Summary
在这里，我们展示了 FAM83A 敲除的程序;检测其对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭影响的测定;以及这些细胞对顺铂的致敏性。该研究为宫颈癌提供了一个有前途的靶基因，并为进一步的药物研究提供了参考。
Abstract
肿瘤靶基因的探索对于宫颈癌的防治具有重要意义。在这项研究中，我们概述了在宫颈癌中鉴定肿瘤靶基因FAM83A所涉及的步骤。首先，利用癌症基因组图谱数据集验证FAM83A在女性中的表达和预后意义。使用小干扰 RNA （siRNA） 敲低 HeLa 和 C33a 细胞中的 FAM83A 基因。接下来，进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色以确定对肿瘤细胞增殖能力的影响。进行伤口愈合和多孔膜插入试验以评估肿瘤细胞迁移和侵袭能力。
Western blotting用于量化细胞凋亡相关蛋白水平。采用JC-1染色评估线粒体功能改变。此外，顺铂（二胺二氯铂，DDP）干预用于评估靶基因的治疗潜力。进行流式细胞术和集落形成试验以进一步验证该基因的抗癌特性。结果显示， FAM83A 敲低可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并使这些细胞对顺铂敏感。这些综合方法共同验证 了FAM83A 作为肿瘤相关靶基因，有望成为预防和治疗宫颈癌的潜在治疗靶点。
Introduction
宫颈癌是全球主要的妇科恶性肿瘤类型之一，也是女性癌症相关死亡的主要原因，因此是一个全球关注的问题1。根治性手术和放化疗与初级阶段的高治愈率有关。然而，对于发生转移性疾病的宫颈癌晚期患者，治疗结果非常不利2。因此，进一步了解宫颈癌细胞迁移和侵袭的生物学机制，确定预防和治疗该疾病的潜在治疗靶点至关重要。
识别参与癌症进展的靶基因并找到抑制其表达或作用的方法提供了有希望的治疗选择。在这项研究中，我们将FAM83鉴定为致癌基因，并进一步研究了其对C33a和HeLa细胞的抑制作用。FAM83 家族癌基因 （FAM83A-H） 在人类癌症中被广泛报道 3,4。最近有报道称，FAM83A在肺5癌、乳腺癌6癌、卵巢癌7癌和胰腺癌8中上调，表明FAM83A通过促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、干细胞样性状和耐药性在癌症进展中发挥重要作用。重要的是，FAM83A 被鉴定为与宫颈病变进展和癌变相关的新型候选基因之一 9。尽管证实了FAM83A在人宫颈癌细胞中的表达升高，但FAM83A在宫颈癌中的具体影响和潜在机制仍不清楚。
在这项研究中，我们概述了鉴定FAM83A作为宫颈癌肿瘤靶基因所涉及的方案，并使用小干扰RNA（siRNA）敲低HeLa和C33a细胞中的FAM83A基因。进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色以确定对肿瘤细胞增殖的影响，而伤口愈合和多孔膜插入试验有助于评估肿瘤细胞迁移和侵袭能力。
进行蛋白质印迹以确定细胞凋亡相关蛋白的水平，并采用 JC-1 染色评估线粒体功能改变。因此，我们报道 了FAM83A 在宫颈癌的细胞增殖、转移和侵袭中起着关键作用。通过PI3K/AKT通路相关的线粒体功能障碍和细胞凋亡， FAM83A 敲低宫颈癌细胞对顺铂（二胺二氯铂，DDP）敏感。这项研究为宫颈癌和可能的其他癌症提供了一个新的靶点，并为开发克服癌细胞对某些化疗药物耐药性的策略提供了参考。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该研究完全符合TCGA（https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）提供的出版指南。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅材料表 。
1. 数据来源和生物信息学分析
