ट्रांसजेनिक का उत्पादन Xenopus laevis प्रतिबंध एनजाइम मध्यस्थता एकता और परमाणु ट्रांसप्लांटेशन

Summary

यह वीडियो प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक पैदा करने के लिए एक विधि दर्शाता

Abstract

Xenopus जीनोम में क्लोन जीन उत्पादों की स्थिर एकीकरण समय और अभिव्यक्ति की जगह नियंत्रण, भ्रूण विकास के बाद के चरणों में व्यक्त जीनों, और परिभाषित करने के लिए कैसे enhancers के प्रमोटरों और भ्रूण के भीतर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए आवश्यक है. प्रोटोकॉल यहाँ प्रदर्शन करने के लिए कुशलतापूर्वक ट्रांसजेनिक Xenopus laevis भ्रूण का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह transgenesis दृष्टिकोण तीन भागों शामिल हैं: 1. शुक्राणु नाभिक वयस्क एक्स से अलग कर रहे हैं lysolecithin, जो शुक्राणु प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes के साथ इलाज के द्वारा laevis वृषण. 2. अंडे निकालने कम गति centrifugation, कैल्शियम के अलावा निकालने के कारण कोशिका चक्र के interphase प्रगति, और एक उच्च गति interphase cytosol अलग centrifugation से तैयार है. 3. परमाणु प्रत्यारोपण: नाभिक और निकालने linearized प्लाज्मिड transgene और प्रतिबंध एंजाइम की एक छोटी राशि के रूप में पेश किया डीएनए के साथ संयुक्त कर रहे हैं. एक छोटी प्रतिक्रिया के दौरान, अंडे निकालने आंशिक रूप से शुक्राणु chromatin decondenses और प्रतिबंध एंजाइम गुणसूत्र टूटता है कि जीनोम में transgene के पुनर्संयोजन को बढ़ावा देने के उत्पन्न करता है. इलाज शुक्राणु नाभिक तो unfertilized अंडे में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. Transgene की एकता आमतौर पर पहली भ्रूण दरार ऐसी है कि जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण chimeric नहीं कर रहे हैं करने से पहले होता है. ये भ्रूण किसी भी अगली पीढ़ी के लिए नस्ल, ट्रांसजेनिक भ्रूण के प्रमोटर और जीन समारोह के विश्लेषण के लिए कुशल और तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति की जरूरत के बिना विश्लेषण किया जा सकता है. वयस्क एक्स इस प्रक्रिया से परिणामस्वरूप laevis भी germline के माध्यम से transgene प्रचार और ट्रांसजेनिक जानवरों के कई प्रयोजनों के लिए लाइनों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

इस transgenesis दृष्टिकोण के संशोधित संस्करण के ^{शुरू में 1} और 2 में वर्णित किया गया.

ए शुक्राणु नाभिक तैयारी

यह नाभिक तैयारी विधि ³ मूर्रे से अनुकूल है, लेकिन protease inhibitors के रूप में वे शुक्राणु नाभिक के साथ प्रतिरोपित अंडे के बाद विकास के साथ हस्तक्षेप लोप किया गया है. Aliquots -80 ° C पर जमे हुए हैं और लगभग 6 महीने के लिए प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सभी समाधान और तैयार किया जाना चाहिए बर्फ पर रखा पूर्व तैयारी शुरुआत.

