Summary
Her viser vi prosedyrene for FAM83A knockdown; analysene for å oppdage dens effekter på spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller; og sensibilisering av disse cellene til cisplatin. Denne studien gir et lovende målgen for livmorhalskreft og en referanse for videre legemiddelforskning.
Abstract
Utforskningen av tumormålgener har avgjørende betydning for forebygging og behandling av livmorhalskreft. I denne studien skisserer vi trinnene som er involvert i identifiseringen av et tumormålgen FAM83A i livmorhalskreft. Først ble Cancer Genome Atlas-datasettet ansatt for å validere uttrykket og den prognostiske betydningen av FAM83A hos kvinner. Et lite forstyrrende RNA (siRNA) ble brukt til nedslag av FAM83A-genet i HeLa- og C33a-celler . Deretter ble 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) farging utført for å bestemme effektene på tumorcellens proliferasjonsevne. Sårheling og porøse membraninnsatsanalyser ble utført for å evaluere tumorcellemigrasjon og invasjonsevner.
Vestlig blotting ble brukt til å kvantifisere apoptoserelaterte proteinnivåer. JC-1-farging ble brukt til å evaluere mitokondrielle funksjonsendringer. Videre ble cisplatinintervensjon (diamindikloroplatinum, DDP) brukt for å vurdere det terapeutiske potensialet til målgenet. Flowcytometri og kolonidannelsesanalyser ble utført for å validere genets anticanceregenskaper ytterligere. Som et resultat ble FAM83A knockdown vist å hemme spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller og sensibilisere disse cellene til cisplatin. Disse omfattende metodene validerer samlet FAM83A som et tumorassosiert målgen, og holder løfte som et potensielt terapeutisk mål i forebygging og behandling av livmorhalskreft.
Introduction
Livmorhalskreft er en global bekymring, da det er en av de ledende typene gynekologisk malignitet over hele verden og er den viktigste årsaken til kreftrelatert dødelighet hos kvinner1. Radikal kirurgi og kjemoradioterapi er forbundet med høye kurrater i primærstadiet. Imidlertid er behandlingsresultater for pasienter på avansert stadium av livmorhalskreft som utvikler metastatisk sykdom svært ugunstige2. Derfor er det avgjørende å forstå de biologiske mekanismene som ligger til grunn for migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller og identifisere potensielle terapeutiske mål for forebygging og behandling av denne sykdommen.
Identifisering av målgener involvert i kreftprogresjon og å finne måter å hemme deres uttrykk eller handling på, presenterer lovende behandlingsalternativer. I denne studien identifiserte vi FAM83 som et kreftfremkallende gen og undersøkte videre dets hemmende effekter på C33a- og HeLa-celler. FAM83 familie onkogener (FAM83A-H) er mye rapportert i humane kreftformer 3,4. Nylig ble FAM83A rapportert å være oppregulert i lunge5, bryst6, eggstokk7 og bukspyttkjertel8 kreftformer, noe som indikerer at FAM83A spiller en viktig rolle i kreftprogresjon ved å fremme spredning, invasjon, stamcellelignende egenskaper og stoffresistens i tumorcellene. Det er viktig at FAM83A ble identifisert som et av de nye kandidatgenene assosiert med cervikal lesjonsprogresjon og karsinogenese9. Til tross for bekreftelsen av forhøyet FAM83A-uttrykk i humane livmorhalskreftceller, forblir den spesifikke virkningen og underliggende mekanismer av FAM83A i livmorhalskreft uklar.
I denne studien skisserer vi protokollene som er involvert i identifiseringen av FAM83A som et tumormålgen i livmorhalskreft og bruker et lite forstyrrende RNA (siRNA) for knockdown av FAM83A-genet i HeLa- og C33a-celler . 5-Etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) farging ble utført for å bestemme effektene på tumorcelleproliferasjon, mens sårheling og porøse membraninnsatsanalyser bidro til å evaluere tumorcellemigrasjon og invasjonsevner.
Vestlig blotting ble utført for å bestemme nivåene av apoptoserelaterte proteiner, og JC-1-farging ble brukt til å evaluere mitokondrielle funksjonsendringer. Dermed rapporterte vi at FAM83A spiller en kritisk rolle i celleproliferasjon, metastase og invasjon i livmorhalskreft. Gjennom PI3K / AKT-pathway-assosiert mitokondriell dysfunksjon og apoptose, FAM83A knockdown sensibiliserte livmorhalskreftceller til cisplatin (diamindichloroplatinum, DDP). Denne studien gir et nytt mål for livmorhalskreft og muligens andre kreftformer og en referanse for utvikling av strategier for å overvinne motstanden av kreftceller til visse kjemoterapeutiske legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien var helt i tråd med retningslinjene for publisering gitt av TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen.
