Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ضربة قاضية من FAM83A للتحقق من دورها في نمو خلايا سرطان عنق الرحم وحساسية سيسبلاتين

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65667
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نعرض إجراءات ضربة قاضية FAM83A ؛ المقايسات للكشف عن آثاره على انتشار خلايا سرطان عنق الرحم وهجرتها وغزوها ؛ وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. توفر هذه الدراسة جينا مستهدفا واعدا لسرطان عنق الرحم ومرجعا لمزيد من أبحاث الأدوية.

Abstract

يحمل استكشاف الجينات المستهدفة للورم أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. في هذه الدراسة ، نوضح الخطوات المتضمنة في تحديد الجين المستهدف للورم FAM83A في سرطان عنق الرحم. أولا ، تم استخدام مجموعة بيانات أطلس جينوم السرطان للتحقق من صحة التعبير والأهمية النذير ل FAM83A لدى النساء. تم استخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لضربة قاضية لجين FAM83A في خلايا HeLa و C33a . بعد ذلك ، تم إجراء تلطيخ 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) لتحديد التأثيرات على قدرات تكاثر الخلايا السرطانية. تم إجراء التئام الجروح وفحوصات إدخال الغشاء المسامي لتقييم هجرة الخلايا السرطانية وقدرات الغزو.

تم استخدام النشاف الغربي لتحديد مستويات البروتين المرتبطة بموت الخلايا المبرمج. تم استخدام تلطيخ JC-1 لتقييم تغيرات وظيفة الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، تم استخدام تدخل سيسبلاتين (ديامينيدي كلوروبلاتين ، DDP) لتقييم الإمكانات العلاجية للجين المستهدف. تم إجراء قياس التدفق الخلوي وفحوصات تكوين المستعمرات لمزيد من التحقق من صحة الخصائص المضادة للسرطان للجين. نتيجة لذلك ، تبين أن ضربة قاضية FAM83A تمنع انتشار وهجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. تتحقق هذه المنهجيات الشاملة بشكل جماعي من صحة FAM83A كجين مستهدف مرتبط بالورم ، مما يبشر بالخير كهدف علاجي محتمل في الوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه.

Introduction

يعد سرطان عنق الرحم مصدر قلق عالمي لأنه أحد الأنواع الرائدة في الأورام الخبيثة النسائية في جميع أنحاء العالم وهو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لدى النساء1. ترتبط الجراحة الجذرية والعلاج الكيميائي الإشعاعي بمعدلات شفاء عالية في المرحلة الأولية. ومع ذلك ، فإن نتائج العلاج للمرضى في المرحلة المتقدمة من سرطان عنق الرحم الذين يصابون بمرض نقيلي غير مواتية للغاية2. لذلك ، من الأهمية بمكان زيادة فهم الآليات البيولوجية الكامنة وراء هجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة للوقاية من هذا المرض وعلاجه.

إن تحديد الجينات المستهدفة المشاركة في تطور السرطان وإيجاد طرق لتثبيط تعبيرها أو عملها يمثل خيارات علاجية واعدة. في هذه الدراسة ، حددنا FAM83 كجين مسبب للسرطان وحققنا في آثاره المثبطة على خلايا C33a و HeLa. تم الإبلاغ عن الجينات المسرطنة لعائلة FAM83 (FAM83A-H) على نطاق واسع في السرطانات البشرية 3,4. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أن FAM83A يتم تنظيمه في سرطان الرئة5 والثدي6 والمبيض7 والبنكرياس8 ، مما يشير إلى أن FAM83A يلعب دورا مهما في تطور السرطان من خلال تعزيز الانتشار والغزو والسمات الشبيهة بالخلايا الجذعية ومقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية. الأهم من ذلك ، تم تحديد FAM83A كواحد من الجينات المرشحة الجديدة المرتبطة بتطور آفة عنق الرحم والتسرطن9. على الرغم من تأكيد ارتفاع تعبير FAM83A في خلايا سرطان عنق الرحم البشرية ، إلا أن التأثير المحدد والآليات الأساسية ل FAM83A في سرطان عنق الرحم لا تزال غير واضحة.

في هذه الدراسة ، نحدد البروتوكولات المشاركة في تحديد FAM83A كجين مستهدف للورم في سرطان عنق الرحم واستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لضربة قاضية لجين FAM83A في خلايا HeLa و C33a . تم إجراء تلطيخ 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) لتحديد التأثيرات على تكاثر الخلايا السرطانية ، بينما ساعد التئام الجروح وفحوصات إدخال الغشاء المسامي في تقييم هجرة الخلايا السرطانية وقدرات الغزو.