- 从癌症基因组图谱 （TCGA） 数据库 （https://cancergenome.nih.gov） 获取 RNA 测序数据以进行聚类分析。使用基于网络的 GEPIA （http://gepia.cancer-pku.cn/） 工具重新计算来自 TCGA 项目样本的原始 RNA-Seq 数据，以通过标准处理流程筛选候选癌症药物靶点。
注意：GEPIA网站对所有用户免费开放。 - 访问GEPIA网站主页，点击“癌症类型分析”，选择“差异基因分析”选项，然后设置以下参数： 癌症名称 = CESE（定义为宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌），|Log2FC的|临界值 = 1，q 值临界值 = 0.01，差异方法 = 方差分析， 染色体分布 = 两者。然后，单击列表以获取显示肿瘤组和正常组之间差异表达的基因列表。
注意：它需要广泛的文献综述来鉴定差异表达的候选基因。在这项研究中，考虑到现有文献的背景，我们专注于感兴趣的肿瘤基因 FAM83A。 - 然后，通过网站上的 Expression DIY 选项，使用 GEPIA 检查 FAM83A 在宫颈癌和正常组织中的表达，并选择 Boxplot 作为图表类型。在基因参数字段中输入FAM83A，并设置以下参数： |Log2FC的|截止值 = 1;q 值截止值 = 0.01。选择 CESE 作为癌症名称，将匹配正常数据字段选择匹配 TCGA 正常数据，将所有其他设置保留为默认值。单击“绘图”，允许网站生成表示FAM83A基因差异表达的箱线图;保存箱线图以备将来参考和分析。
- 最后，分析宫颈癌中不同FAM83A表达水平的肿瘤患者的总生存期。导航到网站上的生存图选项，将基因设置为 FAM83A，然后选择总生存期作为分析类型。添加肿瘤名称 CESE，为轴单位选择月，并将所有其他参数保留为默认设置。点击绘图，让网站生成生存曲线图;保存此图表以备将来参考和分析。
- 同时考虑 FAM83A 在肿瘤中的差异表达及其与患者生存分析的相关性，将 FAM83A 确定为宫颈癌的潜在治疗靶基因。
2. 基于细胞的实验
- 细胞培养
- 在37°C的改良培养基中，在湿润的5%CO2 气氛中培养人肿瘤细胞系。
注：有关细胞系信息和培养基成分，请参阅 材料表 。
- 在37°C的改良培养基中，在湿润的5%CO2 气氛中培养人肿瘤细胞系。
- 细胞转染
- 使用 siRNA 敲低细胞中 FAM83A 的表达。
注：具体siRNA序列见 表1 。 - 将细胞接种在 6 孔板中，并在达到 50%-70% 汇合度后，与 50 nM si-FAM83A 或 siRNA-NC 和 8 μL 转染试剂或仅 8 μL 转染试剂的混合物孵育 4-6 小时。在阴性对照中仅添加无血清 DMEM。
- 孵育后，用DMEM+10%胎牛血清替换含有转染剂的培养基。此外，转染后 48 小时，按预期用 5 μM 顺铂 （DDP） 处理 24 小时，并收获所有细胞进行总 RNA 提取和 qRT-PCR 分析。
- 使用 siRNA 敲低细胞中 FAM83A 的表达。
3. 用于细胞增殖测定的 EdU 检测
注意：根据制造商的说明，使用 EdU 细胞增殖试剂盒 在体外 评估细胞增殖。
- 将细胞接种在6孔板中，并用10μM EdU溶液孵育2小时。在室温（RT）下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，并在室温下用0.3%Triton X-100在PBS中透化10分钟。
- 取出透化缓冲液并加入 500 μL 1x 反应溶液。然后，在室温下在黑暗中孵育30分钟进行核染色。
- 用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞，并在荧光显微镜下以200倍放大倍率观察它们。用EdU染色增殖细胞的细胞核，并检查它们的红色荧光。
- 最后，使用软件通过计数至少 10 个随机字段来量化结果，并使用荧光阳性细胞与总细胞的比率计算增殖率。
4.伤口愈合试验
- 在 6 孔板中接种细胞，密度为每孔 2 × 105 个细胞。
- 当细胞达到 90% 汇合度时，使用无菌的 10 μL 微量移液器吸头在细胞单层中轻轻形成线性划痕。用无菌 PBS 轻轻冲洗孔，以去除因刮擦引起的任何脱落的细胞和碎屑。