1. Datakilde og bioinformatikkanalyse
- Få RNA-sekvenseringsdata fra databasen Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) for klyngeanalyse. Bruk GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), et nettbasert verktøy for å beregne rå RNA-Seq-data av prøver fra TCGA-prosjekter, for å skjerme for kandidatkreftmedisinmål med en standard behandlingsrørledning.
MERK: GEPIA-nettstedet er fritt tilgjengelig for alle brukere. - Gå til GEPIAs hjemmeside og klikk på Cancer Type Analysis, velg alternativet Differensialgenanalyse , og angi følgende parametere: Cancer name = CESE (definert som Cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma on this webpage), |Log2FC| Cutoff = 1, q-verdi Cutoff = 0,01, Differensialmetoder = ANOVA, og Kromosomfordeling = begge. Klikk deretter på Liste for å få en genliste som viser differensialuttrykk mellom svulst og normale grupper.
MERK: Det krever en omfattende litteraturgjennomgang for å identifisere differensielt uttrykte kandidatgener. I denne studien, med bakgrunn fra tilgjengelig litteratur, fokuserer vi på det aktuelle tumorgenet, FAM83A. - Undersøk deretter uttrykket av FAM83A i livmorhalskreft og normalt vev ved hjelp av GEPIA ved å gå videre til alternativet Expression DIY på nettstedet og velg Boxplot som diagramtype. Skriv inn FAM83A i genparameterfeltet og angi følgende parametere: |Log2FC| Grenseverdi = 1; q-verdi Cutoff = 0,01. Velg CESE som kreftnavn og Match TCGA-normaldata for datafeltet Matchet normal , slik at alle andre innstillinger er standard. Klikk på Plot og la nettstedet generere en boxplot som representerer differensialuttrykket til FAM83A-genet ; Lagre boksplottet for fremtidig referanse og analyse.
- Til slutt analyserer du den totale overlevelsen til pasienter som bærer svulster med forskjellige nivåer av FAM83A-uttrykk i livmorhalskreft. Naviger til alternativet Overlevelsesplott på nettstedet, sett genet til FAM83A, og velg Total overlevelse som analysetype . Legg til tumornavnet CESE, velg Måneder for Akseenheter, og la alle andre parametere være i standardinnstillingene. Klikk på Plot og la nettstedet generere et overlevelseskurvediagram; Lagre dette diagrammet for fremtidig referanse og analyse.
- Ta hensyn til både differensialuttrykket av FAM83A i svulster og dets korrelasjon med pasientoverlevelsesanalyse for å identifisere FAM83A som et potensielt terapeutisk målgen i livmorhalskreft.
2. Cellebaserte eksperimenter
- Cellekultur
- Dyrkning av humane tumorcellelinjer i modifisert medium ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 atmosfære.
MERK: Se materialfortegnelsen for cellelinjeinformasjon og komponenter i kulturmedium.
- Dyrkning av humane tumorcellelinjer i modifisert medium ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 atmosfære.
- Cell transfeksjon
- Bruk siRNA til å slå ned FAM83A-uttrykk i cellene.
MERK: Se tabell 1 for den spesifikke siRNA-sekvensen. - Frøceller i 6-brønnsplater og inkuberer med blandingen av 50 nM si-FAM83A eller siRNA-NC og 8 μL transfeksjonsmiddel eller bare 8 μL transfeksjonsmiddel i 4-6 timer etter å ha oppnådd 50% -70% sammenløp. Legg bare serumfri DMEM til den negative kontrollen.
- Etter inkubasjonen, erstatt mediet som inneholder transfeksjonsmidlet med DMEM + 10% føtalkalveserum. Videre, 48 timer etter transfeksjon, behandle med 5 μM cisplatin (DDP) i 24 timer som beregnet og høst alle cellene for total RNA-ekstraksjon og qRT-PCR-analyse.
- Bruk siRNA til å slå ned FAM83A-uttrykk i cellene.
3. EdU-deteksjon for celleproliferasjonsanalyse
MERK: Bruk EdU Cell Proliferation Kit til å vurdere celleproliferasjon in vitro i henhold til produsentens instruksjoner.
- Frø cellene i 6-brønnsplater og inkuber dem med 10 μM EdU-løsning i 2 timer. Fest cellene med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur (RT) og permeabiliser med 0,3% Triton X-100 i PBS i 10 min ved RT.