تم إجراء النشاف الغربي لتحديد مستويات البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج ، وتم استخدام تلطيخ JC-1 لتقييم تغيرات وظيفة الميتوكوندريا. وهكذا ، أبلغنا أن FAM83A يلعب دورا مهما في تكاثر الخلايا ، ورم خبيث ، وغزو في سرطان عنق الرحم. من خلال خلل الميتوكوندريا المرتبط بمسار PI3K / AKT وموت الخلايا المبرمج ، قامت FAM83A بالضربة القاضية بتوعية خلايا سرطان عنق الرحم بالسيسبلاتين (ديامينيدي كلوروبلاتين ، DDP). توفر هذه الدراسة هدفا جديدا لسرطان عنق الرحم وربما سرطانات أخرى ومرجعا لتطوير استراتيجيات للتغلب على مقاومة الخلايا السرطانية لبعض أدوية العلاج الكيميائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت الدراسة متوافقة تماما مع المبادئ التوجيهية للنشر التي قدمتها اللجنة (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحليل مصدر البيانات والمعلوماتية الحيوية

  1. احصل على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) للتحليل العنقودي. استخدم GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) ، وهي أداة قائمة على الويب لإعادة حساب بيانات RNA-Seq الخام للعينات من مشاريع TCGA ، لفحص أهداف أدوية السرطان المرشحة باستخدام خط أنابيب معالجة قياسي.
    ملاحظة: موقع GEPIA متاح مجانا لجميع المستخدمين.
  2. قم بالوصول إلى الصفحة الرئيسية لموقع GEPIA وانقر فوق تحليل نوع السرطان ، وحدد خيار تحليل الجينات التفاضلية ، وقم بتعيين المعلمات التالية: اسم السرطان = CESE (يعرف بأنه سرطان الخلايا الحرشفية العنقية وسرطان غدي باطن عنق الرحم على صفحة الويب هذه) ، |لوج 2 إف سي | القطع = 1 ، قطع قيمة q = 0.01 ، الطرق التفاضلية = ANOVA ، وتوزيع الكروموسومات = كلاهما. ثم ، انقر فوق قائمة للحصول على قائمة الجينات التي تظهر التعبير التفاضلي بين الورم والمجموعات الطبيعية.
    ملاحظة: يتطلب مراجعة شاملة للأدبيات لتحديد الجينات المرشحة المعبر عنها بشكل تفاضلي. في هذه الدراسة ، بالنظر إلى الخلفية من الأدبيات المتاحة ، نركز على جين الورم محل الاهتمام ، FAM83A.
  3. بعد ذلك ، افحص تعبير FAM83A في سرطان عنق الرحم والأنسجة الطبيعية باستخدام GEPIA من خلال المتابعة إلى خيار التعبير DIY على موقع الويب وحدد Boxplot كنوع المخطط. أدخل FAM83A في حقل معلمة الجينات وقم بتعيين المعلمات التالية: |لوج 2 إف سي | قيمة القطع = 1 ؛ قطع قيمة q = 0.01. حدد CESE كاسم السرطان ومطابقة بيانات TCGA العادية لحقل البيانات العادية المتطابقة ، مع ترك جميع الإعدادات الأخرى في وضعها الافتراضي. انقر فوق Plot واسمح لموقع الويب بإنشاء boxplot يمثل التعبير التفاضلي للجين FAM83A ؛ احفظ مخطط الصندوق للرجوع إليه وتحليله في المستقبل.
  4. أخيرا ، قم بتحليل البقاء على قيد الحياة بشكل عام للمرضى الذين يحملون أوراما بمستويات مختلفة من تعبير FAM83A في سرطان عنق الرحم. انتقل إلى خيار مؤامرات البقاء على قيد الحياة على موقع الويب ، واضبط الجين على FAM83A ، وحدد البقاء على قيد الحياة بشكل عام كنوع التحليل. أضف اسم الورم CESE ، واختر الأشهر لوحدات المحور ، واترك جميع المعلمات الأخرى في إعداداتها الافتراضية. انقر فوق رسم ودع موقع الويب ينشئ مخطط منحنى البقاء على قيد الحياة ؛ احفظ هذا المخطط للرجوع إليه وتحليله في المستقبل.
  5. ضع في اعتبارك كلا من التعبير التفاضلي ل FAM83A في الأورام وارتباطه بتحليل بقاء المريض لتحديد FAM83A كجين مستهدف علاجي محتمل في سرطان عنق الرحم.

2. التجارب القائمة على الخلايا

  1. زراعة الخلايا
    1. زراعة خطوط الخلايا السرطانية البشرية في الوسط المعدل عند 37 درجة مئوية في جو CO2 مرطب بنسبة 5٪.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على معلومات خط الخلية ومكونات وسيط الثقافة.
  2. نقل الخلايا
    1. استخدم siRNA لهدم تعبير FAM83A في الخلايا.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على تسلسل siRNA المحدد.
    2. خلايا البذور في ألواح 6 آبار وتحتضن بمزيج من 50 نانومتر si-FAM83A أو siRNA-NC و 8 ميكرولتر من عامل النقل أو 8 ميكرولتر فقط من عامل النقل لمدة 4-6 ساعات بعد تحقيق التقاء 50٪ -70٪. أضف فقط DMEM الخالي من المصل إلى عنصر التحكم السلبي.
    3. بعد الحضانة ، استبدل الوسط الذي يحتوي على عامل النقل ب DMEM + 10٪ مصل عجل الجنين. علاوة على ذلك ، بعد 48 ساعة من النقل ، تعامل مع 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP) لمدة 24 ساعة على النحو المنشود واحصد جميع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي وتحليل qRT-PCR.