1. 1-2 वयस्क पुरुष एक्स anesthetize Tricaine में विसर्जन के द्वारा कम से कम 20 मिनट के लिए laevis pithing द्वारा पीछा किया; testes हटायें .
2. एक कागज तौलिया पर testes रोल रक्त, रक्त वाहिकाओं और वसा शरीर को हटाने के लिए, उन्हें एक 60 मिमी पेट्री 1XMMR युक्त पकवान में संक्षेप धोने, और वसा शरीर के किसी भी अतिरिक्त टुकड़े को हटा दें. Testes पंचर करने के लिए नहीं ख्याल रखना, के रूप में इस शुक्राणु विज्ञप्ति.
3. एक सूखी 60 मिमी पेट्री डिश और संदंश के साथ सिझाना testes testes स्थानांतरण जब तक वहाँ कोई दिखाई हिस्सा हैं. थकावट के रूप में संभव के रूप में अच्छी तरह से किया जाना चाहिए नाभिक के उच्च पैदावार प्राप्त है.
4. सिझाना और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे, 2mLs ठंड परमाणु तैयारी बफर (स्टॉक से 1X NPB) जोड़ें.
5. के बारे में 4 के माध्यम से धारा निकलना सिझाना जाली की एक चिमनी पर thicknesses, एक 15 एमएल ट्यूब (जैसे फाल्कन 2059) में एकत्रित, NPB के 8mLs के साथ पकवान कुल्ला और डाल यह जाली के माध्यम से कुल्ला, यह ट्यूब में इकट्ठा. साथ दस्ताने हाथ जाली निचोड़ ट्यूब में शेष तरल एकत्र.
6. 10 मिनट के लिए 3000 rpm पर शुक्राणु गोली. 4 बजे ° सी में उपयुक्त ट्यूब एडाप्टर के साथ एक झूलते बाल्टी रोटर (Sorvall रोटर एचबी 4 या समकक्ष में जैसे 1480g). छानना सतह पर तैरनेवाला, ऐड इस ट्यूब 8ml NPB और विंदुक ऊपर और नीचे एक 10 एमएल resuspend गोली विंदुक के साथ, नीचे ऊपर और छानना सतह पर तैरनेवाला के रूप में फिर से स्पिन. कमरे के तापमान पर स्पिन के दौरान NPB के 1ml संतुलित करना.
7. Resuspend गोली, 1ml कमरे के तापमान 1 एमएल pipetteman टिप का उपयोग NPB में 10mg/mL हौसले से बनाया lysolecithin 50μl जोड़ने के लिए, धीरे मिश्रण, और 5 मिनट के लिए सेते हैं. कमरे के तापमान पर.
8. ट्यूब को 10 एमएल ठंड 1XNPB 3% BSA जोड़ें lysolecithin प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, धीरे मिश्रण है, और एक झूलते बाल्टी रोटर में 3000 rpm पर 10 मिनट के लिए नीचे स्पिन. छानना सतह पर तैरनेवाला. lysolecithin - इलाज गोली और थोड़ा पारदर्शी दिखना चाहिए (कम अपारदर्शी सफेद) की तुलना में यह lysolecithin उपचार के लिए पहले किया था.
9. छानना सतह पर तैरनेवाला और 5 एमएल ठंड NPB 0.3% BSA में resuspend गोली, एक 10 एमएल विंदुक के साथ धीरे मिश्रण और 3000rpm पर इसके बाद के संस्करण के रूप में 10 मिनट के लिए नीचे स्पिन.
10. छानना सतह पर तैरनेवाला और 500μl शुक्राणु भंडारण बफर और एक 1.5 एमएल ट्यूब स्थानांतरण में resuspend गोली. यह अब अपने नाभिक स्टॉक है. बर्फ पर स्टोर जब आप नाभिक की उपज की जाँच करें.
11. नाभिक की उपज की जांच करने के लिए, जगह शुक्राणु कमजोर पड़ने (SDB) बफर, परमाणु शेयर और एक 1.5mL Eppendorf ट्यूब में Hoechst शेयर की 1:100 कमजोर पड़ने के 1μl 1 μl के 98 μl. परमाणु शेयर बहुत अच्छी तरह मिक्स से सिर्फ एक μl हटाने से पहले एक उस्तरा काटा (या बड़े खोलने) विंदुक टिप का उपयोग कर. पतला SDB / Hoechst / नाभिक बहुत अच्छी तरह से मिलाएं और केशिका कार्रवाई द्वारा एक बेहतर NEUBAUER hemacytometer के कक्ष में प्रवाह के लिए एक छोटी सी राशि की अनुमति है. Hemacytometer के एक वर्ग में एक यौगिक खुर्दबीन के नीचे नाभिक गिन लो. एक पुरुष से, आप शेयर इस 1:100 कमजोर पड़ने के लिए ^1-2x10 5 कोशिकाओं / μl के एक undiluted शेयर एकाग्रता के लिए कम से कम 100-200 के मायने रखता है ^(X10 4 कोशिकाओं / एमएल) प्राप्त करना चाहिए . यदि आपके शेयर कम केंद्रित है, नाभिक में कई घंटे के लिए बस, सतह पर तैरनेवाला के कुछ हटा, और बयान. 4 में नाभिक छोड़ दो डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल बेहतर cryopreservation के लिए प्रवेश करने की अनुमति रातोंरात, तो परमाणु शेयर अच्छी तरह से एक बड़े छिद्र विंदुक टिप के साथ, मिश्रण तैयार 20μl aliquots, और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज.