- Fjern permeabiliseringsbufferen og tilsett 500 μL 1x reaksjonsløsning. Deretter ruger du i 30 minutter ved RT i mørket for atomfarging.
- Flekk celler med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og visualiser dem under et fluorescensmikroskop ved 200x forstørrelse. Flekk kjernene til de prolifererende cellene med EdU og undersøk dem for rød fluorescens.
- Til slutt, bruk programvare for å kvantifisere resultatene ved å telle minst 10 tilfeldige felt og beregne proliferasjonshastighetene ved å bruke forholdet mellom fluorescerende positive celler og totale celler.
4. Sårhelingsanalyse
- Frøceller i 6-brønnsplater med en tetthet på 2 × 105 celler per brønn.
- Når cellene oppnår 90 % konfluens, bruk en steril 10 μL mikropipettespiss for forsiktig å lage en lineær ripe i cellemonolaget. Skyll brønnene forsiktig med steril PBS for å fjerne eventuelle frittliggende celler og rusk forårsaket av riper.
- Videre inkuberer cellene i medium som inneholder 1% FBS. Deretter observerer og tar du bilder med det omvendte mikroskopet for helbredelse av den sårede regionen ved 12, 24 og 48 timer.
5. Porøs membraninnsatsanalyse
- Forbered en cellesuspensjon i cellekulturmedium ved ønsket cellekonsentrasjon (inneholdende 4 × 104 celler), inkludert transfekterte eller kontrolliserte C33a-celler og HeLa. Legg cellesuspensjonen til membraninnsatsens øverste kammer, og sørg for jevn fordeling. Legg komplett medium til underkammeret.
- Etter inkubering i 24 timer, bruk metylalkohol og 0,1% krystallfiolett for fiksering og farging av cellene som migrerer til henholdsvis de nedre kamrene.
- Bruk et invertert mikroskop til å ta bilder og deretter analysere antall migrerende celler ved å telle minst 10 tilfeldige felt med ImageJ.
- For tallanalysen med ImageJ, åpne bildet i ImageJ-programvaren, gå til Bilde-fanen i verktøymenyen, velg Juster, og klikk deretter på Terskel. Juster terskelinnstillingene om nødvendig til bare cellene er synlige mot en hvit bakgrunn.
- Klikk på Bruk i terskelvinduet for å bruke disse innstillingene på bildet. Velg nå tryllestavverktøyet (sporing) fra verktøylinjen (øverst i vinduet).
- Klikk på området i bildet der cellene er plassert for å velge alle cellene i det terskelbildet. Etter at cellene er uthevet, gå til Analyser i Verktøy-menyen og klikk deretter på Analyser partikler. I vinduet Analyser partikler skriver du inn ønsket størrelse (f.eks. 0 - uendelig) og sirkularitetsverdier (f.eks. 0,00 - 1,00) i henhold til eksperimentelle krav for å inkludere alle celler i tellingen.
- Klikk OK og vent til programvaren teller cellene og til et nytt vindu vises med analyseresultatene.
6. Analyse av kolonidannelse
- Frø 2 × 105 celler per brønn av Si-NC og Si-FAM83A grupper i en 6-brønns plate med eller uten 5 μM cisplatin (DDP) behandling i 24 timer.
- Etter en 24 timers periode med medikamentell behandling, løsne cellene ved hjelp av 0,25% trypsin og resuspendere dem i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som inneholder 10% FBS. Frø de resuspenderte cellene i en 6-brønnplate med en tetthet på 1 × 103 celler per brønn, og inkuber deretter i en 5% CO2 -inkubator ved en temperatur på 37 ° C.
- Etter inkubasjonen i ~ 7-10 dager når kolonier er synlige, fest cellene med 4% polyoksymetylen og flekk dem med Giemsa-fargeløsning i 20 minutter.
- Vask cellene litt og la platene lufttørke. Ta bilder av koloniklyngene med mikroskop og tell antall kolonier som inneholder mer enn 50 celler.
7. Mitokondriell membran depolarisering (MMP) analyse ved bruk av JC-1 fargestoff
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupper til en seks-brønns plate og kultur i 24 timer med eller uten 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Inkuber med 1x JC-1 fargeløsning i 15-20 minutter under 5% CO2 ved 37 ° C ved hjelp av et mitokondriemembranpotensialanalysesett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Vask cellene og undersøk dem under et fluorescerende mikroskop ved 200x forstørrelse ved bruk av eksitasjons- og utslippsbølgelengder for JC-1 ved henholdsvis ~ 490 nm og 590 nm. For å visualisere JC-1-fluorescens, bruk passende filtre, for eksempel et blått eksitasjonsfilter (450-490 nm) og et rødt utslippsfilter (langpass-> 590 nm) for selektivt å fange det utstrålede fluorescenssignalet.
8. Flowcytometrisk analyse av mPTP
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupper til en seks-brønns plate og kultur i 24 timer med eller uten 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Fjern kulturmediet fra cellene, resuspender cellene i PBS, og tilsett 300 μL hver (1x volum) Calcein AM-fargeløsning og fluorescensslukkende arbeidsløsning for å dekke cellene jevnt. Inkuber cellene ved 37 °C i et lysbeskyttet miljø i 30-45 minutter, og erstatt mediet med ferskt forvarmet dyrkningsmedium ved 37 °C. Inkuber cellene ved 37 ° C i et lysbeskyttet miljø i ytterligere 30 minutter for å sikre fullstendig hydrolyse av Calcein AM ved intracellulære esteraser, noe som resulterer i generering av intracellulær grønnfluorescerende kalcein.
- Fjern kulturmediet, vask cellene 2-3x med PBS, og legg til deteksjonsbuffer. Detekter celle mPTP ved hjelp av flowcytometri og en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm.
9. Flowcytometri
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupper til en seks-brønns plate og kultur i 24 timer med eller uten 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Etter 24 timers legemiddelbehandling, resuspender cellene i 200 μL bindingsbufferløsning og bland forsiktig 10 μL Annexin V-FITC og 5 mikroliter propidiumjodid (PI) i cellesuspensjonen. Inkuber blandingen i 15 minutter mens du unngår lys og tilsett 300 μL bindingsbufferløsning til cellene. Pådag celleapoptose ved hjelp av flowcytometri ved en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm.
10. RT-PCR-analyse
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupper til en seks-brønns plate og kultur i 24 timer med eller uten 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Ekstraher totalt RNA fra tumorcellene ved hjelp av RNA-ekstraksjonsreagenset og konverter det ekstraherte RNA til komplementært DNA (cDNA) med cDNA-synteseblandingen ved å inkubere ved 42 ° C i 45 minutter og deretter ved 95 ° C i 5 minutter.
- Forbered PCR-reaksjonsblandingen som inneholder DNA-polymerase, nukleotider, buffer og de designede genspesifikke primerne. Legg cDNA-malen til reaksjonsblandingen for sanntids PCR-reaksjon og utfør PCR på sanntids kvantitative PCR-instrument med følgende termocyklingsbetingelser: denaturering ved 95 °C i 30 s, etterfulgt av 40 sykluser på 95 °C i 5 s og 60 °C i 30 s, og smeltekurvetrinnet ved 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min, og 95 °C i 15 s. Kvantifiser mRNA-nivåene ved hjelp av 2-ΔΔCq-metoden ved å bruke GAPDH som internkontroll.
MERK: RT-PCR-reaksjonssystemet er vist i tabell 1, og primersekvensene er vist i tabell 1.- For å beregne 2-ΔΔCq-verdien måler du Cq-verdiene for målgenet og referansegenet (GAPDH) i prøvene. Beregn ΔCq ved å trekke referansegenets Cq-verdi fra målgenets Cq-verdi for hver prøve. Beregn ΔΔCq ved å trekke ΔCq fra en kontrollprøve fra ΔCq for hver eksperimentell prøve. Til slutt beregner du 2-ΔΔCq-verdien ved å heve 2 i potensen til ΔΔCq-verdien.
MERK: Cq-verdien representerer syklusnummeret som fluorescenssignalet når den innstilte terskelen.
- For å beregne 2-ΔΔCq-verdien måler du Cq-verdiene for målgenet og referansegenet (GAPDH) i prøvene. Beregn ΔCq ved å trekke referansegenets Cq-verdi fra målgenets Cq-verdi for hver prøve. Beregn ΔΔCq ved å trekke ΔCq fra en kontrollprøve fra ΔCq for hver eksperimentell prøve. Til slutt beregner du 2-ΔΔCq-verdien ved å heve 2 i potensen til ΔΔCq-verdien.
11. Western blot analyse
- Frø 1,2 × 106 tumorceller fra Si-NC og Si-FAM83A grupper til en seks-brønns plate og kultur i 24 timer med eller uten 5 μM cisplatin (DDP) behandling.