3. كشف EdU لمقايسة تكاثر الخلايا

ملاحظة: استخدم مجموعة تكاثر خلايا EdU لتقييم تكاثر الخلايا في المختبر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

  1. بذر الخلايا في ألواح 6 آبار واحتضانها بمحلول 10 ميكرومتر EdU لمدة 2 ساعة. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) وتخلل مع 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق في RT.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية وأضف 500 ميكرولتر من محلول تفاعل 1x. ثم احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام للتلطيخ النووي.
  3. قم بتلطيخ الخلايا باستخدام 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وتصورها تحت مجهر مضان بتكبير 200x. قم بتلطيخ نوى الخلايا المتكاثرة باستخدام EdU وافحصها بحثا عن مضان أحمر.
  4. أخيرا ، استخدم برنامجا لتحديد النتائج عن طريق حساب 10 حقول عشوائية على الأقل وحساب معدلات الانتشار باستخدام نسبة الخلايا الإيجابية الفلورية إلى إجمالي الخلايا.

4. فحص التئام الجروح

  1. خلايا البذور في 6 لوحات الآبار بكثافة 2 × 105 خلايا لكل بئر.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ ، استخدم طرف ماصة معقم سعة 10 ميكرولتر لإنشاء خدش خطي برفق في الطبقة الأحادية للخلية. اشطف الآبار برفق باستخدام برنامج تلفزيوني معقم لإزالة أي خلايا منفصلة وحطام ناتج عن الخدش.
  3. علاوة على ذلك ، احتضان الخلايا في وسط يحتوي على 1 ٪ FBS. بعد ذلك ، راقب والتقط صورا باستخدام المجهر المقلوب لشفاء المنطقة المصابة في 12 و 24 و 48 ساعة.

5. فحص إدراج الغشاء المسامي

  1. تحضير معلق الخلية في وسط زراعة الخلايا عند تركيز الخلية المطلوب (يحتوي على 4 × 104 خلايا) ، بما في ذلك خلايا C33a المنقولة أو الضابطة و HeLa. أضف تعليق الخلية إلى الغرفة العلوية لإدراج الغشاء ، مما يضمن التوزيع المتساوي. أضف وسيطا كاملا إلى الغرفة السفلية.
  2. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، استخدم كحول الميثيل و 0.1٪ من البنفسج البلوري لتثبيت وتلطيخ الخلايا المهاجرة إلى الغرف السفلية ، على التوالي.
  3. استخدم مجهرا مقلوبا لالتقاط الصور ثم تحليل عدد الخلايا المهاجرة عن طريق حساب 10 حقول عشوائية على الأقل باستخدام ImageJ.
    1. لتحليل الأرقام باستخدام ImageJ ، افتح الصورة في برنامج ImageJ ، وانتقل إلى علامة التبويب Image في قائمة الأدوات ، وحدد ضبط ، ثم انقر فوق العتبة. اضبط إعدادات العتبة، إذا لزم الأمر، حتى تصبح الخلايا فقط مرئية على خلفية بيضاء.
    2. انقر فوق تطبيق في نافذة العتبة لتطبيق هذه الإعدادات على الصورة. الآن ، حدد أداة العصا (التتبع) من شريط الأدوات (الموجود أعلى النافذة).
    3. انقر فوق منطقة الصورة حيث توجد الخلايا لتحديد جميع الخلايا في الصورة ذات العتبة. بعد تمييز الخلايا ، انتقل إلى تحليل في قائمة الأدوات ، ثم انقر فوق تحليل الجسيمات. في نافذة تحليل الجسيمات ، أدخل الحجم المطلوب (على سبيل المثال ، 0 - ما لا نهاية) والقيم الدائرية (على سبيل المثال ، 0.00 - 1.00) وفقا للمتطلبات التجريبية لتضمين جميع الخلايا في العد.
    4. انقر فوق "موافق " وانتظر حتى يقوم البرنامج بحساب الخلايا وظهور نافذة جديدة مع نتائج التحليل.

6. مقايسة تشكيل مستعمرة

  1. البذور 2 × 105 خلايا لكل بئر من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة 6 آبار مع أو بدون معالجة 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP) لمدة 24 ساعة.
  2. بعد فترة 24 ساعة من العلاج الدوائي ، افصل الخلايا باستخدام 0.25٪ من التربسين وأعد تعليقها في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ FBS. قم بزرع الخلايا المعاد تعليقها في صفيحة من 6 آبار بكثافة 1 × 103 خلايا لكل بئر ، ثم احتضانها في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة لمدة ~ 7-10 أيام عندما تكون المستعمرات مرئية ، ثبت الخلايا ب 4٪ Polyoxymethylene وقم بتلطيخها بمحلول تلطيخ Giemsa لمدة 20 دقيقة.
  4. اغسل الخلايا قليلا واترك الألواح تجف في الهواء. التقط صورا لمجموعات المستعمرات بالمجهر واحسب عدد المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 50 خلية.

7. تحليل إزالة استقطاب غشاء الميتوكوندريا (MMP) باستخدام صبغة JC-1

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. احتضان مع 1x JC-1 محلول تلطيخ لمدة 15-20 دقيقة تحت 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية باستخدام مجموعة مقايسة غشاء الميتوكوندريا المحتملة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. اغسل الخلايا وافحصها تحت مجهر الفلورسنت عند تكبير 200x باستخدام الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث ل JC-1 عند ~ 490 نانومتر و 590 نانومتر ، على التوالي. لتصور مضان JC-1 ، استخدم المرشحات المناسبة ، مثل مرشح الإثارة الأزرق (450-490 نانومتر) ومرشح الانبعاث الأحمر (التمرير الطويل > 590 نانومتر) لالتقاط إشارة التألق المنبعثة بشكل انتقائي.