- 此外，将细胞在含有1%FBS的培养基中孵育。然后，用倒置显微镜观察并拍摄图像，以便在12,24和48小时处愈合受伤区域。
5. 多孔膜插入物测定
- 在所需细胞浓度（含有4×104 个细胞）的细胞培养基中制备细胞悬液，包括转染或对照 C33a 细胞和 HeLa。将细胞悬浮液添加到膜插入物的顶部腔室中，确保均匀分布。向下腔室中加入完全培养基。
- 孵育24小时后，分别使用甲醇和0.1%结晶紫固定和染色迁移到下腔室的细胞。
- 使用倒置显微镜拍摄图像，然后通过使用 ImageJ 计数至少 10 个随机场来分析迁移细胞的数量。
- 对于使用 ImageJ 进行数字分析，请在 ImageJ 软件中打开图像，转到工具菜单中的 “图像 ”选项卡，选择 “调整”，然后单击 “阈值”。如有必要，调整阈值设置，直到在白色背景上仅显示单元格。
- 单击“阈值”窗口中的“应用”，将这些设置应用于图像。现在，选择 魔杖 （描摹） 工具 从工具栏（位于窗口顶部）中。
- 单击单元格所在的图像区域以选择阈值图像中的所有单元格。突出显示单元格后，转到“工具”菜单中的“分析”，然后单击“分析粒子”。在“分析粒子”窗口中，根据实验要求输入所需的大小（例如，0 - 无穷大）和圆度值（例如，0.00 - 1.00），以将所有细胞包含在计数中。
- 单击 “确定 ”，然后等待软件对细胞进行计数，并等待显示分析结果的新窗口。
6. 菌落形成试验
- 在6孔板中接种2×105 个Si-NC和Si-FAM83A 组的细胞，在6孔板中，有或没有5μM顺铂（DDP）处理24小时。
- 经过24小时的药物处理后，使用0.25%胰蛋白酶分离细胞，并将其重悬于含有10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。将重悬细胞接种在密度为每孔1×103 个细胞的6孔板中，然后在37°C的温度下在5%CO2 培养箱中孵育。
- 孵育~7-10天后，当菌落可见时，用4%聚甲醛固定细胞，并用Giemsa染色溶液染色20分钟。
- 稍微洗净细胞，让板风干。通过显微镜拍摄菌落簇的图像，并计算包含超过 50 个细胞的菌落数量。
7. 使用 JC-1 染料的线粒体膜去极化 （MMP） 分析
- 将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。
- 根据制造商的说明，在37°C下，在5%CO2 下，使用线粒体膜电位测定试剂盒与1x JC-1染色溶液孵育15-20分钟。
- 洗涤细胞并在荧光显微镜下以200倍放大倍率分别使用JC-1的激发波长和发射波长分别在~490nm和590nm处检查它们。要可视化 JC-1 荧光，请使用适当的滤光片，例如蓝色激发滤光片 （450-490 nm） 和红色发射滤光片（长通 > 590 nm）来选择性地捕获发射的荧光信号。
8. mPTP的流式细胞分析
- 将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。
- 从细胞中取出培养基，将细胞重悬于PBS中，并各加入300μL（1x体积）的钙黄绿素AM染色溶液和荧光猝灭工作溶液以均匀覆盖细胞。将细胞在37°C下在光保护环境中孵育30-45分钟，并在37°C下用新鲜的预热培养基替换培养基。 将细胞在37°C下在光保护环境中再孵育30分钟，以确保细胞内酯酶完全水解钙黄绿素AM，从而产生细胞内绿色荧光钙黄绿素。
- 取出培养基，用PBS洗涤细胞2-3次，并加入检测缓冲液。使用流式细胞术和 488 nm 的激发波长检测细胞 mPTP。
9. 流式细胞术
- 将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。
- 药物处理 24 小时后，将细胞重悬于 200 μL 结合缓冲溶液中，并将 10 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 5 μL 碘化丙啶 （PI） 轻轻混合到细胞悬液中。将混合物孵育 15 分钟，同时避免避光，并向细胞中加入 300 μL 结合缓冲溶液。使用激发波长为488nm的流式细胞术检测细胞凋亡。
10. RT-PCR分析
- 将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。
- 使用RNA提取试剂从肿瘤细胞中提取总RNA，并通过在42°C下孵育45分钟，然后在95°C下孵育5分钟，将提取的RNA转化为cDNA合成混合物中的互补DNA（cDNA）。
- 制备含有DNA聚合酶，核苷酸，缓冲液和设计的基因特异性引物的PCR反应混合物。将cDNA模板添加到反应混合物中进行实时荧光定量PCR反应，并在实时荧光定量PCR仪器上使用以下热循环条件进行PCR：在95°C下变性30秒，然后在95°C下变性5秒，在60°C下变性30秒，在95°C下熔解曲线阶段15秒， 60°C1分钟，95°C15秒。使用 GAPDH 作为内部对照，使用 2−ΔΔCq 方法定量 mRNA 水平。
注：RT-PCR反应系统如 表1所示，引物序列如 表1所示。- 要计算 2−ΔΔCq 值，请测量样品中靶基因和参考基因 （GAPDH） 的 Cq 值。通过从每个样品的目标基因的 Cq 值中减去参考基因的 Cq 值来计算 ΔCq。通过从每个实验样品的 ΔCq 中减去对照样品的 ΔCq 来计算 ΔΔCq。最后，通过将 2 提高到 ΔΔCq 值的幂来计算 2−ΔΔCq 值。
注意： Cq 值表示荧光信号达到设定阈值的循环数。
- 要计算 2−ΔΔCq 值，请测量样品中靶基因和参考基因 （GAPDH） 的 Cq 值。通过从每个样品的目标基因的 Cq 值中减去参考基因的 Cq 值来计算 ΔCq。通过从每个实验样品的 ΔCq 中减去对照样品的 ΔCq 来计算 ΔΔCq。最后，通过将 2 提高到 ΔΔCq 值的幂来计算 2−ΔΔCq 值。
11. 蛋白质印迹分析
- 将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。
- 收集培养的细胞并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤，以除去任何残留的生长培养基或血清。使用含有苯甲基磺酰氟 （PMSF） 的 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞以释放细胞蛋白。将细胞在冰上孵育几分钟以确保完全裂解，并在4°C，12,000× g 下离心15分钟。收集上清液以确定其蛋白质浓度。
- 根据制造商的说明，使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定细胞裂解物中的蛋白质浓度。将细胞裂解物与上样缓冲液混合，并在95-100°C下加热混合物5-10分钟，使蛋白质变性并确保凝胶上的均匀分离。
- 从每个样品中，将30μg总蛋白加载到SDS-PAGE凝胶上，并在80V的恒定电压下运行SDS-PAGE。
- 使用湿式转移系统将凝胶中分离的蛋白质转移到聚氟乙烯膜上，在冰浴上以200mA的电流转移1.5小时。
- 在室温下用Tris缓冲盐水中的5%脱脂牛奶封闭膜，在室温下1小时，并在4°C下用 材料表中给出的相应抗体孵育过夜。
- 用TBST多次洗涤膜，并在室温下与二抗（材料表）孵育1小时，然后用TBST洗涤。使用增强型化学发光检测试剂盒和成像仪系统可视化蛋白质条带。
12. 统计分析
- 由于所有实验数据点都是独立的，因此将数据表示为标准差±均值。
- 使用单因素方差分析 （ANOVA） 进行多重比较，并使用 Dunnett 检验将每组与对照组进行比较。使用学生 t 检验（未配对双尾）比较两组;认为 P < 0.05 是显著的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TCGA数据库分析和PCR验证
根据TCGA数据库分析，我们对306个宫颈癌细胞样本和13个正常细胞样本中的mRNA表达水平进行了比较分析，以研究FAM83A的差异表达。FAM83A在宫颈癌中上调，而其在正常宫颈组织中的表达可以忽略不计（图1A）。为了进一步了解 FAM83A 表达的预后意义，我们进行了 Kaplan-Meier 曲线分析。引人注目的是，FAM83A表达较高的患者表现出明显更差的总生存期（图1B）。为了确定FAM83A在宫颈癌中的作用，我们检查了FAM83A在两种宫颈癌细胞系HeLa和C33a以及永生化宫颈细胞系End1 / E6E7中的表达水平。使用 qRT-PCR，与 End1/E6E7 细胞系相比，我们观察到 HeLa 和 C33a 细胞系中 FAM83A 的显着过表达（图 1C）。这些发现强调了FAM83A在宫颈癌中的重要性。
增殖和细胞凋亡实验验证FAM83A在宫颈癌中的生物学功能
为了研究FAM83A在宫颈癌中的功能作用，我们利用siRNA介导的C33a和HeLa细胞中FAM83A的敲低（图2A，B）。然后，我们评估了FAM83A抑制对细胞增殖的影响。EdU染色显示，FAM83A表达降低可显著抑制C33a和HeLa细胞的细胞增殖（图2C-F）。不朽的恶性细胞与极低的细胞凋亡率有关10。因此，评估对照组和si-FAM83A处理的宫颈癌细胞中抗凋亡和促凋亡蛋白的水平。蛋白质印迹分析显示，抑制FAM83A的表达增加了Bax和裂解的caspase3蛋白（促凋亡蛋白）的表达，降低了Bcl-2（抗凋亡蛋白）的表达，并增加了Cytc的释放（图2C-E），这与抗凋亡蛋白通过阻断Cytc的线粒体释放来调节细胞凋亡的观察结果一致（图2G-J）10.总的来说，这些数据表明FAM83A在调节宫颈癌细胞增殖和凋亡中起着重要作用。
伤口愈合和多孔膜插入物测定以验证FAM83A在宫颈癌中的生物学功能
采用伤口愈合和膜插入试验，探讨FAM83A抑制对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响。结果显示，FAM83A表达受到抑制的宫颈癌细胞迁移（图3A-D）和侵袭（图3E-H）的效率低于对照细胞。
对线粒体功能及PI3K/AKT信号通路的影响
鉴于PI3K/AKT在诱导细胞凋亡中的作用，我们旨在确定抑制FAM83A表达是否会抑制宫颈癌中PI3K/Akt/mTOR通路的组成型磷酸化。抑制 FAM83A 显着抑制 c333a 和 HeLa 细胞中 PI3K/Akt/mTOR 通路中的关键磷酸化蛋白水平，包括 p-PI3K、p-Akt 和 p-mTOR（图 4A-D）。线粒体是负责细胞代谢和细胞凋亡诱导的细胞器。越来越多的证据表明，由于线粒体通透性增强和促凋亡分子（如 Cytc）释放到细胞质中，癌细胞凋亡涉及通过内在线粒体途径的线粒体功能障碍10。PI3K/AKT通路可以调节Bax向线粒体的易位，诱导细胞释放以响应凋亡刺激。因此，可以想象PI3K-AKT信号通路的致癌成分通过影响线粒体行为直接调节细胞凋亡。因此，进行了活细胞线粒体通透性转换孔 （mPTP） 测定以确定线粒体状态。mPTP 开放与凋亡和坏死细胞死亡有关11。在该测定中，当 mPTP 关闭时，绿色荧光染料（钙黄绿素 AM）保留在细胞质和线粒体中，而细胞质中的染料被 CoCl2 淬灭，仅在线粒体中留下强烈荧光。结果显示，在FAM83A抑制后，线粒体中具有强烈绿色荧光的细胞群显着减少，表明mPTP打开（图4E，F）。此外，我们使用 JC-1 染色检查了线粒体膜电位 （ΔΨm） 的变化。JC-1在活细胞中形成聚集体（红色荧光），在凋亡细胞中含有具有高膜电位的完整线粒体和低MMP下的单体（绿色荧光）。FAM83A抑制逐渐降低MMP（图4G）。
药物增殖和侵袭的药敏性分析
基于顺铂 （DDP） 的化疗是宫颈癌的标准治疗策略。然而，化疗耐药性仍然是一个挑战。我们研究了 FAM83A 在使用顺铂治疗宫颈癌中的作用。对照、si-NC 处理和 si-FAM83A 处理的 HeLa 细胞用或不用 5 μM 顺铂12 处理。此外，还评估 了FAM83A 抑制对细胞活力的影响。与仅 DDP 处理相比，DDP 在 FAM83A 抑制后对 HeLa 细胞增殖的抑制作用更显着（图 5A 和 图 5C）。在用5μM顺铂治疗宫颈癌细胞后， FAM83A 抑制也抑制了细胞侵袭（图5B 和 图5D）。
线粒体功能的药敏分析
通过用或不用 5 μM 顺铂 （DDP） 处理 Si-NC 处理和 si-FAM83A 处理的 HeLa 细胞，我们评估了线粒体膜电位 （MMP） 并使用 JC-1 染色评估了细胞死亡引起的线粒体损伤。与仅 DDP 处理相比，DDP 诱导了更多的线粒体损伤，如 FAM83A 敲低后 JC-1 单体百分比降低所揭示的那样（图 6A 和图 6D）。用5μM顺铂处理宫颈癌细胞后，FAM83A敲低还抑制了集落形成（图6B和图6E）并增强了细胞凋亡（图6C和图6F）。此外，在DDP存在下敲低FAM83A显著增加促凋亡蛋白Bax和裂解caspase3的表达，促进细胞释放，降低Bcl-2表达（图6G，H）。这些结果表明，FAM83A敲低通过细胞凋亡诱导使宫颈癌细胞对DDP敏感。
图1：FAM83A在宫颈癌细胞中的过表达及其与较差预后的相关性。 （A） 宫颈癌样本中FAM83A的mRNA水平的箱线图分析。（B） FAM83A 表达的 Kaplan-Meier 分析，用于确定宫颈癌患者的总生存期。（C） 宫颈癌细胞系 HeLa 和 C33a 以及人永生化宫颈细胞系 End1/E6E7 中 FAM83A 的相对 mRNA 水平。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。*P < 0.05，与使用单因素方差分析的 End1/E6E7 细胞相比。缩写：CESE=宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌;HR = 风险比。请点击这里查看此图的较大版本.
图2：抑制FAM83A对宫颈癌增殖和凋亡的影响。 用 FAM83A 特异性 siRNA 转染 C33a 和 HeLa 细胞。使用qRT-PCR评估宫颈癌细胞系中FAM83A的（A，B）mRNA水平，使用EdU测定法测定（C）C33a和（D）HeLa细胞中的细胞增殖。（英、女）C33a和Hela细胞的EDU荧光图像。（G-J）蛋白质印迹分析，用于检测细胞凋亡相关蛋白的水平，包括 Cytc、Bcl-2、Bax、caspase3 和 cleaved-caspase-3;使用GAPDH作为加载控制。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。*P < 0.05;**P < 0.01;**P < 0.001，与使用单因素方差分析的对照细胞相比。缩写：NC = 阴性对照;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;CytC = 细胞色素 C. 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：FAM83A对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭的影响。 （A-D）进行伤口愈合试验以评估细胞迁移。在0、24和48小时拍摄图像（E-H）进行Transwell测定以检查细胞侵袭。比例尺 = 100 μm （E，F）。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。*P < 0.05;**P < 0.01;**P < 0.001，与使用单因素方差分析的对照细胞相比。请点击这里查看此图的较大版本.
图4：FAM83A抑制对PI3K/AKT/mTOR通路和线粒体功能的影响。 （A-D）蛋白质印迹分析，以确定 FAM83A 抑制后 C33a 和 HeLa 细胞中 PI3K/AKT/mTOR 通路的蛋白质水平。（E-H）使用 JC-1 染色进行线粒体膜电位分析。JC-1聚集体染成红色，JC-1单体染成绿色，表明MMP较低。（一、J）使用 mPTP 试剂盒和流式细胞术评估线粒体通透性。比例尺 = 50 μm （E， F）。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。*P < 0.05;**P < 0.01;P < 0.001，与使用单因素方差分析的对照细胞相比。缩写：MMP = 线粒体膜电位;mPTP = 线粒体通透性过渡孔。请点击这里查看此图的较大版本.
图5：FAM83A抑制对DDP抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响。 用 si-NC 或 si-FAM83A 转染 HeLa 细胞，并用或不用 5 μM DDP 处理。（甲、丙）DDP 对对照、si-NC 处理和 si-FAM83 处理的 HeLa 细胞增殖的影响。（乙，丁）DDP 对对照、si-NC 处理和 si-FAM83 处理的 HeLa 细胞侵袭的影响。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。*P < 0.05;**P < 0.01;与对照细胞相比，P<0.001。&&P < 0.01;&&&P < 0.001，与使用单因素方差分析的 DDP 相比。缩写：DDP = 二胺二氯铂;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.
图6：FAM83A抑制对DDP对宫颈癌细胞凋亡影响的影响。 用 si-NC 或 si-FAM83A 转染 HeLa 细胞，并用或不用 5 μM DDP 处理。（甲、丁）使用 JC-1 染色进行 MMP 分析。（乙、英）板克隆结果。（C，F）流式细胞术检测不同治疗组的细胞凋亡率。（G，H）线粒体相关凋亡蛋白的蛋白质印迹分析，包括 Bcl-2、Bax、Cytc 和下游裂解的半胱天冬酶-3。使用GAPDH作为加载控制。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。*P < 0.05;**P < 0.01;与对照细胞相比，P<0.001。&P < 0.05;&&P < 0.01;&&&P < 0.001，与使用单因素方差分析的 DDP 相比。缩写：DDP = 二胺二氯铂;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1：本研究中使用的 siRNA、qRTPCR 引物和 qRT-PCR 反应装置。 请按此下载此表格。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肿瘤靶基因的研究对于宫颈癌的防治都具有重要意义。了解在宫颈癌发展和进展中起重要作用的特定基因为了解该疾病的潜在分子机制提供了宝贵的见解。此外，识别这些靶基因可以导致新的治疗策略和靶向疗法的开发。在这项研究中，我们描述了使用TCGA数据集分析来鉴定 FAM83A 作为靶基因并研究其在宫颈癌中的机制作用。我们观察到宫颈癌细胞中 FAM83A 的表达显着高，这与宫颈癌患者的不良预后有关。一系列基于细胞的实验揭示了宫颈癌细胞中 FAM83A 的高表达，这在调节细胞增殖、迁移和侵袭中起着关键作用。抑制 FAM83A 表达抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡。
构建 FAM83A敲低宫颈癌细胞系是本研究中最关键的一步。根据目标基因序列对siRNA进行设计和验证，以确保其有效性。此外，使用siRNA转染宫颈癌细胞系。质粒转染的成功率对于后续实验至关重要，因为后续实验需要严格控制细胞密度和质粒密度。此外，在荧光显微镜下观察转染效率，以确保可以进行后续实验。Western blotting和qRT-PCR结果证实， FAM83A 的抑制抑制了PI3K/AKT通路并诱导了线粒体功能障碍。我们假设该机制涉及 PI3K/AKT 抑制 Bax 从细胞质到线粒体的易位，从而促进细胞存活13。
宫颈癌治疗的进步使得开发新的靶分子成为可能。新型致癌基因的鉴定可用于治疗，以改善宫颈恶性肿瘤的临床预后14,15。在这项研究中，我们成功地在HeLa和C33a细胞中构建了FAM83A敲低系统，并在细胞水平上验证了FAM83A敲低对宫颈癌细胞的影响。我们提出FAM83A的抑制作用可用于治疗宫颈癌。
然而，这项研究有一些局限性。首先，本研究仅通过数据库进行基因筛选，缺乏临床患者的病理数据。其次，这项研究只 验证了 体外效果，需要进一步的 体内 研究来验证结果。然而，本研究阐述的靶基因鉴定、基因敲除和细胞验证等靶向治疗位点的鉴定方法可为其他疾病靶基因的发现和验证提供研究思路。
总之， FAM83A 过表达，与宫颈癌预后较差相关。 FAM83A 调节宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。抑制 FAM83A诱导的线粒体功能障碍和细胞凋亡，使宫颈癌细胞对顺铂敏感。这些结果表明， FAM83A 是治疗宫颈癌的合适研究靶点。本研究促进了辅助化疗的进展，旨在改善宫颈癌患者的预后。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者报告说，这项工作没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了荆州市科学技术局基金会（编号：2020HC06）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 |
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L.
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L.
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