- Samle de dyrkede cellene og vask dem med iskald fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne eventuelle gjenværende vekstmedier eller serum. Lyse cellene ved hjelp av RIPA lysis buffer som inneholder fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) for å frigjøre cellulære proteiner. Inkuber cellene på is i noen minutter for å sikre fullstendig lysis og sentrifuge ved 4 °C, 12 000 × g i 15 minutter. Samle supernatanten for å bestemme proteinkonsentrasjonen.
- Bestem proteinkonsentrasjonen i cellelysatet ved hjelp av et BCA Protein Assay Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Bland cellelysatet med en lastbuffer og varm blandingen ved 95-100 °C i 5-10 minutter for å denaturere proteinene og sikre jevn separasjon på gelen.
- Fra hver prøve legger du 30 μg totalt protein på en SDS-PAGE-gel og kjører SDS-PAGE under en konstant spenning på 80 V. Stopp elektroforesen når bromfenolblått når bunnen av separasjonsgelen.
- Overfør de separerte proteinene fra gelen til en polyvinyldifluoridmembran ved hjelp av et våtoverføringssystem på et isbad med en strøm på 200 mA i 1,5 timer.
- Blokker membranen med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann med 0,05% Tween-20 buffer (TBST) i 1 time ved RT og inkuber over natten ved 4 ° C med respektive antistoffer gitt i materialfortegnelsen.
- Vask membranen flere ganger med TBST og inkuber med sekundære antistoffer (materialfortegnelse) i 1 time ved RT, etterfulgt av vask med TBST. Visualiser proteinbåndene ved hjelp av et forbedret kjemiluminescensdeteksjonssett og bildesystem.
12. Statistisk analyse
- Siden alle eksperimentelle datapunkter vil være uavhengige, presenterer du dataene som gjennomsnittet ± SD. Utfør statistisk analyse.
- Bruk enveis variansanalyse (ANOVA) for multiple sammenligninger og Dunnetts test for å sammenligne hver gruppe med kontrollgruppen. Bruk Student t-test (uparede tosidige) for å sammenligne to grupper; anser P < 0,05 for å være signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TCGA-databaseanalyse og PCR-validering
Fra TCGA-databaseanalysen gjennomførte vi en komparativ analyse av mRNA-ekspresjonsnivåer i 306 livmorhalskreftcelleprøver og 13 normale celleprøver for å undersøke differensialuttrykket av FAM83A. FAM83A var oppregulert ved livmorhalskreft, mens uttrykket i normalt livmorhalsvev var ubetydelig (figur 1A). For å få ytterligere innsikt i de prognostiske implikasjonene av FAM83A-uttrykk , utførte vi en Kaplan-Meier-kurveanalyse. Påfallende nok viste pasienter med høyere FAM83A-uttrykk en markant dårligere totaloverlevelse (figur 1B). For å bestemme rollen til FAM83A i livmorhalskreft, undersøkte vi FAM83A-uttrykksnivåer i to livmorhalskreftcellelinjer, HeLa og C33a, samt i en udødeliggjort livmorhalscellelinje, End1 / E6E7. Ved bruk av qRT-PCR observerte vi en signifikant overekspresjon av FAM83A i HeLa- og C33a-cellelinjene sammenlignet med cellelinjen End1/E6E7 (figur 1C). Disse funnene understreker betydningen av FAM83A i sammenheng med livmorhalskreft.
Proliferasjons- og apoptoseeksperimenter for å verifisere den biologiske funksjonen til FAM83A i livmorhalskreft
For å undersøke den funksjonelle rollen til FAM83A i livmorhalskreft, benyttet vi siRNA-mediert knockdown av FAM83A i C33a og HeLa-celler (figur 2A, B). Vi vurderte deretter virkningen av FAM83A-undertrykkelse på celleproliferasjon. EdU-farging viste at redusert ekspresjon av FAM83A signifikant hemmet celleproliferasjon i både C33a- og HeLa-celler (figur 2C-F). Udødelige ondartede celler er assosiert med ekstremt lave apoptosehastigheter10. Derfor ble nivåene av anti- og proapoptotiske proteiner vurdert i kontroll- og si-FAM83A-behandlede livmorhalskreftceller. Western blot-analyser viste at undertrykt ekspresjon av FAM83A økte ekspresjonen av Bax og spaltet caspase3-proteiner (proapoptotiske proteiner), reduserte ekspresjonen av Bcl-2 (antiapoptotisk protein) og økte Cytc-frigjøring (figur 2C-E), noe som stemmer overens med observasjonen at antiapoptotiske proteiner regulerer apoptose ved å blokkere mitokondriell frigjøring av Cytc (figur 2G-J)10. Samlet antydet disse dataene at FAM83A spiller en viktig rolle i regulering av livmorhalskreftcelleproliferasjon og apoptose.