8. تحليل التدفق الخلوي ل mPTP

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. قم بإزالة وسط الاستزراع من الخلايا ، وأعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني ، وأضف 300 ميكرولتر لكل (حجم 1x) من محلول تلطيخ Calcein AM ومحلول عمل التبريد الفلوري لتغطية الخلايا بالتساوي. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة محمية من الضوء لمدة 30-45 دقيقة ، واستبدل الوسط بوسط استزراع مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة إضافية لضمان التحلل المائي الكامل للكالسيين AM بواسطة استرات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى توليد كالسيين الفلورسنت الأخضر داخل الخلايا.
  3. قم بإزالة وسط الثقافة ، واغسل الخلايا 2-3x باستخدام PBS ، وأضف المخزن المؤقت للكشف. كشف mPTP الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي وطول موجة الإثارة 488 نانومتر.

9. قياس التدفق الخلوي

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. بعد 24 ساعة من العلاج الدوائي ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول عازلة ملزم واخلط بلطف 10 ميكرولتر من Annexin V-FITC و 5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم (PI) في تعليق الخلية. احتضن الخليط لمدة 15 دقيقة مع تجنب الضوء وأضف 300 ميكرولتر من محلول عازلة ملزمة إلى الخلايا. كشف موت الخلايا المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر.

10. تحليل RT-PCR

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا السرطانية باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وتحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) مع مزيج تخليق الحمض النووي المكمل عن طريق الحضانة عند 42 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. تحضير خليط تفاعل تفاعل PCR الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي والنيوكليوتيدات والمخزن المؤقت والبادئات المصممة الخاصة بالجينات. أضف قالب cDNA إلى خليط التفاعل لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي مع ظروف الدورة الحرارية التالية: تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ومرحلة منحنى الانصهار عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. تحديد مستويات mRNA باستخدام طريقة 2−ΔΔCq باستخدام GAPDH كعنصر تحكم داخلي.
    ملاحظة: يظهر نظام تفاعل RT-PCR في الجدول 1 ، ويظهر تسلسل التمهيدي في الجدول 1.
    1. لحساب قيمة 2−ΔΔCq ، قم بقياس قيم Cq للجين المستهدف والجين المرجعي (GAPDH) في العينات. احسب ΔCq عن طريق طرح قيمة Cq للجين المرجعي من قيمة Cq للجين المستهدف لكل عينة. احسب ΔΔCq بطرح ΔCq لعينة تحكم من ΔCq لكل عينة تجريبية. أخيرا ، احسب قيمة 2−ΔΔCq عن طريق رفع 2 إلى قوة قيمة ΔΔCq.
      ملاحظة: تمثل قيمة Cq رقم الدورة الذي تصل عنده إشارة التألق إلى الحد المحدد.

11. تحليل اللطخة الغربية

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. اجمع الخلايا المستزرعة واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) لإزالة أي وسائط نمو متبقية أو مصل. تحلل الخلايا باستخدام RIPA Lysis Buffer الذي يحتوي على فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) لإطلاق البروتينات الخلوية. احتضان الخلايا على الجليد لبضع دقائق لضمان التحلل الكامل والطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 12000 × جم لمدة 15 دقيقة. جمع طاف لتحديد تركيز البروتين.
  3. حدد تركيز البروتين في الخلية المحللة باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. امزج الخلية المحللة مع مخزن مؤقت للتحميل وقم بتسخين الخليط على حرارة 95-100 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق لتشويه البروتينات وضمان فصل موحد على الجل.
  4. من كل عينة ، قم بتحميل 30 ميكروغرام من البروتين الكلي على هلام SDS-PAGE وقم بتشغيل SDS-PAGE تحت جهد ثابت يبلغ 80 فولت. أوقف الرحلان الكهربائي عندما يصل بروموفينول الأزرق إلى قاع هلام الفصل.
  5. انقل البروتينات المنفصلة من الجل إلى غشاء بولي فينيل ثنائي فلوريد باستخدام نظام نقل رطب في حمام جليدي بتيار 200 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة.
  6. سد الغشاء مع 5٪ حليب منزوع الدسم في محلول ملحي مخزن تريس مع 0.05٪ Tween-20 buffer (TBST) لمدة 1 ساعة في RT واحتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة ذات الصلة الواردة في جدول المواد.
  7. اغسل الغشاء عدة مرات باستخدام TBST واحتضانه بالأجسام المضادة الثانوية (جدول المواد) لمدة 1 ساعة في RT ، متبوعا بالغسيل باستخدام TBST. تصور نطاقات البروتين باستخدام مجموعة اكتشاف التلألؤ الكيميائي المحسنة ونظام التصوير.

