Summary
Her viser vi procedurerne for FAM83A knockdown; analyserne til påvisning af dets virkninger på spredning, migration og invasion af livmoderhalskræftceller; og sensibiliseringen af disse celler til cisplatin. Denne undersøgelse giver et lovende målgen for livmoderhalskræft og en reference for yderligere lægemiddelforskning.
Abstract
Udforskningen af tumormålgener har afgørende betydning for forebyggelse og behandling af livmoderhalskræft. I denne undersøgelse skitserer vi de trin, der er involveret i identifikationen af et tumormålgen FAM83A i livmoderhalskræft. For det første blev Cancer Genome Atlas datasæt anvendt til at validere ekspressionen og den prognostiske betydning af FAM83A hos kvinder. Et lille interfererende RNA (siRNA) blev brugt til knockdown af FAM83A-genet i HeLa- og C33a-celler . Dernæst blev 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) farvning udført for at bestemme virkningerne på tumorcellernes proliferationsevne. Sårheling og porøse membranindsatsassays blev udført for at evaluere tumorcellemigration og invasionsevner.
Western blotting blev brugt til at kvantificere apoptoserelaterede proteinniveauer. JC-1-farvning blev anvendt til at evaluere mitokondriefunktionsændringer. Desuden blev cisplatin (diamindichlorplatin, DDP) intervention anvendt til at vurdere målgenets terapeutiske potentiale. Flowcytometri og kolonidannelsesassays blev udført for yderligere at validere genets anticanceregenskaber. Som et resultat viste FAM83A knockdown sig at hæmme spredning, migration og invasion af livmoderhalskræftceller og sensibilisere disse celler til cisplatin. Disse omfattende metoder validerer kollektivt FAM83A som et tumorassocieret målgen og holder løfte som et potentielt terapeutisk mål i forebyggelse og behandling af livmoderhalskræft.
Introduction
Livmoderhalskræft er et globalt problem, da det er en af de førende typer gynækologisk malignitet på verdensplan og er den største årsag til kræftrelateret dødelighed hos kvinder1. Radikal kirurgi og kemostrålebehandling er forbundet med høje hærdningshastigheder i primærfasen. Imidlertid er behandlingsresultater for patienter i det avancerede stadium af livmoderhalskræft, der udvikler metastatisk sygdom, meget ugunstige2. Derfor er det afgørende yderligere at forstå de biologiske mekanismer, der ligger til grund for migration og invasion af livmoderhalskræftceller og identificere potentielle terapeutiske mål for forebyggelse og behandling af denne sygdom.
Identifikation af målgener, der er involveret i kræftprogression og finde måder at hæmme deres udtryk eller handling på, præsenterer lovende behandlingsmuligheder. I denne undersøgelse identificerede vi FAM83 som et kræftfremkaldende gen og undersøgte yderligere dets hæmmende virkninger på C33a- og HeLa-celler. FAM83-familiens onkogener (FAM83A-H) rapporteres bredt i humane kræftformer 3,4. For nylig blev FAM83A rapporteret at være opreguleret i lungekræft5, bryst6, kræft i æggestokkene7 og bugspytkirtlen8, hvilket indikerer, at FAM83A spiller en vigtig rolle i kræftprogression via fremme af spredning, invasion, stamcellelignende træk og lægemiddelresistens i tumorcellerne. Det er vigtigt, at FAM83A blev identificeret som et af de nye kandidatgener forbundet med cervikal læsionsprogression og carcinogenese9. På trods af bekræftelsen af forhøjet FAM83A-ekspression i humane livmoderhalskræftceller forbliver den specifikke virkning og underliggende mekanismer af FAM83A i livmoderhalskræft uklar.
I denne undersøgelse skitserer vi de protokoller, der er involveret i identifikationen af FAM83A som et tumormålgen i livmoderhalskræft og bruger et lille interfererende RNA (siRNA) til knockdown af FAM83A-genet i HeLa - og C33a-celler . 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) farvning blev udført for at bestemme virkningerne på tumorcelleproliferation, mens sårheling og porøse membranindsatsassays hjalp med at evaluere tumorcellemigration og invasionsevner.
Western blotting blev udført for at bestemme niveauerne af apoptoserelaterede proteiner, og JC-1-farvning blev anvendt til at evaluere mitokondriefunktionsændringer. Således rapporterede vi, at FAM83A spiller en kritisk rolle i celleproliferation, metastase og invasion i livmoderhalskræft. Gennem PI3K / AKT-pathway-associeret mitokondriel dysfunktion og apoptose sensibiliserede FAM83A knockdown livmoderhalskræftceller til cisplatin (diamindichlorplatin, DDP). Denne undersøgelse giver et nyt mål for livmoderhalskræft og muligvis andre kræftformer og en reference for udviklingen af strategier til at overvinde kræftcellernes resistens over for visse kemoterapeutiske lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen var helt i overensstemmelse med retningslinjerne for offentliggørelse fra TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol.