Sårheling og porøse membraninnsatsanalyser for å verifisere den biologiske funksjonen til FAM83A ved livmorhalskreft
Sårheling og membraninnsatsanalyser ble utført for å undersøke effekten av FAM83A-undertrykkelse på migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller. Resultatene viste at livmorhalskreftceller med undertrykt FAM83A-uttrykk migrerte (figur 3A-D) og invaderte (figur 3E-H) mindre effektivt enn kontrollcellene.
Effekter på mitokondriefunksjon og PI3K/AKT signalvei
Gitt rollen til PI3K / AKT i induksjonen av celleapoptose, hadde vi som mål å avgjøre om undertrykkelsen av FAM83A-uttrykk ville hemme den konstitutive fosforyleringen av PI3K / Akt / mTOR-banen i livmorhalskreft. Undertrykkelse av FAM83A hemmet signifikant de viktigste fosforylerte proteinnivåene i PI3K / Akt / mTOR-banen, inkludert p-PI3K, p-Akt og p-mTOR i c333a- og HeLa-celler (figur 4A-D). Mitokondrier er organellene som er ansvarlige for cellulær metabolisme og celleapoptoseinduksjon. Akkumulerende bevis indikerer at kreftcelleapoptose involverer mitokondriell dysfunksjon gjennom den indre mitokondrieveien på grunn av forbedret mitokondriell permeabilitet og frigjøring av proapoptotiske molekyler som Cytc i cytoplasma10. PI3K / AKT-banen kan regulere translokasjonen av Bax inn i mitokondriene, indusere Cytc-frigjøring som respons på apoptotiske stimuli. Derfor er det tenkelig at de onkogene komponentene i PI3K-AKT-signalveien regulerer celleapoptose direkte ved å påvirke mitokondriell oppførsel. Dermed ble det utført en levende celle mitokondriell permeabilitetspore (mPTP) analyse for å bestemme mitokondriell status. mPTP-åpning er assosiert med apoptotisk og nekrotisk celledød11. I denne analysen beholdes et grønt fluorescerende fargestoff (calcein AM) i cytoplasma og mitokondrier når mPTP er lukket, mens fargestoffet i cytoplasmaet slukkes av CoCl2, og etterlater bare den intensive fluorescensen i mitokondriene. Resultatene viste at cellepopulasjoner med intens grønn fluorescens i mitokondriene ble redusert betydelig etter FAM83A-undertrykkelse, noe som indikerer en åpnet mPTP (figur 4E, F). Videre undersøkte vi endringene i mitokondriemembranpotensialet (ΔΨm) ved bruk av JC-1-farging. JC-1 danner aggregater (rød fluorescens) i levende celler som inneholder intakte mitokondrier med høyt membranpotensial og monomerer (grønn fluorescens) under lav MMP i apoptotiske celler. FAM83A-suppresjon reduserte gradvis MMP (figur 4G).
Resistensanalyse for spredning og invasjon
Cisplatin (DDP)-basert kjemoterapi er en standard behandlingsstrategi for livmorhalskreft. Imidlertid er kjemoresistens fortsatt en utfordring. Vi undersøkte rollen til FAM83A i behandling av livmorhalskreft ved bruk av cisplatin. Kontroll-, si-NC-behandlede og si-FAM83A-behandlede HeLa-celler ble behandlet med eller uten 5 μM cisplatin12. Videre ble effekten av FAM83A-undertrykkelse på cellens levedyktighet vurdert. DDP induserte en mer signifikant hemmende effekt på proliferasjonen av HeLa-celler etter FAM83A-undertrykkelse , sammenlignet med bare DDP-behandling (figur 5A og figur 5C). Etter behandling av livmorhalskreftceller med 5 μM cisplatin, hemmet FAM83A-undertrykkelse også celleinvasjon (figur 5B og figur 5D).
Medikamentell følsomhetsanalyse for mitokondriell funksjon
Ved å behandle Si-NC-behandlede og si-FAM83A-behandlede HeLa-celler med eller uten 5 μM cisplatin (DDP), evaluerte vi mitokondriemembranpotensialet (MMP) og vurderte mitokondrieskaden forårsaket av celledød ved bruk av JC-1-farging. DDP induserte mer mitokondriell skade som vist ved en reduksjon i JC-1 monomerprosent etter FAM83A knockdown, sammenlignet med bare DDP-behandling (figur 6A og figur 6D). Etter behandling av livmorhalskreftceller med 5 μM cisplatin, hemmet FAM83A knockdown også kolonidannelse (figur 6B og figur 6E) og forbedret celleapoptose (figur 6C og figur 6F). I tillegg økte FAM83A knockdown i nærvær av DDP markant ekspresjonen av proapoptotiske proteiner, Bax og spaltet caspase3, fremmet Cytc-frigjøring og reduserte Bcl-2-uttrykk (figur 6G,H). Disse resultatene indikerte at FAM83A knockdown sensibiliserte livmorhalskreftceller til DDP via apoptoseinduksjon.
Figur 1 FAM83A overekspresjon i livmorhalskreftceller og sammenheng med dårligere prognose. (A) Boxplot-analyse av mRNA-nivåene av FAM83A i livmorhalskreftprøver. (B) Kaplan-Meier-analyse av FAM83A-uttrykk for bestemmelse av total overlevelse hos pasienter med livmorhalskreft. (C) Relative mRNA-nivåer av FAM83A i livmorhalskreftcellelinjer HeLa og C33a og human udødeliggjort livmorhalscellelinje End1 / E6E7. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. *P < 0,05, sammenlignet med End1/E6E7-celler som bruker enveis ANOVA. Forkortelser: CESE = Cervikal plateepitelkarsinom og endocervikal adenokarsinom; HR = hasardratio. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av suppresjon av FAM83A på spredning og apoptose av livmorhalskreft. C33a- og HeLa-celler ble transfeksjonert med FAM83A-spesifikke siRNAer. (A,B) mRNA-nivåer av FAM83A ble vurdert i cellelinjer for livmorhalskreft ved bruk av qRT-PCR.Celleproliferasjon i (C) C33a og (D) HeLa-celler ble bestemt ved bruk av EdU-analysen. (E,F) EDU-fluorescensbildene av C33a- og Hela-celler. (VG Nett) Western blot-analyse for å undersøke nivåene av apoptoserelaterte proteiner, inkludert Cytc, Bcl-2, Bax, caspase3 og spaltet-caspase-3; GAPDH ble brukt som lastekontroll. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, sammenlignet med kontrollceller som bruker enveis ANOVA. Forkortelser: NC = negativ kontroll; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyuridin; CytC = cytokrom C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av FAM83A på migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller in vitro. (A-D) Sårhelingsanalyse ble utført for å vurdere cellemigrasjon. Bildene ble tatt ved 0, 24 og 48 timer. (E-H) Transwell-analyser ble utført for å undersøke celleinvasjon. Skalastenger = 100 μm (E,F). Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. *P < 0,05; **P < 0,01; **P < 0,001, sammenlignet med kontrollceller som bruker enveis ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekt av FAM83A-suppresjon på PI3K/AKT/mTOR-banen og mitokondriefunksjonen. (AD) Western blot-analyse for å bestemme nivåene av proteiner fra PI3K / AKT / mTOR-banen i C33a- og HeLa-celler etter FAM83A-undertrykkelse. (E-H) Mitokondriell membranpotensialanalyse ved bruk av JC-1-farging. JC-1 aggregater ble farget i rødt, og JC-1 monomerer ble farget i grønt som indikerer en lavere MMP. (I,J) Mitokondriell permeabilitet ble vurdert med mPTP-sett og flowcytometri. Skalastenger = 50 μm (E, F). Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. * P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, sammenlignet med kontrollceller som bruker enveis ANOVA. Forkortelser: MMP = mitokondriemembranpotensial; mPTP = mitokondriell permeabilitet overgangspore. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekter av FAM83A-undertrykkelse på DDP-hemming på celleproliferasjon og invasjon av livmorhalskreftceller. HeLa-celler ble transfeksjonert med si-NC eller si-FAM83A og behandlet med eller uten 5 μM DDP. (A,C) Effekt av DDP på celleproliferasjonen i kontroll, si-NC-behandlede og si-FAM83-behandlede HeLa-celler. (B,D) Effekt av DDP på celleinvasjonen i kontroll, si-NC-behandlede og si-FAM83-behandlede HeLa-celler. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. * P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, sammenlignet med kontrollcellene. &&P < 0,01; &&P < 0,001, sammenlignet med DDP ved bruk av enveis ANOVA. Forkortelser: DDP = diamindikloroplatinum; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Effekter av FAM83A-undertrykkelse på effekten av DDP på apoptose i livmorhalskreftceller. HeLa-celler ble transfeksjonert med si-NC eller si-FAM83A og behandlet med eller uten 5 μM DDP. (A,D) MMP-analyse ved bruk av JC-1-farging. (B,E) Kloning av plater. (C,F) Flowcytometri påviser apoptoserater i ulike behandlingsgrupper. (G,H) Western blot analyse av mitokondrier-relaterte apoptotiske proteiner, inkludert Bcl-2, Bax, Cytc, og nedstrøms spaltet caspase-3. GAPDH ble brukt som lastekontroll. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. * P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001, sammenlignet med kontrollcellene. &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001, sammenlignet med DDP ved bruk av enveis ANOVA. Forkortelser: DDP = diamindikloroplatinum; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyuridin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: siRNA, qRTPCR-primere og qRT-PCR-reaksjonsoppsettet som ble brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøkelsen av tumormålgener er av største betydning for både forebygging og behandling av livmorhalskreft. Å forstå de spesifikke genene som spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av livmorhalskreft gir verdifull innsikt i de underliggende molekylære mekanismene til sykdommen. Videre kan identifisering av disse målgenene føre til utvikling av nye terapeutiske strategier og målrettede terapier. I denne studien beskriver vi bruken av TCGA-datasettanalyse for å identifisere FAM83A som et målgen og undersøke dets mekanistiske roller i livmorhalskreft. Vi observerer et signifikant høyt uttrykk av FAM83A i livmorhalskreftceller, noe som er forbundet med dårlig prognose hos pasienter med livmorhalskreft. En serie cellebaserte eksperimenter avslørte høyt FAM83A-uttrykk i livmorhalskreftceller, som spiller en kritisk rolle i regulering av celleproliferasjon, migrasjon og invasjon. Undertrykkelse av FAM83A-uttrykk hemmet spredning og migrasjon og fremmet apoptose i livmorhalskreftceller.
Konstruksjon av FAM83A-knockdown livmorhalskreftcellelinjer er det mest kritiske trinnet i denne studien. siRNA er designet og validert i henhold til målgensekvensene for å sikre effektiviteten. Videre transfekderes cellelinjene for livmorhalskreft ved hjelp av siRNA. Suksessraten for plasmidtransfeksjon er avgjørende for etterfølgende eksperimenter, som krever streng kontroll av celletetthet og plasmidtetthet. Videre observeres transfeksjonseffektiviteten under et fluorescensmikroskop for å sikre at etterfølgende eksperimenter kan utføres. Western blotting og qRT-PCR-resultater bekrefter at inhiberingen av FAM83A undertrykte PI3K/AKT-banen og induserte mitokondriell dysfunksjon. Vi antar at mekanismen innebærer inhibering av translokasjonen av Bax fra cytoplasma til mitokondriene ved PI3K/AKT, som fremmer celleoverlevelse13.
Fremskritt i behandlingen av livmorhalskreft har gjort det mulig å utvikle nye målmolekyler. Identifiseringen av et nytt onkogen kan brukes terapeutisk for å forbedre den kliniske prognosen for livmorhalskrefter14,15. I denne studien konstruerte vi vellykket et FAM83A knockdown-system i HeLa- og C33a-celler og verifiserte effekten av FAM83A-knockdown på livmorhalskreftceller på mobilnivå. Vi foreslår at hemming av FAM83A kan brukes til å behandle livmorhalskreft.
Denne studien har imidlertid noen begrensninger. For det første utfører denne studien bare genscreening gjennom databasen og mangler patologiske data fra kliniske pasienter. For det andre har denne studien kun validert effekten in vitro, og ytterligere in vivo studier var nødvendig for å verifisere resultatene. Likevel kan metodene for målgenidentifikasjon, genknockout og cellulær validering for å identifisere målrettede terapeutiske loci utarbeidet i denne studien, gi forskningsideer for oppdagelse og validering av målgener for andre sykdommer.
Oppsummert var FAM83A overuttrykt og korrelert med dårligere prognose ved livmorhalskreft. FAM83A regulerer spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller. Suppresjon av FAM83A-indusert mitokondriell dysfunksjon og apoptose, sensibiliserende livmorhalskreftceller til cisplatin. Disse resultatene indikerte at FAM83A er et egnet forskningsmål for behandling av livmorhalskreft. Denne studien bidro til fremskrittene innen adjuvant kjemoterapi med sikte på å forbedre prognosen for pasienter med livmorhalskreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter i dette arbeidet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (nr. 2020HC06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L.
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L.
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