12. التحليل الإحصائي

  1. نظرا لأن جميع نقاط البيانات التجريبية ستكون مستقلة ، قدم البيانات كمتوسط ± SD. إجراء التحليل الإحصائي.
  2. استخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لإجراء مقارنات متعددة واختبار Dunnett لمقارنة كل مجموعة بالمجموعة الضابطة. استخدم اختبار t للطالب (ثنائي الذيل غير المزدوج) لمقارنة مجموعتين ؛ اعتبر P < 0.05 مهما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل قاعدة بيانات TCGA والتحقق من صحة PCR

من تحليل قاعدة بيانات TCGA ، أجرينا تحليلا مقارنا لمستويات تعبير mRNA في 306 عينة من خلايا سرطان عنق الرحم و 13 عينة من الخلايا الطبيعية للتحقيق في التعبير التفاضلي ل FAM83A. تم تنظيم FAM83A في سرطان عنق الرحم ، بينما كان تعبيره في أنسجة عنق الرحم الطبيعية ضئيلا (الشكل 1 أ). للحصول على مزيد من الأفكار حول الآثار النذير لتعبير FAM83A ، أجرينا تحليل منحنى كابلان ماير. ومن اللافت للنظر أن المرضى الذين لديهم تعبير FAM83A أعلى أظهروا بقاء أسوأ بشكل ملحوظ (الشكل 1 ب). لتحديد دور FAM83A في سرطان عنق الرحم ، قمنا بفحص مستويات تعبير FAM83A في خطين من خلايا سرطان عنق الرحم ، HeLa و C33a ، وكذلك في خط خلايا عنق الرحم الخالد ، End1 / E6E7. باستخدام qRT-PCR ، لاحظنا تعبيرا مفرطا كبيرا عن FAM83A في خطوط خلايا HeLa و C33a مقارنة بخط خلية End1 / E6E7 (الشكل 1C). تؤكد هذه النتائج على أهمية FAM83A في سياق سرطان عنق الرحم.

تجارب الانتشار وموت الخلايا المبرمج للتحقق من الوظيفة البيولوجية ل FAM83A في سرطان عنق الرحم

للتحقيق في الدور الوظيفي ل FAM83A في سرطان عنق الرحم ، استخدمنا ضربة قاضية بوساطة siRNA ل FAM83A في خلايا C33a و HeLa (الشكل 2A ، B). ثم قمنا بتقييم تأثير قمع FAM83A على تكاثر الخلايا. كشف تلطيخ EdU أن انخفاض التعبير عن FAM83A يثبط بشكل كبير تكاثر الخلايا في كل من خلايا C33a و HeLa (الشكل 2C-F). ترتبط الخلايا الخبيثة الخالدة بمعدلات موت الخلايا المبرمج المنخفضة للغاية10. لذلك ، تم تقييم مستويات البروتينات المضادة و proapoptotic في السيطرة وخلايا سرطان عنق الرحم المعالجة si-FAM83A. كشفت تحليلات اللطخة الغربية أن التعبير المكبوت ل FAM83A زاد من التعبير عن باكس وبروتينات الكاسباز 3 المشقوقة (بروتينات proapoptotic ) ، وقلل من التعبير عن Bcl-2 (بروتين مضاد لموت الخلايا المبرمج) ، وزاد من إطلاق Cytc (الشكل 2C-E) ، وهو ما يتوافق مع ملاحظة أن البروتينات المضادة لموت الخلايا المبرمج تنظم موت الخلايا المبرمج عن طريق منع إطلاق الميتوكوندريا ل Cytc (الشكل 2G-J)10. بشكل جماعي ، اقترحت هذه البيانات أن FAM83A يلعب دورا مهما في تنظيم تكاثر خلايا سرطان عنق الرحم وموت الخلايا المبرمج.

فحوصات التئام الجروح وإدخال الغشاء المسامي للتحقق من الوظيفة البيولوجية ل FAM83A في سرطان عنق الرحم

تم إجراء فحوصات التئام الجروح وإدخال الغشاء لاستكشاف آثار قمع FAM83A على هجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم. كشفت النتائج أن خلايا سرطان عنق الرحم ذات تعبير FAM83A المكبوت هاجرت (الشكل 3A-D) وغزت (الشكل 3E-H) بكفاءة أقل من الخلايا الضابطة.

