei numeri con ImageJ, aprire l'immagine nel software ImageJ, andare alla scheda Immagine nel menu degli strumenti, selezionare Regola, quindi fare clic su Soglia. Regolare le impostazioni di soglia, se necessario, fino a quando solo le celle sono visibili su uno sfondo bianco.
    2. Fare clic su Applica nella finestra Soglia per applicare queste impostazioni all'immagine. Ora, seleziona lo strumento Bacchetta (tracciamento) dalla barra degli strumenti (situata nella parte superiore della finestra).
    3. Fare clic sull'area dell'immagine in cui si trovano le celle per selezionare tutte le celle dell'immagine con soglia. Dopo aver evidenziato le celle, vai su Analizza nel menu Strumenti, quindi fai clic su Analizza particelle. Nella finestra Analizza particelle, immettere la dimensione desiderata (ad esempio, 0 - infinito) e i valori di circolarità (ad esempio, 0,00 - 1,00) in base ai requisiti sperimentali per includere tutte le celle nel conteggio.
    4. Fare clic su OK e attendere che il software conti le celle e che venga visualizzata una nuova finestra con i risultati dell'analisi.

6. Saggio di formazione delle colonie

  1. Seme 2 × 105 cellule per pozzetto di gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a 6 pozzetti con o senza trattamento con cisplatino (DDP) 5 μM per 24 ore.
  2. Dopo un periodo di 24 ore di trattamento farmacologico, staccare le cellule utilizzando tripsina allo 0,25% e risospenderle nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di FBS. Seminare le cellule risospese in una piastra a 6 pozzetti con una densità di 1 × 103 cellule per pozzetto, quindi incubare in un incubatore al 5% di CO2 a una temperatura di 37 °C.
  3. Dopo l'incubazione per ~7-10 giorni quando le colonie sono visibili, fissare le cellule con poliossimetilene al 4% e colorarle con la soluzione colorante Giemsa per 20 minuti.
  4. Lavare leggermente le celle e lasciare asciugare le piastre all'aria. Scatta immagini degli ammassi di colonie al microscopio e conta il numero di colonie che contengono più di 50 cellule.

7. Analisi della depolarizzazione della membrana mitocondriale (MMP) utilizzando il colorante JC-1

  1. Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
  2. Incubare con 1x soluzione colorante JC-1 per 15-20 minuti al 5% di CO2 a 37 °C utilizzando un kit per il saggio del potenziale di membrana mitocondriale secondo le istruzioni del produttore.
  3. Lavare le cellule ed esaminarle al microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 200x utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per JC-1 rispettivamente a ~490 nm e 590 nm. Per visualizzare la fluorescenza JC-1, utilizzare filtri appropriati, come un filtro di eccitazione blu (450-490 nm) e un filtro di emissione rosso (> passa-lungo 590 nm) per catturare selettivamente il segnale di fluorescenza emesso.

8. Analisi citofluorimetrica di mPTP

  1. Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
  2. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, risospendere le cellule in PBS e aggiungere 300 μL ciascuna (1x volume) di soluzione di colorazione Calcein AM e soluzione di lavoro di quenching fluorescente per coprire uniformemente le cellule. Incubare le cellule a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce per 30-45 minuti e sostituire il terreno con terreno di coltura fresco preriscaldato a 37 °C. Incubare le cellule a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce per altri 30 minuti per garantire la completa idrolisi della Calceina AM da parte delle esterasi intracellulari, con conseguente generazione di Calceina intracellulare verde-fluorescente.
  3. Rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule 2-3 volte con PBS e aggiungere il tampone di rilevamento. Rileva l'mPTP cellulare utilizzando la citometria a flusso e una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm.

9. Citometria a flusso

  1. Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
  2. Dopo 24 ore di trattamento farmacologico, sospendere nuovamente le cellule in 200 μL di soluzione tampone legante e mescolare delicatamente 10 μL di annessina V-FITC e 5 μL di ioduro di propidio (PI) nella sospensione cellulare. Incubare la miscela per 15 minuti evitando la luce e aggiungere 300 μL di soluzione tampone legante alle cellule. Rilevare l'apoptosi cellulare utilizzando la citometria a flusso a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm.