1. Datakilde og bioinformatikanalyse
- Hent RNA-sekventeringsdata fra Cancer Genome Atlas (TCGA) database (https://cancergenome.nih.gov) til klyngeanalyse. Brug GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), et webbaseret værktøj til at genberegne rå RNA-Seq-data fra prøver fra TCGA-projekter, til at screene for potentielle kræftlægemiddelmål med en standardbehandlingspipeline.
BEMÆRK: GAPIA-webstedet er frit tilgængeligt for alle brugere. - Gå ind på GEPIAs hjemmeside, og klik på Kræfttypeanalyse, vælg indstillingen Differentialgenanalyse , og indstil følgende parametre: Kræftnavn = CESE (defineret som Cervikal pladecellekarcinom og endocervikalt adenokarcinom på denne webside), |Log2FC| Afskæring = 1, q-værdi Afskæring = 0,01, Differentialmetoder = ANOVA og Kromosomfordeling = begge. Klik derefter på Liste for at få en genliste, der viser differentiel ekspression mellem tumor og normale grupper.
BEMÆRK: Det kræver en omfattende litteraturgennemgang at identificere differentielt udtrykte kandidatgener. I denne undersøgelse, i betragtning af baggrunden fra den tilgængelige litteratur, fokuserer vi på tumorgenet af interesse, FAM83A. - Undersøg derefter ekspressionen af FAM83A i livmoderhalskræft og normalt væv ved hjælp af GEPIA ved at fortsætte til indstillingen Expression DIY på webstedet og vælge Boxplot som diagramtype. FAM83A indtastes i genparameterfeltet, og følgende parametre indstilles: |Log2FC| Afskæringsværdi = 1; q-værdi Afskæring = 0,01. Vælg CESE som kræftnavn og Match TCGA-normaldata for datafeltet Matchet normal , og lad alle andre indstillinger være standardindstillinger. Klik på Plot og lad hjemmesiden generere et boxplot, der repræsenterer differentialekspressionen af FAM83A-genet ; Gem boksplottet til fremtidig reference og analyse.
- Endelig analysere den samlede overlevelse af patienter, der bærer tumorer med forskellige niveauer af FAM83A ekspression i livmoderhalskræft. Naviger til indstillingen Survival Plots på hjemmesiden, indstil genet til FAM83A, og vælg Samlet overlevelse som analysetype . Tilføj tumornavnet CESE, vælg Måneder for akseenhederne, og lad alle andre parametre være ved deres standardindstillinger. Klik på Plot og lad hjemmesiden generere et overlevelseskurvediagram; Gem dette diagram til fremtidig reference og analyse.
- Tag højde for både differentialekspressionen af FAM83A i tumorer og dens sammenhæng med patientens overlevelsesanalyse for at identificere FAM83A som et potentielt terapeutisk målgen i livmoderhalskræft.
2. Cellebaserede eksperimenter
- Cellekultur
- Kultur humane tumorcellelinjer i det modificerede medium ved 37 °C i en befugtet 5% CO2 atmosfære.
BEMÆRK: Se materialetabellen for cellelinjeinformation og kulturmediumkomponenter.
- Kultur humane tumorcellelinjer i det modificerede medium ved 37 °C i en befugtet 5% CO2 atmosfære.
- Celletransfektion
- Brug siRNA til at slå FAM83A-ekspression ned i cellerne.
BEMÆRK: Se tabel 1 for den specifikke siRNA-sekvens. - Frøceller i 6-brøndplader og inkuberes med blandingen af 50 nM si-FAM83A eller siRNA-NC og 8 μL transfektionsmiddel eller kun 8 μL transfektionsmiddel i 4-6 timer efter opnåelse af 50% -70% sammenløb. Føj kun serumfri DMEM til det negative kontrolelement.
- Efter inkubationen udskiftes mediet indeholdende transfektionsmidlet med DMEM + 10% føtalt kalveserum. 48 timer efter transfektion behandles yderligere med 5 μM cisplatin (DDP) i 24 timer som beregnet og høstes alle cellerne til total RNA-ekstraktion og qRT-PCR-analyse.
- Brug siRNA til at slå FAM83A-ekspression ned i cellerne.
3. EdU-detektion til celleproliferationsanalyse
BEMÆRK: Brug EdU-celleproliferationssættet til at vurdere celleproliferation in vitro i henhold til producentens anvisninger.
- Frø cellerne i 6-brøndplader og inkuber dem med 10 μM EdU-opløsning i 2 timer. Fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) og permeabiliser med 0,3% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved RT.
- Permeabiliseringsbufferen fjernes, og der tilsættes 500 μL 1x reaktionsopløsning. Derefter inkuberes i 30 minutter ved RT i mørke til nuklear farvning.
- Pletceller med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og visualiser dem under et fluorescensmikroskop ved 200x forstørrelse. Plet kernerne i de prolifererende celler med EdU og undersøg dem for rød fluorescens.
- Endelig skal du bruge software til at kvantificere resultaterne ved at tælle mindst 10 tilfældige felter og beregne spredningshastighederne ved hjælp af forholdet mellem de fluorescerende positive celler og samlede celler.
4. Sårhelingsanalyse
- Frøceller i 6-brøndplader med en densitet på 2 × 105 celler pr. Brønd.
- Når cellerne opnår 90% sammenløb, skal du bruge en steril 10 μL mikropipettespids til forsigtigt at skabe en lineær ridse i cellemonolaget. Skyl forsigtigt brøndene med sterilt PBS for at fjerne løsrevne celler og snavs forårsaget af ridser.
- Endvidere inkuberes cellerne i medium indeholdende 1% FBS. Derefter observere og tage billeder med det omvendte mikroskop til helbredelse af den sårede region ved 12, 24 og 48 timer.
5. Assay til porøs membranindsats
- Der fremstilles en cellesuspension i cellekulturmedium ved den ønskede cellekoncentration (indeholdende 4 × 104 celler), herunder transfekterede eller kontrol-C33a-celler og HeLa. Tilsæt cellesuspensionen til membranindsatsernes øverste kammer, hvilket sikrer en jævn fordeling. Tilsæt komplet medium til det nederste kammer.
- Efter inkubation i 24 timer anvendes methylalkohol og 0,1% krystalviolet til fiksering og farvning af cellerne, der migrerer til henholdsvis de nedre kamre.
- Brug et omvendt mikroskop til at tage billeder, og analysér derefter antallet af migrerende celler ved at tælle mindst 10 tilfældige felter med ImageJ.
- For talanalysen med ImageJ skal du åbne billedet i ImageJ-softwaren, gå til fanen Billede i værktøjsmenuen, vælge Juster og derefter klikke på Tærskel. Juster tærskelindstillingerne, hvis det er nødvendigt, indtil kun cellerne er synlige mod en hvid baggrund.
- Klik på Anvend i tærskelvinduet for at anvende disse indstillinger på billedet. Vælg nu værktøjet Wand (sporing) fra værktøjslinjen (placeret øverst i vinduet).
- Klik på det område af billedet, hvor cellerne er placeret, for at vælge alle cellerne i det tærskelede billede. Når cellerne er fremhævet, skal du gå til Analyser i menuen Værktøj og derefter klikke på Analyser partikler. I vinduet Analysér partikler skal du indtaste den ønskede størrelse (f.eks. 0 - uendelig) og cirkularitetsværdier (f.eks. 0,00 - 1,00) i henhold til de eksperimentelle krav for at inkludere alle celler i tællingen.
- Klik på OK , og vent på, at softwaren tæller cellerne, og at der vises et nyt vindue med analyseresultaterne.
6. Analyse af kolonidannelse
- Seed 2 × 105 celler pr. brønd af Si-NC og Si-FAM83A grupper i en 6-brønds plade med eller uden 5 μM cisplatin (DDP) behandling i 24 timer.
- Efter en 24 timers periode med lægemiddelbehandling løsnes cellerne ved hjælp af 0,25% trypsin og resuspenderes i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% FBS. De resuspenderede celler udskilles i en plade med 6 huller med en massefylde på 1 × 103 celler pr. brønd, og de inkuberes derefter i en 5 % CO2 -inkubator ved en temperatur på 37 °C.
- Efter inkubationen i ~ 7-10 dage, når kolonier er synlige, fastgøres cellerne med 4% Polyoxymethylen og pletter dem med Giemsa-farvningsopløsning i 20 minutter.
- Vask cellerne lidt og lad pladerne lufttørre. Tag billeder af koloniklyngerne med mikroskop og tæl antallet af kolonier, der indeholder mere end 50 celler.
7. Mitokondriel membrandepolarisering (MMP) analyse ved anvendelse af JC-1 farvestof
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupperes i en seks-brøndplade og kultur i 24 timer med eller uden 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Inkuber med 1x JC-1 farvningsopløsning i 15-20 min under 5% CO2 ved 37 ° C ved hjælp af et mitokondriemembranpotentialeanalysesæt i henhold til producentens anvisninger.
- Vask cellerne og undersøg dem under et fluorescerende mikroskop ved 200x forstørrelse ved hjælp af excitations- og emissionsbølgelængder for JC-1 ved henholdsvis ~ 490 nm og 590 nm. For at visualisere JC-1-fluorescensen skal du bruge passende filtre, såsom et blåt excitationsfilter (450-490 nm) og et rødt emissionsfilter (langpas > 590 nm) til selektivt at fange det udsendte fluorescenssignal.
8. Flowcytometrisk analyse af mPTP
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupperes i en seks-brøndplade og kultur i 24 timer med eller uden 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Fjern dyrkningsmediet fra cellerne, resuspender cellerne i PBS, og tilsæt 300 μL hver (1x volumen) Calcein AM-farvningsopløsning og fluorescensslukkende arbejdsløsning for at dække cellerne jævnt. Cellerne inkuberes ved 37 °C i et lysbeskyttet miljø i 30-45 min, og mediet erstattes med frisk, forvarmet dyrkningsmedium ved 37 °C. Inkuber cellerne ved 37 °C i et lysbeskyttet miljø i yderligere 30 minutter for at sikre fuldstændig hydrolyse af Calcein AM af intracellulære esteraser, hvilket resulterer i dannelsen af intracellulær grønfluorescerende Calcein.
- Fjern dyrkningsmediet, vask cellerne 2-3x med PBS, og tilsæt detektionsbuffer. Detekter celle mPTP ved hjælp af flowcytometri og en excitationsbølgelængde på 488 nm.
9. Flowcytometri
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupperes i en seks-brøndplade og kultur i 24 timer med eller uden 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Efter 24 timers lægemiddelbehandling resuspenderes cellerne i 200 μL bindende bufferopløsning og blandes forsigtigt 10 μL Annexin V-FITC og 5 μL propidiumiodid (PI) i cellesuspensionen. Inkuber blandingen i 15 minutter, mens du undgår lys, og tilsæt 300 μL bindende bufferopløsning til cellerne. Opdag celleapoptose ved hjælp af flowcytometri ved en excitationsbølgelængde på 488 nm.
10. RT-PCR-analyse
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupperes i en seks-brøndplade og kultur i 24 timer med eller uden 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Det totale RNA ekstraheres fra tumorcellerne ved hjælp af RNA-ekstraktionsreagenset, og det ekstraherede RNA omdannes til komplementært DNA (cDNA) med cDNA-synteseblandingen ved inkubation ved 42 °C i 45 minutter og derefter ved 95 °C i 5 minutter.
- Forbered PCR-reaktionsblandingen indeholdende DNA-polymerase, nukleotider, buffer og de designede genspecifikke primere. Der tilsættes cDNA-skabelonen til reaktionsblandingen for PCR-reaktionen i realtid, og der udføres PCR på det kvantitative PCR-instrument i realtid under følgende termocykliske betingelser: denaturering ved 95 °C i 30 s efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C i 5 s og 60 °C i 30 s og smeltekurvetrinnet ved 95 °C i 15 s 60 °C i 1 min. og 95 °C i 15 sekunder. Kvantificer mRNA-niveauerne ved hjælp af 2-ΔΔCq-metoden ved hjælp af GAPDH som intern kontrol.
BEMÆRK: RT-PCR-reaktionssystemet er vist i tabel 1, og primersekvenserne er vist i tabel 1.- For at beregne 2-ΔΔCq-værdien måles Cq-værdierne for målgenet og referencegenet (GAPDH) i prøverne. ΔCq beregnes ved at trække referencegenets Cq-værdi fra målgenets Cq-værdi for hver prøve. ΔΔCq beregnes ved at trække ΔCq for en kontrolprøve fra ΔCq for hver forsøgsprøve. Til sidst beregnes 2−ΔΔCq-værdien ved at hæve 2 til effekten af ΔΔCq-værdien.
BEMÆRK: Cq-værdien repræsenterer det cyklusnummer, hvor fluorescenssignalet når den indstillede tærskel.
- For at beregne 2-ΔΔCq-værdien måles Cq-værdierne for målgenet og referencegenet (GAPDH) i prøverne. ΔCq beregnes ved at trække referencegenets Cq-værdi fra målgenets Cq-værdi for hver prøve. ΔΔCq beregnes ved at trække ΔCq for en kontrolprøve fra ΔCq for hver forsøgsprøve. Til sidst beregnes 2−ΔΔCq-værdien ved at hæve 2 til effekten af ΔΔCq-værdien.
11. Western blot-analyse
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupperes i en seks-brøndplade og kultur i 24 timer med eller uden 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Saml de dyrkede celler og vask dem med iskold fosfatbufret saltvand (PBS) for at fjerne eventuelle resterende vækstmedier eller serum. Lysér cellerne ved hjælp af RIPA Lysis Buffer indeholdende phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) for at frigive de cellulære proteiner. Cellerne inkuberes på is i nogle minutter for at sikre fuldstændig lysering og centrifugeres ved 4 °C, 12.000 × g i 15 minutter. Supernatanten opsamles for at bestemme proteinkoncentrationen.
- Bestem proteinkoncentrationen i cellelysatet ved hjælp af et BCA-proteinanalysesæt i henhold til producentens anvisninger. Bland cellelysatet med en belastningsbuffer og opvarm blandingen ved 95-100 °C i 5-10 minutter for at denaturere proteinerne og sikre ensartet adskillelse på gelen.
- Fra hver prøve lægges 30 μg totalt protein på en SDS-PAGE-gel, og SDS-PAGE køres under en konstant spænding på 80 V. Stop elektroforesen, når bromphenolblåt når bunden af separationsgelen.
- Overfør de adskilte proteiner fra gelen til en polyvinyldifluoridmembran ved hjælp af et vådt overførselssystem på et isbad med en strøm på 200 mA i 1,5 timer.
- Bloker membranen med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med 0,05% Tween-20 buffer (TBST) i 1 time ved RT og inkuber natten over ved 4 °C med de respektive antistoffer angivet i materialetabellen.
- Membranen vaskes flere gange med TBST og inkuberes med de sekundære antistoffer (materialetabel) i 1 time ved RT efterfulgt af vask med TBST. Visualiser proteinbåndene ved hjælp af et forbedret kemiluminescensdetekteringssæt og billedsystem.
12. Statistisk analyse
- Da alle eksperimentelle datapunkter vil være uafhængige, skal du præsentere dataene som gennemsnittet ± SD. Udfør statistisk analyse.
- Brug envejsvariansanalyse (ANOVA) til flere sammenligninger og Dunnetts test til sammenligning af hver gruppe med kontrolgruppen. Brug elevens t-test (uparret to-halet) til sammenligning af to grupper; anser P < 0,05 for at være signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TCGA-databaseanalyse og PCR-validering
Fra TCGA-databaseanalysen gennemførte vi en sammenlignende analyse af mRNA-ekspressionsniveauer i 306 livmoderhalskræftcelleprøver og 13 normale celleprøver for at undersøge differentialekspressionen af FAM83A. FAM83A blev opreguleret i livmoderhalskræft, mens dets ekspression i normalt livmoderhalsvæv var ubetydelig (figur 1A). For at få yderligere indsigt i de prognostiske implikationer af FAM83A-udtryk udførte vi en Kaplan-Meier-kurveanalyse. Det er slående, at patienter med højere FAM83A-ekspression viste en markant dårligere samlet overlevelse (figur 1B). For at bestemme FAM83A's rolle i livmoderhalskræft undersøgte vi FAM83A-ekspressionsniveauer i to livmoderhalskræftcellelinjer, HeLa og C33a, samt i en udødeliggjort cervikal cellelinje, End1 / E6E7. Ved hjælp af qRT-PCR observerede vi en signifikant overekspression af FAM83A i HeLa- og C33a-cellelinjerne sammenlignet med End1/E6E7-cellelinjen (figur 1C). Disse resultater understreger vigtigheden af FAM83A i forbindelse med livmoderhalskræft.
Proliferations- og apoptoseeksperimenter for at verificere FAM83A's biologiske funktion i livmoderhalskræft
For at undersøge FAM83A's funktionelle rolle i livmoderhalskræft brugte vi siRNA-medieret knockdown af FAM83A i C33a- og HeLa-celler (figur 2A, B). Vi vurderede derefter virkningen af FAM83A-undertrykkelse på celleproliferation. EdU-farvning afslørede, at nedsat ekspression af FAM83A signifikant hæmmede celleproliferation i både C33a- og HeLa-celler (figur 2C-F). Udødelige maligne celler er forbundet med ekstremt lave apoptosehastigheder10. Derfor blev niveauerne af anti- og proapoptotiske proteiner vurderet i kontrol- og si-FAM83A-behandlede livmoderhalskræftceller. Western blot-analyser afslørede, at undertrykt ekspression af FAM83A øgede ekspressionen af Bax og spaltede caspase3-proteiner (proapoptotiske proteiner), reducerede ekspressionen af Bcl-2 (antiapoptotisk protein) og øgede Cytc-frigivelse (figur 2C-E), hvilket er i overensstemmelse med observationen om, at antiapoptotiske proteiner regulerer apoptose ved at blokere mitokondriefrigivelsen af Cytc (figur 2G-J)10. Samlet set antydede disse data, at FAM83A spiller en vigtig rolle i reguleringen af celleproliferation af livmoderhalskræft og apoptose.
Sårheling og porøs membranindsatsassays for at verificere den biologiske funktion af FAM83A i livmoderhalskræft
Sårheling og membranindsatsanalyser blev udført for at undersøge virkningerne af FAM83A-undertrykkelse på migration og invasion af livmoderhalskræftceller. Resultaterne afslørede, at livmoderhalskræftceller med undertrykt FAM83A-ekspression migrerede (figur 3A-D) og invaderede (figur 3E-H) mindre effektivt end kontrolcellerne.
Virkninger på mitokondriefunktion og PI3K/AKT signalvej
I betragtning af PI3K/AKT's rolle i induktionen af celleapoptose havde vi til formål at afgøre, om undertrykkelsen af FAM83A-ekspression ville hæmme den konstitutive phosphorylering af PI3K/Akt/mTOR-vejen i livmoderhalskræft. Undertrykkelse af FAM83A hæmmede signifikant de vigtigste fosforylerede proteinniveauer i PI3K / Akt / mTOR-vejen, herunder p-PI3K, p-Akt og p-mTOR i c333a- og HeLa-celler (figur 4A-D). Mitokondrier er organellerne, der er ansvarlige for cellulær metabolisme og induktion af celleapoptose. Akkumulerende beviser indikerer, at kræftcelleapoptose involverer mitokondriel dysfunktion gennem den iboende mitokondrievej på grund af forbedret mitokondriepermeabilitet og frigivelse af proapoptotiske molekyler såsom Cytc i cytoplasma10. PI3K / AKT-vejen kunne regulere translokationen af Bax ind i mitokondrierne og inducere Cytc-frigivelse som reaktion på apoptotiske stimuli. Derfor er det tænkeligt, at de onkogene komponenter i PI3K-AKT signalvejen regulerer celleapoptose direkte ved at påvirke mitokondrieadfærd. Således blev der udført et levende celle mitokondriel permeabilitetspore (mPTP) assay for at bestemme mitokondriestatus. mPTP-åbning er forbundet med apoptotisk og nekrotisk celledød11. I dette assay bevares et grønt fluorescerende farvestof (calcein AM) i cytoplasma og mitokondrier, når mPTP lukkes, mens farvestoffet i cytoplasmaet slukkes afCoCl2, hvilket kun efterlader den intensive fluorescens i mitokondrierne. Resultaterne afslørede, at cellepopulationer med intens grøn fluorescens i mitokondrierne faldt signifikant efter FAM83A-undertrykkelse, hvilket indikerer en åbnet mPTP (figur 4E, F). Yderligere undersøgte vi ændringerne i mitokondriemembranpotentialet (ΔΨm) ved hjælp af JC-1-farvning. JC-1 danner aggregater (rød fluorescens) i levende celler indeholdende intakte mitokondrier med højt membranpotentiale og monomerer (grøn fluorescens) under lav MMP i apoptotiske celler. FAM83A-undertrykkelse reducerede gradvist MMP (figur 4G).
Analyse af lægemiddelfølsomhed for spredning og invasion
Cisplatin (DDP)-baseret kemoterapi er en standard behandlingsstrategi for livmoderhalskræft. Kemoresistens er dog fortsat en udfordring. Vi undersøgte FAM83A's rolle i behandlingen af livmoderhalskræft ved hjælp af cisplatin. Kontrol, si-NC-behandlede og si-FAM83A-behandlede HeLa-celler blev behandlet med eller uden 5 μM cisplatin12. Endvidere blev virkningerne af FAM83A-undertrykkelse på cellelevedygtighed vurderet. DDP inducerede en mere signifikant hæmmende effekt på proliferation af HeLa-celler efter FAM83A-suppression sammenlignet med kun DDP-behandling (figur 5A og figur 5C). Efter behandling af livmoderhalskræftceller med 5 μM cisplatin hæmmede FAM83A-undertrykkelse også celleinvasion (figur 5B og figur 5D).
Lægemiddelfølsomhedsanalyse for mitokondriefunktion
Ved at behandle Si-NC-behandlede og si-FAM83A-behandlede HeLa-celler med eller uden 5 μM cisplatin (DDP) evaluerede vi mitokondriemembranpotentialet (MMP) og vurderede mitokondrieskader forårsaget af celledød ved hjælp af JC-1-farvning. DDP inducerede flere mitokondrieskader som afsløret ved et fald i JC-1 monomer procent efter FAM83A knockdown, sammenlignet med kun DDP behandling (figur 6A og figur 6D). Efter behandling af livmoderhalskræftceller med 5 μM cisplatin hæmmede FAM83A knockdown også kolonidannelse (figur 6B og figur 6E) og forbedret celleapoptose (figur 6C og figur 6F). Derudover øgede FAM83A knockdown i nærvær af DDP markant ekspressionen af proapoptotiske proteiner, Bax og spaltet caspase3, fremmede Cytc-frigivelse og reducerede Bcl-2-ekspression (figur 6G, H). Disse resultater indikerede, at FAM83A knockdown sensibiliserede livmoderhalskræftceller til DDP via apoptoseinduktion.
Figur 1: FAM83A overekspression i livmoderhalskræftceller og korrelation med dårligere prognose. (A) Boxplot-analyse af mRNA-niveauerne af FAM83A i livmoderhalskræftprøver. (B) Kaplan-Meier-analyse af FAM83A-ekspression til bestemmelse af samlet overlevelse hos patienter med livmoderhalskræft. (C) Relative mRNA-niveauer af FAM83A i livmoderhalskræftcellelinjer HeLa og C33a og human udødeliggjort cervikal cellelinje End1 / E6E7. Dataene præsenteres som gennemsnittet ± SD for tre uafhængige eksperimenter. *P < 0,05 sammenlignet med End1/E6E7-celler ved hjælp af envejs ANOVA. Forkortelser: CESE = Cervikal pladecellekarcinom og endocervikal adenokarcinom; HR = risikoforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkninger af undertrykkelse af FAM83A på spredning og apoptose af livmoderhalskræft. C33a- og HeLa-celler blev transfekteret med FAM83A-specifikke siRNA'er. (A,B) mRNA-niveauer af FAM83A blev vurderet i livmoderhalskræftcellelinjer ved anvendelse af qRT-PCR.Celleproliferation i (C) C33a og (D) HeLa-celler blev bestemt ved anvendelse af EdU-assayet. (E,F) EDU-fluorescensbillederne af C33a- og Hela-celler. (G-J) Western blot-analyse til undersøgelse af niveauerne af apoptoserelaterede proteiner, herunder Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 og cleaved-caspase-3; GAPDH blev brugt som lastekontrol. Dataene præsenteres som gennemsnittet ± SD for tre uafhængige eksperimenter. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001 sammenlignet med kontrolceller med envejs ANOVA. Forkortelser: NC = negativ kontrol; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; CytC = cytokrom C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Effekt af FAM83A på migration og invasion af livmoderhalskræftceller in vitro. (A-D) Sårhelingsanalyse blev udført for at vurdere cellemigration. Billeder blev taget ved 0, 24 og 48 timer. (E-H) Transwell-analyser blev udført for at undersøge celleinvasion. Skalastænger = 100 μm (E,F). Dataene præsenteres som gennemsnittet ± SD for tre uafhængige eksperimenter. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001 sammenlignet med kontrolceller, der bruger envejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekt af FAM83A-undertrykkelse på PI3K/AKT/mTOR-vejen og mitokondriefunktionen. (A-D) Western blot-analyse for at bestemme niveauerne af proteiner fra PI3K / AKT / mTOR-vej i C33a- og HeLa-celler efter FAM83A-undertrykkelse. (E-H) Mitokondriel membranpotentialeanalyse ved hjælp af JC-1-farvning. JC-1 aggregater blev farvet i rødt, og JC-1 monomerer blev farvet i grønt, hvilket indikerer en lavere MMP. (I,J) Mitokondriepermeabilitet blev vurderet ved hjælp af et mPTP-kit og flowcytometri. Skalastænger = 50 μm (E, F). Dataene præsenteres som gennemsnittet ± SD for tre uafhængige eksperimenter. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 sammenlignet med kontrolceller ved hjælp af envejs ANOVA. Forkortelser: MMP = mitokondriemembranpotentiale; mPTP = mitokondriel permeabilitet overgangspore. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Effekter af FAM83A-undertrykkelse på hæmning af DDP på celleproliferation og invasion af livmoderhalskræftceller. HeLa-celler blev transfekteret med si-NC eller si-FAM83A og behandlet med eller uden 5 μM DDP. (A,C) Effekt af DDP på celleproliferation i kontrol, si-NC-behandlede og si-FAM83-behandlede HeLa-celler. (B,D) Effekt af DDP på celleinvasionen i kontrol, si-NC-behandlede og si-FAM83-behandlede HeLa-celler. Dataene præsenteres som gennemsnittet ± SD for tre uafhængige eksperimenter. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 sammenlignet med kontrolcellerne. &&P < 0,01; &&&P < 0,001 sammenlignet med DDP ved hjælp af envejs ANOVA. Forkortelser: DDP = diamindichlorplatin; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Effekter af FAM83A undertrykkelse på virkningerne af DDP på apoptose i livmoderhalskræftceller. HeLa-celler blev transfekteret med si-NC eller si-FAM83A og behandlet med eller uden 5 μM DDP. (A,D) MMP-analyse ved hjælp af JC-1-farvning. (B,E) Pladekloning resultater. (C,F) Flowcytometri detekterer apoptosehastigheder i forskellige behandlingsgrupper. (G,H) Western blot-analyse af mitokondrierelaterede apoptotiske proteiner, herunder Bcl-2, Bax, Cytc og nedstrøms spaltet caspase-3. GAPDH blev brugt som lastekontrol. Dataene præsenteres som gennemsnittet ± SD for tre uafhængige eksperimenter. *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001 sammenlignet med kontrolcellerne. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001 sammenlignet med DDP ved hjælp af envejs ANOVA. Forkortelser: DDP = diamindichlorplatin; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: siRNA, qRTPCR-primere og qRT-PCR-reaktionsopsætningen, der blev anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelsen af tumormålgener er af største betydning for både forebyggelse og behandling af livmoderhalskræft. Forståelse af de specifikke gener, der spiller en væsentlig rolle i livmoderhalskræftudvikling og progression, giver værdifuld indsigt i sygdommens underliggende molekylære mekanismer. Desuden kan identifikation af disse målgener føre til udvikling af nye terapeutiske strategier og målrettede terapier. I denne undersøgelse beskriver vi brugen af TCGA-datasætanalyse til at identificere FAM83A som et målgen og undersøge dets mekanistiske roller i livmoderhalskræft. Vi observerer en signifikant høj ekspression af FAM83A i livmoderhalskræftceller, hvilket er forbundet med dårlig prognose hos patienter med livmoderhalskræft. En række cellebaserede eksperimenter afslørede høj FAM83A-ekspression i livmoderhalskræftceller, som spiller en kritisk rolle i reguleringen af celleproliferation, migration og invasion. Undertrykkelse af FAM83A-ekspression hæmmede proliferation og migration og fremmede apoptose i livmoderhalskræftceller.
Konstruktion af FAM83A-knockdown livmoderhalskræftcellelinjer er det mest kritiske trin i denne undersøgelse. siRNA'er designes og valideres i henhold til målgensekvenserne for at sikre deres effektivitet. Endvidere transfekteres cellelinjerne for livmoderhalskræft ved anvendelse af siRNA. Succesraten for plasmidtransfektion er afgørende for efterfølgende eksperimenter, som kræver streng kontrol af celletæthed og plasmidtæthed. Endvidere observeres transfektionseffektiviteten under et fluorescensmikroskop for at sikre, at efterfølgende eksperimenter kan udføres. Western blotting og qRT-PCR-resultater bekræfter, at hæmningen af FAM83A undertrykte PI3K/AKT-vejen og inducerede mitokondriel dysfunktion. Vi antager, at mekanismen involverer hæmning af translokationen af Bax fra cytoplasmaet til mitokondrierne af PI3K / AKT, hvilket fremmer celleoverlevelse13.
Fremskridt inden for behandling af livmoderhalskræft har gjort det muligt at udvikle nye målmolekyler. Identifikationen af et nyt onkogen kan anvendes terapeutisk til at forbedre den kliniske prognose for cervikale maligniteter14,15. I denne undersøgelse konstruerede vi med succes et FAM83A knockdown-system i HeLa- og C33a-celler og verificerede virkningerne af FAM83A-knockdown på livmoderhalskræftceller på celleniveau. Vi foreslår, at hæmning af FAM83A kan bruges til behandling af livmoderhalskræft.
Denne undersøgelse har dog nogle begrænsninger. For det første udfører denne undersøgelse kun genscreening gennem databasen og mangler patologiske data fra kliniske patienter. For det andet har denne undersøgelse kun valideret effekten in vitro, og yderligere in vivo-undersøgelser var nødvendige for at verificere resultaterne. Ikke desto mindre kan metoderne til målgenidentifikation, genknockout og cellulær validering til at identificere målrettede terapeutiske loci, der er uddybet i denne undersøgelse, give forskningsideer til opdagelse og validering af målgener for andre sygdomme.
Sammenfattende var FAM83A overudtrykt og korreleret med en dårligere prognose i livmoderhalskræft. FAM83A regulerer spredning, migration og invasion af livmoderhalskræftceller. Undertrykkelse af FAM83A-induceret mitokondriel dysfunktion og apoptose, sensibiliserende livmoderhalskræftceller til cisplatin. Disse resultater indikerede, at FAM83A er et egnet forskningsmål til behandling af livmoderhalskræft. Denne undersøgelse bidrog til fremskridtene inden for adjuverende kemoterapisigter mod at forbedre prognosen hos patienter med livmoderhalskræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter i dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (nr. 2020HC06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L.
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L.
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