التأثيرات على وظيفة الميتوكوندريا ومسار إشارات PI3K / AKT

بالنظر إلى دور PI3K / AKT في تحريض موت الخلايا المبرمج ، كنا نهدف إلى تحديد ما إذا كان قمع تعبير FAM83A سيمنع الفسفرة التأسيسية لمسار PI3K / Akt / mTOR في سرطان عنق الرحم. أدى قمع FAM83A إلى تثبيط مستويات البروتين المفسفرة الرئيسية بشكل كبير في مسار PI3K / Akt / mTOR بما في ذلك p-PI3K و p-Akt و p-mTOR في خلايا c333a و HeLa (الشكل 4A-D). الميتوكوندريا هي العضيات المسؤولة عن التمثيل الغذائي الخلوي وتحريض موت الخلايا المبرمج. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية ينطوي على خلل وظيفي في الميتوكوندريا من خلال مسار الميتوكوندريا الداخلي بسبب نفاذية الميتوكوندريا المحسنة وإطلاق جزيئات proapoptotic مثل Cytc في السيتوبلازم10. يمكن لمسار PI3K / AKT تنظيم نقل Bax إلى الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى إطلاق Cytc استجابة لمحفزات موت الخلايا المبرمج. لذلك ، من المتصور أن المكونات المسرطنة لمسار إشارات PI3K-AKT تنظم موت الخلايا المبرمج مباشرة من خلال التأثير على سلوك الميتوكوندريا. وهكذا ، تم إجراء اختبار انتقال نفاذية الميتوكوندريا للخلايا الحية (mPTP) لتحديد حالة الميتوكوندريا. يرتبط فتح mPTP بموت الخلايا المبرمج والميت11. في هذا الفحص ، يتم الاحتفاظ بصبغة الفلورسنت الخضراء (calcein AM) في السيتوبلازم والميتوكوندريا عند إغلاق mPTP ، بينما يتم إخماد الصبغة الموجودة في السيتوبلازم بواسطة CoCl2 ، تاركة فقط التألق المكثف في الميتوكوندريا. كشفت النتائج أن مجموعات الخلايا ذات التألق الأخضر المكثف في الميتوكوندريا انخفضت بشكل ملحوظ بعد قمع FAM83A ، مما يشير إلى فتح mPTP (الشكل 4E ، F). علاوة على ذلك ، قمنا بفحص التغيرات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) باستخدام تلطيخ JC-1. يشكل JC-1 مجاميع (مضان أحمر) في الخلايا الحية التي تحتوي على الميتوكوندريا السليمة ذات إمكانات غشائية عالية ومونومرات (مضان أخضر) تحت MMP منخفض في خلايا موت الخلايا المبرمج. انخفض قمع FAM83A تدريجيا MMP (الشكل 4G).

تحليل قابلية المخدرات للانتشار والغزو

العلاج الكيميائي القائم على سيسبلاتين (DDP) هو استراتيجية علاج قياسية لسرطان عنق الرحم. ومع ذلك ، لا تزال المقاومة الكيميائية تشكل تحديا. قمنا بالتحقيق في دور FAM83A في علاج سرطان عنق الرحم باستخدام سيسبلاتين. تم علاج خلايا HeLa الضابطة والمعالجة ب si-NC و si-FAM83A مع أو بدون 5 ميكرومتر سيسبلاتين12. علاوة على ذلك ، تم تقييم آثار قمع FAM83A على صلاحية الخلية. تسبب DDP في تأثير مثبط أكثر أهمية على تكاثر خلايا HeLa بعد قمع FAM83A ، مقارنة بعلاج DDP فقط (الشكل 5A والشكل 5C). بعد علاج خلايا سرطان عنق الرحم باستخدام 5 ميكرومتر سيسبلاتين ، أدى قمع FAM83A أيضا إلى تثبيط غزو الخلايا (الشكل 5B والشكل 5D).

تحليل حساسية الدواء لوظيفة الميتوكوندريا

من خلال معالجة خلايا HeLa المعالجة ب Si-NC والمعالجة ب si-FAM83A مع أو بدون 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP) ، قمنا بتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) وتقييم تلف الميتوكوندريا الناجم عن موت الخلايا باستخدام تلطيخ JC-1. تسبب DDP في المزيد من تلف الميتوكوندريا كما يتضح من انخفاض نسبة مونومر JC-1 بعد ضربة قاضية FAM83A ، مقارنة بمعالجة DDP فقط (الشكل 6A والشكل 6D). بعد علاج خلايا سرطان عنق الرحم باستخدام 5 ميكرومتر سيسبلاتين ، كما منعت ضربة قاضية FAM83A تكوين مستعمرة (الشكل 6B والشكل 6E) وتعزيز موت الخلايا المبرمج (الشكل 6C والشكل 6F). بالإضافة إلى ذلك ، زادت ضربة قاضية FAM83A في وجود DDP بشكل ملحوظ من التعبير عن البروتينات proapoptotic ، Bax و caspase المشقوق 3 ، وعززت إطلاق Cytc ، وانخفضت تعبير Bcl-2 (الشكل 6G ، H). أشارت هذه النتائج إلى أن FAM83A بالضربة القاضية تحسس خلايا سرطان عنق الرحم ل DDP عن طريق تحريض موت الخلايا المبرمج.