10. Analisi RT-PCR

  1. Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
  2. Estrarre l'RNA totale dalle cellule tumorali utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA e convertire l'RNA estratto in DNA complementare (cDNA) con la miscela di sintesi del cDNA incubando a 42 °C per 45 minuti e poi a 95 °C per 5 minuti.
  3. Preparare la miscela di reazione PCR contenente DNA polimerasi, nucleotidi, tampone e primer gene-specifici progettati. Aggiungere il modello di cDNA alla miscela di reazione per la reazione di PCR in tempo reale ed eseguire la PCR sullo strumento di PCR quantitativa in tempo reale con le seguenti condizioni di ciclo termico: denaturazione a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di 95 °C per 5 s e 60 °C per 30 s, e la fase della curva di fusione a 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min e 95 °C per 15 s. Quantificare i livelli di mRNA utilizzando il metodo 2−ΔΔCq utilizzando GAPDH come controllo interno.
    NOTA: Il sistema di reazione RT-PCR è mostrato nella Tabella 1 e le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1.
    1. Per calcolare il valore 2−ΔΔCq , misurare i valori di Cq per il gene bersaglio e il gene di riferimento (GAPDH) nei campioni. Calcolare il ΔCq sottraendo il valore Cq del gene di riferimento dal valore Cq del gene bersaglio per ciascun campione. Calcolare il ΔΔCq sottraendo il ΔCq di un campione di controllo dal ΔCq di ciascun campione sperimentale. Infine, calcolare il valore 2−ΔΔCq elevando 2 alla potenza del valore ΔΔCq.
      NOTA: Il valore Cq rappresenta il numero di ciclo in corrispondenza del quale il segnale di fluorescenza raggiunge la soglia impostata.

11. Analisi Western blot

  1. Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
  2. Raccogliere le cellule in coltura e lavarle con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per rimuovere eventuali residui di terreno di crescita o siero. Lisare le cellule utilizzando il tampone di lisi RIPA contenente fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) per rilasciare le proteine cellulari. Incubare le cellule su ghiaccio per alcuni minuti per garantire una lisi completa e centrifugare a 4 °C, 12.000 × g per 15 min. Raccogliere il surnatante per determinarne la concentrazione proteica.
  3. Determinare la concentrazione proteica nel lisato cellulare utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore. Miscelare il lisato cellulare con un tampone di carico e riscaldare la miscela a 95-100 °C per 5-10 minuti per denaturare le proteine e garantire una separazione uniforme sul gel.
  4. Da ciascun campione, caricare 30 μg di proteina totale su un gel SDS-PAGE e far funzionare l'SDS-PAGE a una tensione costante di 80 V. Interrompere l'elettroforesi quando il blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel di separazione.
  5. Trasferire le proteine separate dal gel su una membrana di polivinildifluoruro utilizzando un sistema di trasferimento a umido su un bagno di ghiaccio con una corrente di 200 mA per 1,5 h.
  6. Bloccare la membrana con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata Tris con tampone Tween-20 allo 0,05% (TBST) per 1 ora a RT e incubare per una notte a 4 °C con i rispettivi anticorpi indicati nella tabella dei materiali.
  7. Lavare la membrana più volte con TBST e incubare con gli anticorpi secondari (Tabella dei materiali) per 1 ora a RT, seguita dal lavaggio con TBST. Visualizza le bande proteiche utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza avanzato e un sistema imager.

12. Analisi statistica

  1. Poiché tutti i dati sperimentali saranno indipendenti, presentare i dati come media ± DS. Eseguire un'analisi statistica.
  2. Utilizzare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per confronti multipli e il test di Dunnett per confrontare ciascun gruppo con il gruppo di controllo. Utilizzare il test t di Student (a due code non accoppiato) per confrontare due gruppi; considerare significativo P < 0,05.

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Representative Results

Analisi del database TCGA e validazione PCR

Dall'analisi del database TCGA, abbiamo condotto un'analisi comparativa dei livelli di espressione dell'mRNA in 306 campioni di cellule di cancro cervicale e 13 campioni di cellule normali per studiare l'espressione differenziale di FAM83A. FAM83A è stato sovraregolato nel cancro cervicale, mentre la sua espressione nel tessuto cervicale normale era trascurabile (Figura 1A). Per ottenere ulteriori informazioni sulle implicazioni prognostiche dell'espressione di FAM83A , abbiamo eseguito un'analisi della curva di Kaplan-Meier. Sorprendentemente, i pazienti con una maggiore espressione di FAM83A hanno mostrato una sopravvivenza globale marcatamente peggiore (Figura 1B). Per determinare il ruolo di FAM83A nel cancro cervicale, abbiamo esaminato i livelli di espressione di FAM83A in due linee cellulari di cancro cervicale, HeLa e C33a, nonché in una linea cellulare cervicale immortalizzata, End1/E6E7. Utilizzando la qRT-PCR, abbiamo osservato una significativa sovraespressione di FAM83A nelle linee cellulari HeLa e C33a rispetto alla linea cellulare End1/E6E7 (Figura 1C). Questi risultati sottolineano l'importanza di FAM83A nel contesto del cancro cervicale.