हाई स्पीड निकालें बी तैयार

इस विधि मूर्रे ³ से अनुकूलित है और एक interphase साइटोसोलिक निकालने का उत्पादन है कि सूजन और आंशिक जोडी शुक्राणु नाभिक के chromatin decondensation बढ़ावा देंगे . निकालें छोटे aliquots में -80 ° सी में जमे हुए किया जा सकता है और उपयोग करने से पहले thawed है.

1. एचसीजी इंजेक्शन, प्रधानमंत्री 8-12 वयस्क महिला एक्स के लिए पहले 3-5 दिन पृष्ठीय लिम्फ थैली में PMSG के 50 यू इंजेक्शन द्वारा laevis. निकालने की तैयारी से पहले शाम, 500 इकाइयों एचसीजी और 2 मेंढ़क / 2 लीटर 1XMMR में कंटेनर के साथ एक मेंढक इंजेक्षन. चूंकि lysing या सक्रिय अंडे के साथ एक मेंढक निकालने की तैयारी के साथ समझौता कर सकते हैं, यह सलाह दी जाती है जोड़े में ovulation के लिए मेंढ़कों अलग.
2. अगली सुबह तैयार है, और तैयारी की शुरुआत से पहले सभी समाधान ठंडा. धीरे, मैन्युअल रूप से प्रत्येक मेंढक से बड़े ख में अंडे निष्कासित1X एमएमआर युक्त eakers. प्रत्येक कंटेनर से अंडे स्क्रीन और mottling lysing, या सक्रियण की प्रक्रिया से संकेत (जानवर गोलार्द्ध में pigmentation के संकुचन द्वारा कल्पना) के साथ अंडे की किसी भी बैचों छोड़ सकते हैं. Pigmentation के साथ भी अटूट अंडे ले लीजिए. अच्छा अंडे भी मेंढक बाल्टी में 1X MMR से एकत्र किया जा सकता है. अंडे की कुल मात्रा> 100 एमएल 8-12 महिलाओं से किया जाना चाहिए.
3. डी - जेली अंडे. ऐसा करने के लिए, संभव के रूप में के रूप में ज्यादा एमएमआर हटाने, सिस्टीन समाधान की एक छोटी राशि जोड़ने के लिए, और अंडे ज़ुल्फ़. ताजा सिस्टीन समाधान के साथ डे jellying के दौरान कई बार बदलें. De-जेली अंडे की प्रत्येक अलग - अलग बैच और टूटना या अंडा सक्रियण के साथ बैचों त्यागें. अंडे के बाकी का मिश्रण.
4. अंडे protease inhibitors के साथ ~ निकालने बफर (XB) के 35 एमएल में चार बार, और फिर सी.एस.एफ.-XB के 25 एमएल में दो बार धोएं.
5. अंडे पैक: Beckman ultraclear ट्यूबों में अंडे को हस्तांतरण. अंडे को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. के रूप में संभव के रूप में सी.एस.एफ.-XB ज्यादा निकालें. ~ 60 सेकंड के लिए 1000 rpm (150g) पर 4 पर Beckman दप 40 तिवारी रोटर (या इसी तरह रोटर) का उपयोग करते हुए अंडे ° सी. अपकेंद्रित्र पैक अंडे के ऊपर से अधिक समाधान निकालें.