Figure 1
الشكل 1: التعبير المفرط FAM83A في خلايا سرطان عنق الرحم والارتباط بأسوأ المراجع. (أ) تحليل مخطط صندوقي لمستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال ل FAM83A في عينات سرطان عنق الرحم. (ب) تحليل كابلان ماير لتعبير FAM83A لتحديد البقاء على قيد الحياة بشكل عام في مرضى سرطان عنق الرحم. (ج) مستويات mRNA النسبية ل FAM83A في خطوط خلايا سرطان عنق الرحم HeLa و C33a وخط خلايا عنق الرحم البشرية الخالدة End1 / E6E7. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة. *P < 0.05، مقارنة بخلايا End1/E6E7 باستخدام ANOVA. الاختصارات: CESE = سرطان الخلايا الحرشفية العنقية وسرطان غدي باطن عنق الرحم. HR = نسبة الخطر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: آثار قمع FAM83A على انتشار وموت الخلايا المبرمج لسرطان عنق الرحم. تم نقل خلايا C33a و HeLa باستخدام siRNAs الخاصة ب FAM83A. (أ ، ب) تم تقييم مستويات mRNA من FAM83A في خطوط خلايا سرطان عنق الرحم باستخدام qRT-PCR.تم تحديد تكاثر الخلايا في (C) C33a و (D) خلايا HeLa باستخدام مقايسة EdU. (ه، و) صور مضان EDU لخلايا C33a و Hela. (ز-ي) تحليل اللطخة الغربية لفحص مستويات البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج ، بما في ذلك Cytc و Bcl-2 و Bax و caspase3 و cleftd-caspase-3 ؛ تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة. *P < 0.05; ** P < 0.01; ** P < 0.001 ، مقارنة بخلايا التحكم التي تستخدم ANOVA. الاختصارات: NC = التحكم السلبي ؛ EdU = 5-إيثينيل -2'-ديوكسي يوريدين. CytC = السيتوكروم C. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تأثير FAM83A على هجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم في المختبر. (A-D) تم إجراء اختبار التئام الجروح لتقييم هجرة الخلايا. تم التقاط الصور في 0 و 24 و 48 ساعة (E-H) تم إجراء فحوصات Transwell لفحص غزو الخلايا. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (E ، F). يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة. *P < 0.05; ** P < 0.01; ** P < 0.001 ، مقارنة بخلايا التحكم التي تستخدم ANOVA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأثير قمع FAM83A على مسار PI3K / AKT / mTOR ووظيفة الميتوكوندريا. (أ-د) تحليل اللطخة الغربية لتحديد مستويات البروتينات من مسار PI3K / AKT / mTOR في خلايا C33a و HeLa بعد قمع FAM83A. (ه-ح) تحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام تلطيخ JC-1. كانت مجاميع JC-1 ملطخة باللون الأحمر ، وكانت مونومرات JC-1 ملطخة باللون الأخضر مما يشير إلى انخفاض MMP. (ط، ي) تم تقييم نفاذية الميتوكوندريا باستخدام مجموعة mPTP وقياس التدفق الخلوي. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر (E ، F). يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة. * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01; P < 0.001 ، مقارنة بخلايا التحكم باستخدام ANOVA. الاختصارات: MMP = إمكانات غشاء الميتوكوندريا. mPTP = مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: آثار قمع FAM83A على تثبيط DDP على تكاثر الخلايا وغزو خلايا سرطان عنق الرحم. تم نقل خلايا هيلا باستخدام si-NC أو si-FAM83A وعولجت مع أو بدون 5 ميكرومتر DDP. (أ، ج) تأثير DDP على تكاثر الخلايا في خلايا هيلا المعالجة ب si-NC والمعالجة ب si-FAM83. (ب، د) تأثير DDP على غزو الخلايا في خلايا HeLa المعالجة ب si-NC و si-FAM83. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة. * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01; P < 0.001 ، مقارنة بخلايا التحكم. &> < 0.01; &&& < 0.001 ، مقارنة مع DDP باستخدام ANOVA. الاختصارات: DDP = ثنائي أمين ثنائي كلورو البلاتين. EdU = 5-إيثينيل -2'-ديوكسي يوريدين. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: آثار قمع FAM83A على آثار DDP على موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان عنق الرحم. تم نقل خلايا هيلا باستخدام si-NC أو si-FAM83A وعولجت مع أو بدون 5 ميكرومتر DDP. (أ، د) تحليل MMP باستخدام تلطيخ JC-1. (ب، ه) نتائج استنساخ اللوحة. (ج، و) قياس التدفق الخلوي الكشف عن معدلات موت الخلايا المبرمج في مجموعات العلاج المختلفة. (ز ، ح) تحليل اللطخة الغربية للبروتينات المبرمج المرتبطة بالميتوكوندريا ، بما في ذلك Bcl-2 و Bax و Cytc و caspase-3 المشقوق في اتجاه مجرى النهر. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة. * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01; P < 0.001 ، مقارنة بخلايا التحكم. &P < 0.05; &> < 0.01; &&& < 0.001 ، مقارنة مع DDP باستخدام ANOVA. الاختصارات: DDP = ثنائي أمين ثنائي كلورو البلاتين. EdU = 5-إيثينيل -2'-ديوكسي يوريدين. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: siRNA ، وبادئات qRTPCR ، وإعداد تفاعل qRT-PCR المستخدم في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد التحقيق في الجينات المستهدفة للورم ذا أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. إن فهم الجينات المحددة التي تلعب دورا مهما في تطور سرطان عنق الرحم وتطوره يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الجزيئية الأساسية للمرض. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تحديد هذه الجينات المستهدفة إلى تطوير استراتيجيات علاجية جديدة وعلاجات مستهدفة. في هذه الدراسة ، نصف استخدام تحليل مجموعة بيانات TCGA لتحديد FAM83A كجين مستهدف والتحقيق في أدواره الميكانيكية في سرطان عنق الرحم. نلاحظ تعبيرا عاليا بشكل ملحوظ عن FAM83A في خلايا سرطان عنق الرحم ، والذي يرتبط بسوء تشخيص مرضى سرطان عنق الرحم. كشفت سلسلة من التجارب القائمة على الخلايا عن تعبير FAM83A عالي في خلايا سرطان عنق الرحم ، والذي يلعب دورا مهما في تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة والغزو. قمع تعبير FAM83A يمنع الانتشار والهجرة ويعزز موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان عنق الرحم.