Esperimenti di proliferazione e apoptosi per verificare la funzione biologica di FAM83A nel carcinoma cervicale

Per studiare il ruolo funzionale di FAM83A nel carcinoma cervicale, abbiamo utilizzato il knockdown mediato da siRNA di FAM83A nelle cellule C33a e HeLa (Figura 2A,B). Abbiamo quindi valutato l'impatto della soppressione di FAM83A sulla proliferazione cellulare. La colorazione EdU ha rivelato che la diminuzione dell'espressione di FAM83A ha inibito significativamente la proliferazione cellulare sia nelle cellule C33a che in quelle HeLa (Figura 2C-F). Le cellule maligne immortali sono associate a tassi di apoptosi estremamente bassi10. Pertanto, i livelli di proteine anti- e proapoptotiche sono stati valutati nelle cellule di controllo e di cancro cervicale trattate con si-FAM83A. Le analisi Western blot hanno rivelato che l'espressione soppressa di FAM83A ha aumentato l'espressione delle proteine Bax e della caspasi scissa 3 (proteine proapoptotiche), ha diminuito l'espressione di Bcl-2 (proteina antiapoptotica) e ha aumentato il rilascio di Cytc (Figura 2C-E), il che è coerente con l'osservazione che le proteine antiapoptotiche regolano l'apoptosi bloccando il rilascio mitocondriale di Cytc (Figura 2G-J)10. Collettivamente, questi dati hanno suggerito che FAM83A svolge un ruolo importante nella regolazione della proliferazione e dell'apoptosi delle cellule tumorali cervicali.

Saggi di guarigione delle ferite e di inserti di membrana porosa per verificare la funzione biologica di FAM83A nel carcinoma cervicale

Sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e di inserimento della membrana per esplorare gli effetti della soppressione di FAM83A sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali. I risultati hanno rivelato che le cellule tumorali cervicali con espressione di FAM83A soppressa migravano (Figura 3A-D) e invadevano (Figura 3E-H) in modo meno efficiente rispetto alle cellule di controllo.

Effetti sulla funzione mitocondriale e sulla via di segnalazione PI3K/AKT

Dato il ruolo di PI3K/AKT nell'induzione dell'apoptosi cellulare, abbiamo cercato di determinare se la soppressione dell'espressione di FAM83A inibisse la fosforilazione costitutiva della via PI3K/Akt/mTOR nel carcinoma cervicale. La soppressione di FAM83A ha inibito significativamente i livelli chiave di proteina fosforilata nella via PI3K/Akt/mTOR, tra cui p-PI3K, p-Akt e p-mTOR nelle cellule c333a e HeLa (Figura 4A-D). I mitocondri sono gli organelli responsabili del metabolismo cellulare e dell'induzione dell'apoptosi cellulare. Sempre più prove indicano che l'apoptosi delle cellule tumorali comporta una disfunzione mitocondriale attraverso la via mitocondriale intrinseca a causa dell'aumento della permeabilità mitocondriale e del rilascio di molecole proapoptotiche come Cytc nel citoplasma10. La via PI3K/AKT potrebbe regolare la traslocazione di Bax nei mitocondri, inducendo il rilascio di Cytc in risposta a stimoli apoptotici. Pertanto, è ipotizzabile che le componenti oncogeniche della via di segnalazione PI3K-AKT regolino direttamente l'apoptosi cellulare influenzando il comportamento mitocondriale. Pertanto, è stato eseguito un test dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP) delle cellule vive per determinare lo stato mitocondriale. L'apertura di mPTP è associata alla morte cellulare apoptotica e necrotica11. In questo saggio, un colorante fluorescente verde (calceina AM) viene trattenuto nel citoplasma e nei mitocondri quando l'mPTP è chiuso, mentre il colorante nel citoplasma viene spento da CoCl2, lasciando solo la fluorescenza intensiva nei mitocondri. I risultati hanno rivelato che le popolazioni cellulari con intensa fluorescenza verde nei mitocondri sono diminuite significativamente dopo la soppressione di FAM83A, indicando un mPTP aperto (Figura 4E,F). Inoltre, abbiamo esaminato i cambiamenti nel potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) utilizzando la colorazione JC-1. JC-1 forma aggregati (fluorescenza rossa) in cellule vive contenenti mitocondri intatti con alto potenziale di membrana e monomeri (fluorescenza verde) con bassa MMP nelle cellule apoptotiche. La soppressione di FAM83A ha gradualmente diminuito la MMP (Figura 4G).

Analisi di suscettibilità ai farmaci per la proliferazione e l'invasione

La chemioterapia a base di cisplatino (DDP) è una strategia di trattamento standard per il cancro cervicale. Tuttavia, la chemioresistenza rimane una sfida. Abbiamo studiato il ruolo di FAM83A nel trattamento del cancro cervicale utilizzando cisplatino. Le cellule HeLa di controllo, trattate con si-NC e si-FAM83A sono state trattate con o senza 5 μM di cisplatino12. Inoltre, sono stati valutati gli effetti della soppressione di FAM83A sulla vitalità cellulare. Il DDP ha indotto un effetto inibitorio più significativo sulla proliferazione delle cellule HeLa dopo la soppressione di FAM83A , rispetto al solo trattamento con DDP (Figura 5A e Figura 5C). Dopo aver trattato le cellule tumorali cervicali con 5 μM di cisplatino, la soppressione di FAM83A ha anche inibito l'invasione cellulare (Figura 5B e Figura 5D).

Analisi di suscettibilità ai farmaci per la funzione mitocondriale

Trattando cellule HeLa trattate con Si-NC e si-FAM83A con o senza 5 μM di cisplatino (DDP), abbiamo valutato il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e valutato il danno mitocondriale causato dalla morte cellulare utilizzando la colorazione JC-1. La DDP ha indotto un maggiore danno mitocondriale, come rivelato da una diminuzione della percentuale di monomero JC-1 dopo il knockdown di FAM83A, rispetto al solo trattamento con DDP (Figura 6A e Figura 6D). Dopo aver trattato le cellule tumorali cervicali con 5 μM di cisplatino, il knockdown di FAM83A ha anche inibito la formazione di colonie (Figura 6B e Figura 6E) e ha aumentato l'apoptosi cellulare (Figura 6C e Figura 6F). Inoltre, il knockdown di FAM83A in presenza di DDP ha aumentato notevolmente l'espressione delle proteine proapoptotiche, Bax e caspasi scisse3, ha promosso il rilascio di Cytc e ha diminuito l'espressione di Bcl-2 (Figura 6G,H). Questi risultati hanno indicato che il knockdown di FAM83A ha sensibilizzato le cellule tumorali cervicali al DDP attraverso l'induzione dell'apoptosi.

Figure 1
Figura 1: Sovraespressione di FAM83A nelle cellule tumorali cervicali e correlazione con prognosi peggiore. (A) Analisi boxplot dei livelli di mRNA di FAM83A in campioni di cancro cervicale. (B) Analisi di Kaplan-Meier dell'espressione di FAM83A per la determinazione della sopravvivenza globale in pazienti con carcinoma cervicale. (C) Livelli relativi di mRNA di FAM83A nelle linee cellulari di cancro cervicale HeLa e C33a e nella linea cellulare cervicale immortalizzata umana End1/E6E7. I dati sono presentati come media ± DS per tre esperimenti indipendenti. *P < 0,05, rispetto alle celle End1/E6E7 che utilizzano ANOVA unidirezionale. Abbreviazioni: CESE = Carcinoma cervicale a cellule squamose e adenocarcinoma endocervicale; HR = hazard ratio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Effetti della soppressione di FAM83A sulla proliferazione e l'apoptosi del cancro cervicale. Le cellule C33a e HeLa sono state trasfettate con siRNA specifici per FAM83A. (A,B) i livelli di mRNA di FAM83A sono stati valutati nelle linee cellulari del cancro cervicale facendo uso della qRT-PCR.La proliferazione cellulare nelle cellule (C) C33a e (D) HeLa è stata determinata usando il test EdU. (E,F) Le immagini di fluorescenza EDU delle cellule C33a e Hela. (G-J) Analisi Western blot per l'esame dei livelli di proteine correlate all'apoptosi, tra cui Cytc, Bcl-2, Bax, caspasi3 e caspasi-3 scissa; GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico. I dati sono presentati come media ± DS per tre esperimenti indipendenti. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, rispetto alle celle di controllo che utilizzano ANOVA unidirezionale. Abbreviazioni: NC = controllo negativo; EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; CytC = citocromo C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Effetto di FAM83A sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali in vitro. (A-D) È stato eseguito un test di guarigione delle ferite per valutare la migrazione cellulare. Le immagini sono state scattate a 0, 24 e 48 h. (E-H) Sono stati eseguiti saggi Transwell per esaminare l'invasione cellulare. Barre di scala = 100 μm (E,F). I dati sono presentati come media ± DS per tre esperimenti indipendenti. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, rispetto alle cellule di controllo che utilizzano ANOVA unidirezionale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Effetto della soppressione di FAM83A sulla via PI3K/AKT/mTOR e sulla funzione mitocondriale. (A-D) Analisi Western blot per determinare i livelli di proteine dalla via PI3K/AKT/mTOR nelle cellule C33a e HeLa dopo soppressione di FAM83A. (E-H) Analisi del potenziale di membrana mitocondriale mediante colorazione JC-1. Gli aggregati JC-1 sono stati colorati in rosso e i monomeri JC-1 sono stati colorati in verde, indicando una MMP inferiore. (I,J) La permeabilità mitocondriale è stata valutata utilizzando un kit mPTP e la citometria a flusso. Barre di scala = 50 μm (E, F). I dati sono presentati come media ± DS per tre esperimenti indipendenti. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, rispetto alle celle di controllo che utilizzano ANOVA unidirezionale. Abbreviazioni: MMP = potenziale di membrana mitocondriale; mPTP = poro di transizione della permeabilità mitocondriale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Effetti della soppressione di FAM83A sull'inibizione da parte del DDP sulla proliferazione cellulare e sull'invasione delle cellule tumorali cervicali. Le cellule HeLa sono state trasfettate con si-NC o si-FAM83A e trattate con o senza 5 μM di DDP. (A,C) Effetto del DDP sulla proliferazione cellulare nelle cellule HeLa di controllo, trattate con si-NC e trattate con si-FAM83. (B,D) Effetto del DDP sull'invasione cellulare nelle cellule HeLa di controllo, trattate con si-NC e trattate con si-FAM83. I dati sono presentati come media ± DS per tre esperimenti indipendenti. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, rispetto alle celle di controllo. &&P < 0,01; &&&P < 0,001, rispetto al DDP utilizzando l'ANOVA unidirezionale. Abbreviazioni: DDP = diaminedicloroplatino; EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Effetti della soppressione di FAM83A sugli effetti del DDP sull'apoptosi nelle cellule tumorali cervicali. Le cellule HeLa sono state trasfettate con si-NC o si-FAM83A e trattate con o senza 5 μM di DDP. (A,D) Analisi MMP mediante colorazione JC-1. (B,E) Risultati della clonazione su piastra. (C,F) Citometria a flusso che rileva i tassi di apoptosi in diversi gruppi di trattamento. (G,H) Analisi Western blot di proteine apoptotiche correlate ai mitocondri, tra cui Bcl-2, Bax, Cytc e la caspasi-3 scissa a valle. GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico. I dati sono presentati come media ± DS per tre esperimenti indipendenti. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, rispetto alle celle di controllo. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001, rispetto al DDP che utilizza l'ANOVA unidirezionale. Abbreviazioni: DDP = diaminedicloroplatino; EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: siRNA, primer qRTPCR e configurazione della reazione qRT-PCR utilizzata in questo studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Lo studio dei geni bersaglio del tumore è della massima importanza sia per la prevenzione che per il trattamento del cancro cervicale. La comprensione dei geni specifici che svolgono un ruolo significativo nello sviluppo e nella progressione del cancro cervicale fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della malattia. Inoltre, l'identificazione di questi geni bersaglio può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e terapie mirate. In questo studio, descriviamo l'uso dell'analisi del set di dati TCGA per identificare FAM83A come gene bersaglio e studiare i suoi ruoli meccanicistici nel cancro cervicale. Osserviamo un'espressione significativamente elevata di FAM83A nelle cellule tumorali cervicali, che è associata a una prognosi infausta dei pazienti con cancro cervicale. Una serie di esperimenti basati su cellule ha rivelato un'elevata espressione di FAM83A nelle cellule tumorali cervicali, che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della proliferazione, della migrazione e dell'invasione cellulare. La soppressione dell'espressione di FAM83A ha inibito la proliferazione e la migrazione e ha promosso l'apoptosi nelle cellule tumorali cervicali.

La costruzione di linee cellulari di carcinoma cervicale FAM83A-knockdown è la fase più critica di questo studio. I siRNA sono progettati e validati in base alle sequenze geniche bersaglio per garantirne l'efficacia. Inoltre, le linee cellulari di cancro cervicale vengono trasfettate utilizzando siRNA. Il tasso di successo della trasfezione plasmidica è cruciale per gli esperimenti successivi, che richiedono un rigoroso controllo della densità cellulare e della densità plasmidica. Inoltre, l'efficienza di trasfezione viene osservata al microscopio a fluorescenza per garantire che possano essere condotti esperimenti successivi. I risultati del Western blotting e della qRT-PCR confermano che l'inibizione di FAM83A ha soppresso la via PI3K/AKT e ha indotto la disfunzione mitocondriale. Ipotizziamo che il meccanismo coinvolga l'inibizione della traslocazione di Bax dal citoplasma ai mitocondri da parte di PI3K/AKT, che promuove la sopravvivenza cellulare13.

I progressi nel trattamento del cancro cervicale hanno reso possibile lo sviluppo di nuove molecole bersaglio. L'identificazione di un nuovo oncogene può essere applicata terapeuticamente per migliorare la prognosi clinica delle neoplasie cervicali14,15. In questo studio, abbiamo costruito con successo un sistema di knockdown di FAM83A in cellule HeLa e C33a e abbiamo verificato gli effetti di FAM83A knockdown sulle cellule di cancro cervicale a livello cellulare. Proponiamo che l'inibizione di FAM83A possa essere usata per trattare il cancro cervicale.

Tuttavia, questo studio presenta alcune limitazioni. In primo luogo, questo studio esegue solo lo screening genico attraverso il database e manca di dati patologici dei pazienti clinici. In secondo luogo, questo studio ha convalidato l'effetto solo in vitro e sono stati necessari ulteriori studi in vivo per verificare i risultati. Tuttavia, i metodi di identificazione del gene bersaglio, knockout genico e convalida cellulare per identificare loci terapeutici mirati elaborati in questo studio possono fornire idee di ricerca per la scoperta e la convalida di geni bersaglio per altre malattie.

In sintesi, FAM83A è stato sovraespresso e correlato con una prognosi peggiore nel cancro cervicale. FAM83A regola la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali. Soppressione della disfunzione mitocondriale indotta da FAM83A e dell'apoptosi, sensibilizzando le cellule tumorali cervicali al cisplatino. Questi risultati hanno indicato che FAM83A è un obiettivo di ricerca adatto per il trattamento del cancro cervicale. Questo studio ha contribuito ai progressi nella chemioterapia adiuvante volta a migliorare la prognosi delle pazienti con carcinoma cervicale.

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Disclosures

Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (n. 2020HC06).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and Medium Formulation
C33a American Type Culture Collection
Hela American Type Culture Collection
Modified medium 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT 4691, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Bcl2  26593-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:1,000
Caspase 3 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:2,000
cleaved-caspase3 abs132005; Absin Bioscience Inc. ‘1:1,000
Cytc 10993-1-AP; Proteintech Group ‘1:1,000
GAPDH  10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. ‘1:8,000
mTOR 2983, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
PI3K 4292, Cell Signaling Technology Inc ‘1:1,000
p-AKT  4060, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448) #5536, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit 17366, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Secondary antibodies GB23303, Servicebio ‘1:2,000
Materials
6-well plate Corning, NPY
Alexa Fluor 555 Beyotime
BCA Protein assay kit  Beyotime, China  P0011
ChemiDoc XRS Imager System  BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit  Servicebio, Inc.,China cat. no. G2014
Fluorescence microscope  Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix  11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope  Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts  Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit  Beyotime, China
PMSF  ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China #ST506
Real-time quantitative PCR instrument  Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer  Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent Invitrogen 15596026
TRIzol reagent  Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro  plus 6.0  

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References

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Questo mese in JoVE Numero 204 FAM83A cancro cervicale apoptosi disfunzione mitocondriale DDP
Knockdown di <em>FAM83A</em> per verificare il suo ruolo nella crescita delle cellule tumorali cervicali e nella sensibilità al cisplatino
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Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang,… More

Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang, Y. Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity. J. Vis. Exp. (204), e65667, doi:10.3791/65667 (2024).

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