6. अंडे को कुचलने के लिए और उत्पन्न cytoplasmic निकालने: 10 मिनट के लिए 10,000 (१६००० छ) 4 rpm ° सी. पर अंडे अपकेंद्रित्र अंडे तीन परतों में अलग होना चाहिए: लिपिड (ऊपर), cytoplasm (बीच में), और जर्दी (नीचे). प्रत्येक ट्यूब से एक 18 गेज सुई के साथ cytoplasmic परत के आधार पर ट्यूब के माध्यम से सुई डालने से cytoplasmic परत लीजिए. एक ताजा ultraclear Beckman ट्यूब बर्फ पर cytoplasm स्थानांतरण.
7. 1X के अंतिम एकाग्रता के लिए पृथक cytoplasm protease inhibitors जोड़ें. 4 बजे 10 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर cytoplasm Recentrifuge डिग्री सेल्सियस ऊपर वर्णित के रूप में स्पष्ट cytoplasm लीजिए. 0.75-1 एमएल cytoplasm / मेंढक प्राप्त करने की अपेक्षा.
8. ऊर्जा मिश्रण का नमूना निकालने की मात्रा का 1 / 20 जोड़ें. Beckman TL 100 ultracentrifuge के लिए मोटी दीवारों polycarbonate ट्यूबों में cytoplasm स्थानांतरण. ट्यूब के बारे में 3 एमएल प्रत्येक पकड़ और कम से कम आधा भरा होना चाहिए.
9. 1 प्रत्येक ट्यूब करने के लिए एम ₂ CaCl 0.4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों को सेते हैं. यह सी.एस.एफ. inactivates और interphase में निकालने धक्का.
10. बैलेंस ट्यूबों और उन्हें Beckman TL 100 70,000 rpm (+२००००० छ) में 1.5 घंटे के लिए 4 में एक TLA 100.3 रोटर का उपयोग ultracentrifuge एक डिग्री सेल्सियस में अपकेंद्रित्र लिपिड, झिल्ली, cytosol / mitochondria, ग्लाइकोजन और / ribosomes: cytoplasm चार परतों में fractionate, ऊपर से नीचे जाएगा.
11. प्रत्येक ट्यूब (~ 1 अगर 2-3 एमएल ट्यूब में भरी हुई थी एमएल) से लिपिड परत के माध्यम से ट्यूब के शीर्ष में एक सिरिंज डालने से साइटोसोलिक परत निकालें. ताजा ट्यूबों साइटोसोलिक अंश स्थानांतरण और 20 मिनट के लिए 70,000 (दो लाख छ) 4 rpm ° सी. पर नमूने recentrifuge
12. विभाज्य 0.5 एमएल ट्यूबों में 25 μl aliquots में सतह पर तैरनेवाला. उपयोग करें जब तक तरल नाइट्रोजन और -80 पर दुकान ° सी में aliquots त्वरित फ्रीज. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या निकालने प्रभावी है, शुक्राणु नाभिक निकालने में incubated किया जा सकता है और Hoechst के साथ दाग निर्धारित करने के लिए कि क्या नाभिक दिख (अधिक मोटा होना और लंबा) कमरे के तापमान पर इसके अलावा के 10 मिनट के भीतर प्रफुल्लित.

सी. Transgenesis प्रतिक्रिया और परमाणु हस्तांतरण

महत्वपूर्ण: जाँच करें कि समाधान उपकरण, और मेंढ़कों सब एक प्रतिक्रिया शुरू होने से पहले तैयार कर रहे हैं. एक बार जब आप शुरू, तुम प्रतिक्रिया अनुमानित समय सारिणी नीचे वर्णित का उपयोग के साथ आगे बढ़ना है, के बाद से कई घटकों> 30 मिनट के लिए स्थिर नहीं रह चाहिए. जबकि शुक्राणु नाभिक शेयर बर्फ पर रखा है, transgenesis प्रतिक्रियाओं (दोनों पतला और केंद्रित) कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए.

1. प्रधानमंत्री महिला मेंढ़क. transgenesis से पहले शाम, 800 पृष्ठीय लिम्फ थैली में एचसीजी इकाइयों के साथ कई (3-5) वयस्क मादा मेंढक इंजेक्षन करने के लिए हौसले से रखी अगले दिन की शुरुआत अंडे प्राप्त.
2. transgenesis प्रक्रिया के दिन तैयार करते हैं, या transgenesis के लिए जरूरत समाधान के तापमान को लाने:
   1. हौसले से बनाया सिस्टीन (1XMMR, pH8.0 में 2.5%). आप उस दिन इस्तेमाल किया जा कई सौ मिलीलीटर की आवश्यकता होगी.
   2. 0.2XMMR प्रत्यारोपण व्यंजन और ट्रांसजेनिक भ्रूण और भ्रूण जुटाने के लिए 100 μg / एमएल gentamicin (Ficoll बिना) 0.2XMMR की वसूली के लिए 6% Ficoll. समाधान 18-21 की अपेक्षा अधिक गर्म डिग्री सेल्सियस और ट्रांसजेनिक भ्रूण को 16 और 21 के बीच तापमान पर जल्दी चोली के माध्यम से उठाया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस, उच्च तापमान के बाद से प्रतिकूल transgenesis और भ्रूण के विकास के दोनों आवृत्ति को प्रभावित नहीं होना चाहिए.
   3. में कमरे SDB के तापमान दिन प्रत्यारोपण के लिए जमे हुए (शुक्राणु कमजोर पड़ने बफर) aliquots पहले गला लें और संतुलित करने के लिए, उच्च गति और बर्फ पर निकालने जगह का _{पिघलना} है, और एक 100mm MgCl 2 समाधान तैयार.
   4. बाहर वें जाओई agarose इंजेक्शन व्यंजन और एमएमआर / Ficoll समाधान के साथ भरने, और सेट अप और जलसेक पंप पूर्व चलाने के प्रवाह को स्थिर.
   5. जाँच करें कि महिला मेंढ़कों बिछाने और अंडे उच्च गुणवत्ता के हैं. बेहतर, अंडे एक फर्म प्रांतस्था (de-jellying के बाद आकार धारण).
3. एक transgenesis प्रतिक्रिया सेट करें:
   1. बहुत धीरे (काटा विंदुक टिप का उपयोग) नाभिक शेयर मिश्रण और एक 1.5mL Eppendorf ट्यूब में गठबंधन:
      4μl नाभिक (~ 4 8x10 ⁵ नाभिक)
      2μl linearized प्लाज्मिड (100ng/μl)
      कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं.
   2. जबकि ऊष्मायन आगे बढ़ रहा है, प्रतिबंध एंजाइम की 4.5μl एच ₂ हे 0.5μl पतला और SDB 18μl, ₂ MgCl के 2μl और उच्च गति निकालने के 2μl पतला एंजाइम की 1μl जोड़ने. नाभिक - प्लाज्मिड प्रतिक्रिया करने के लिए इस मिश्रण जोड़ें. 10 मिनट सेते नाभिक प्रफुल्लित करने के लिए.
   3. इस ऊष्मायन के दौरान, सिस्टीन समाधान में 2-3 और मेंढ़कों डे जेली से अंडे निचोड़. उन्हें अच्छी तरह से धो (5X) 1XMMR के साथ, और एक व्यापक बोर पिपेट का उपयोग करने के लिए प्रत्येक agarose अच्छी तरह 0.2X MMR 4% Ficoll युक्त डिश के लिए 400-500 dejellied अंडे हस्तांतरण. यह आमतौर पर के बारे में 10 मिनट है, तो एक बार अंडे व्यंजन प्रतिक्रिया तैयार कर रहे हैं आमतौर पर कमजोर करने के लिए तैयार लेता है.
   4. लगभग 15-20 मिनट के कदम को शुरू करने के बाद, धीरे से काटा गया एक टिप के साथ प्रतिक्रिया (नाभिक / निकालने / डीएनए) मिश्रण और कमरे के तापमान पर के बारे में 5μl के लिए 150 μl SDB जोड़ने. इस पतला मिश्रण में नाभिक 1hr के बारे में. लिए स्थिर रहे हैं, जबकि वे लंबे समय के रूप में प्रत्यारोपण क्षमता नहीं रख जब केंद्रित मिश्रण में छोड़ दिया.
4. सुई लोड: पतला ऊपर एक विस्तृत छिद्र विंदुक टिप के साथ बहुत धीरे से तैयार प्रतिक्रिया मिक्स, तो सुई तुरंत लोड के रूप में नाभिक तेजी से ट्यूब में आदी हो जाएगा. Backload सुई करने के लिए, एक काटा 200μl विंदुक टिप के अंत पर ठीक Tygon टयूबिंग की एक टुकड़ा जगह है. विंदुक टिप में समाधान ड्रा करने के लिए, तो सुई के लिए टयूबिंग देते हैं और समाधान के लिए गंभीरता से सुई में प्रवेश करने के लिए अनुमति देते हैं या धीरे विंदुक सवार निराशाजनक.
5. सुई संलग्न करने के लिए पंप टयूबिंग और नाभिक के प्रत्यारोपण शुरू. इंजेक्शन तेजी उथले, और लगभग अंडे के प्लाज्मा झिल्ली को सीधा नुकसान कर से बचने के किया जाना चाहिए. प्रवाह सुझाव दिया (10nl/sec) की दर में, ~ 0.5 सेकंड के लिए अंडे में सुई रहते हैं. आप 20-30 मिनट के भीतर प्रत्यारोपण के 1-2 व्यंजन पूरा करना चाहिए.

इंजेक्शन के बाद, 16-20 ° सी में बर्तन छोड़ जब तक भ्रूण 4-8 सेल चरण तक पहुँच चुके हैं. Cleaving भ्रूण 0.2XMMR 4% Ficoll के एक ताजा बड़ी डिश के लिए स्थानांतरित (एक टिप एक अंडे के रूप में लगभग एक ही व्यास के साथ एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ) द्वारा उनके गैर cleaving पड़ोसियों से दूर क्रमबद्ध करें. छोटे समूहों (/ 6 अच्छी तरह से एक थाली की अच्छी तरह से 10-15 भ्रूण) संस्कृति और 0.2XMMR में (कोई Ficoll) प्रारंभिक विकास के माध्यम से 100 / μg एमएल gentamicin में cleaving भ्रूण प्रतिभाग करना. भ्रूण gastrulation के दौरान जाँच की जानी चाहिए के साथ किसी भी मर भ्रूण तुरंत हटा दिया है और बदले मीडिया के रूप में की जरूरत है.

समस्या निवारण:

1. सुई अवरुद्ध है: सुई से समाधान प्रवाह प्रत्यारोपण के दौरान स्पष्ट किया जाना चाहिए. अगर सुई दिखाई बात कण द्वारा अवरुद्ध हो जाता है, सुइयों को बदलने के लिए या संदंश के साथ टिप कतरन और सुई के माध्यम से समाधान धक्का द्वारा मलबा हटाने की कोशिश.
2. कोई cleaving हैं प्राप्त अंडे: चेक कि शुक्राणु नाभिक और इंजेक्शन की मात्रा के dilutions उपयुक्त हैं और सुई प्रत्यारोपण के दौरान अवरुद्ध नहीं था कि. यदि इंजेक्शन की मात्रा बहुत अधिक है, भी अंडे और बदले नहीं हो सकता फोड़ना फीका पड़ा हुआ pigmentation या नुकसान दिखा.
3. कई भ्रूण gastrulation के दौरान मर जाते हैं. कई कारकों भ्रूण अस्तित्व में वृद्धि कर सकते हैं:
   1. तैयारी के दौरान नाभिक और enzymatic प्रतिक्रिया के साथ ध्यान रखना. Decondensed नाभिक नाजुक रहे हैं और समय सारिणी ऊपर का उपयोग प्रत्यारोपित किया जा चाहिए. उन्हें बर्फ पर जगह मत करो.
   2. गुणसूत्र एंजाइम की प्रतिक्रिया और परमाणु हस्तांतरण के दौरान शुक्राणु नाभिक द्वारा निरंतर से नुकसान दोनों transgenesis की आवृत्ति और भ्रूण के सामान्य विकास को प्रभावित करता है. नाभिक के गुणसूत्र क्षति transgenesis की दक्षता को बढ़ाता है, लेकिन नकारात्मक अस्तित्व / सामान्य विकास को प्रभावित करता है. घटाना या एंजाइम ऊष्मायन के दौरान प्रतिबंध एंजाइम omitting सामान्य विकास की दर को बढ़ाने कर सकते हैं लेकिन transgenesis या प्लाज्मिड प्रति भ्रूण जीनोम में शुरू की संख्या की आवृत्ति कम हो सकती है.
   3. यदि गेसट्रुला भ्रूण के माध्यम से देर ब्लासटुला मलिनकिरण या कोशिका मृत्यु के लक्षण दिखाने के लिए यह भी संभव है कि एक प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल अभिकर्मक अंडे को विषाक्त था. इसके अलावा, यदि अंडेएस एक फर्म प्रांतस्था नहीं है, वे exogastrulation गुजरना और सामान्य के बाद गेसट्रुला भ्रूण उत्पन्न करने के लिए असफल हो सकता है.
4. transgene व्यक्त भ्रूण की संख्या कम है. प्रतिबंध एंजाइम की मात्रा बढ़ाएँ.

प्रतिनिधि ट्रांसजेनिक भ्रूण परिणाम

ट्रांसजेनिक परमाणु हस्तांतरण से परिणामस्वरूप भ्रूण जब तक ब्याज के प्रमोटर से अभिव्यक्ति दिख रहा है उठाया जाना चाहिए. ऊपर एक चित्र में, एक मांसपेशी actin के प्रमोटर इस ट्रांसजेनिक मेढक का डिंभकीट के somites में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव.

Discussion

प्रत्येक ट्रांसजेनिक निर्माण का परीक्षण किया जा करने के लिए, हम आम तौर पर 500-1000 अंडे में नाभिक प्रत्यारोपण, इस पैमाने पर, हम ट्रांसजेनिक प्रति दिन 10 अलग constructs व्यक्त भ्रूण उत्पन्न, कितने मादा अंडे देना करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं पर निर्भर करता है सकते हैं. इन प्रत्यारोपण, अंडे फोड़ना के बारे में एक तिहाई और इन cleaving भ्रूण की 60-80% gastrulation के माध्यम से सामान्य रूप से आगे बढ़ना. प्रतिक्रिया इस्तेमाल किया स्थितियों पर इन भ्रूण के 10-50% के बीच, निर्भर करता है ब्याज की transgene व्यक्त. इसलिए, एक बार इस प्रक्रिया को प्रयोगशाला में स्थापित है, यह संभव है के लिए एक कार्यकर्ता ट्रांसजेनिक एक ही दिन में अलग plasmids के एक नंबर व्यक्त भ्रूण की आबादी को बनाने के लिए. Transgenes एक concatemer (5-35 प्रतियां) के रूप में जीनोम में एकीकृत है, तो इस विधि का भी उच्च ^(80-90%) आवृत्ति 4 में एक ही भ्रूण के जीनोम में एक से अधिक विभिन्न transgene cointegrate के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

transgenesis यहाँ वर्णित दृष्टिकोण सफलतापूर्वक ब्याज की जीन misexpress, जीन विनियमन अध्ययन, और भ्रूण कि एक मार्कर / ब्याज की कोशिकाओं या संरचनाओं में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (उदाहरण के लिए, ^4-7) व्यक्त उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है है. Transgenes ⁸ germline के माध्यम से प्रचारित किया गया है. अंत में, हालांकि प्रक्रिया Xenopus laevis के साथ उपयोग के लिए प्रदर्शन किया है, यह भी संबंधित द्विगुणित प्रजातियों, ^Xenopus 9 tropicalis में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया गया .

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl). 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

Swinging bucket rotor and centrifuge cheesecloth dissection tools (forceps and scissors) fluorescence microscope funnel gloves hemocytometer needles (26 gauge) paper towels petri dishes (60 mm) pipettes plastic (5 and 10 ml) Pipetman tips (1 ml and 200μl) Syringes (1 ml) tubes (14 ml; Falcon, 2059) tubes microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C. 1 M CaCl2. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

Xenopus laevis females Needles (18 and 26 gauge) Pasteur pipette wide bore Syringes (1 mL) Tubes, microcentrifuge (0.5 mL) Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622) Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3) Beakers for egg collection Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes) 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use Ficoll 10 mg/ml gentamycin (1000X stock) high speed egg extract (see above) 100 MgCl2 10X MMR (see above) Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs) Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above) Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above mineral oil (Sigma, M8410) Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)