يعد بناء خطوط خلايا سرطان عنق الرحم FAM83A-knockdown الخطوة الأكثر أهمية في هذه الدراسة. تم تصميم siRNAs والتحقق من صحتها وفقا لتسلسل الجينات المستهدفة لضمان فعاليتها. علاوة على ذلك ، يتم نقل خطوط خلايا سرطان عنق الرحم باستخدام siRNA. يعد معدل نجاح نقل البلازميد أمرا بالغ الأهمية للتجارب اللاحقة ، والتي تتطلب رقابة صارمة على كثافة الخلايا وكثافة البلازميد. علاوة على ذلك ، يتم ملاحظة كفاءة النقل تحت المجهر الفلوري لضمان إمكانية إجراء التجارب اللاحقة. تؤكد نتائج النشاف الغربي و qRT-PCR أن تثبيط FAM83A قمع مسار PI3K / AKT وتسبب في خلل وظيفي في الميتوكوندريا. نحن نفترض أن الآلية تنطوي على تثبيط نقل باكس من السيتوبلازم إلى الميتوكوندريا بواسطة PI3K / AKT ، مما يعزز بقاء الخلية13.

جعلت التطورات في علاج سرطان عنق الرحم من الممكن تطوير جزيئات مستهدفة جديدة. يمكن تطبيق تحديد الجين الورمي الجديد علاجيا لتحسين التشخيص السريري للأورام الخبيثة في عنق الرحم14,15. في هذه الدراسة ، نجحنا في إنشاء نظام ضربة قاضية FAM83A في خلايا HeLa و C33a وتحققنا من آثار ضربة قاضية FAM83A على خلايا سرطان عنق الرحم على المستوى الخلوي. نقترح أنه يمكن استخدام تثبيط FAM83A لعلاج سرطان عنق الرحم.

ومع ذلك ، فإن هذه الدراسة لديها بعض القيود. أولا ، تقوم هذه الدراسة بإجراء فحص الجينات فقط من خلال قاعدة البيانات وتفتقر إلى البيانات المرضية للمرضى السريريين. ثانيا ، أثبتت هذه الدراسة صحة التأثير في المختبر فقط ، وكانت هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات في الجسم الحي للتحقق من النتائج. ومع ذلك ، فإن طرق تحديد الجينات المستهدفة ، والضربة القاضية للجينات ، والتحقق من صحة الخلايا لتحديد المواقع العلاجية المستهدفة الموضحة في هذه الدراسة يمكن أن توفر أفكارا بحثية لاكتشاف الجينات المستهدفة للأمراض الأخرى والتحقق من صحتها.

باختصار ، تم التعبير عن FAM83A بشكل مبالغ فيه وارتبط بأسوأ تشخيص في سرطان عنق الرحم. ينظم FAM83A انتشار خلايا سرطان عنق الرحم وهجرتها وغزوها. قمع الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا الناجم عن FAM83A وموت الخلايا المبرمج ، وتوعية خلايا سرطان عنق الرحم بالسيسبلاتين. أشارت هذه النتائج إلى أن FAM83A هو هدف بحثي مناسب لعلاج سرطان عنق الرحم. ساهمت هذه الدراسة في التقدم في العلاج الكيميائي المساعديهدف إلى تحسين تشخيص مرضى سرطان عنق الرحم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة مكتب Jingzhou للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2020HC06).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and Medium Formulation
C33a American Type Culture Collection
Hela American Type Culture Collection
Modified medium 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT 4691, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Bcl2  26593-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:1,000
Caspase 3 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc ‘1:2,000
cleaved-caspase3 abs132005; Absin Bioscience Inc. ‘1:1,000
Cytc 10993-1-AP; Proteintech Group ‘1:1,000
GAPDH  10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. ‘1:8,000
mTOR 2983, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
PI3K 4292, Cell Signaling Technology Inc ‘1:1,000
p-AKT  4060, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448) #5536, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit 17366, Cell Signaling Technology Inc. ‘1:1,000
Secondary antibodies GB23303, Servicebio ‘1:2,000
Materials
6-well plate Corning, NPY
Alexa Fluor 555 Beyotime
BCA Protein assay kit  Beyotime, China  P0011
ChemiDoc XRS Imager System  BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit  Servicebio, Inc.,China cat. no. G2014
Fluorescence microscope  Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix  11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope  Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts  Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit  Beyotime, China
PMSF  ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China #ST506
Real-time quantitative PCR instrument  Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer  Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent Invitrogen 15596026
TRIzol reagent  Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro  plus 6.0  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
  3. Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
  4. Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
  5. Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
  6. Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
  7. Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
  8. Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
  9. Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
  10. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
  11. Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
  12. Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
  13. Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
  14. Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
  15. Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 204 ، FAM83A ، سرطان عنق الرحم ، موت الخلايا المبرمج ، ضعف الميتوكوندريا ، DDP
ضربة قاضية من <em>FAM83A</em> للتحقق من دورها في نمو خلايا سرطان عنق الرحم وحساسية سيسبلاتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang,… More

Zhang, S., Lin, X., Xiao, L., Wang, Y. Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity. J. Vis. Exp. (204), e65667, doi:10.3791/65667 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter