Drosophila ( Drosophila ) Dissection des glandes accessoires mâles : une méthode pour isoler les cellules secondaires

Overview

Cette vidéo décrit la dissection des glandes accessoires des mouches mâles et montre un exemple dans lequel la glande isolée sera dissociée en une seule suspension cellulaire.

Protocol

Ce protocole est un extrait d’Immarigeon et coll.,A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).

1. Solutions et préparation des matériaux

1. Préparez les solutions suivantes.
   1. Préparer le sérum complété moyen (SSM) : Le milieu de Drosophila de Schneider complété par un sérum bovin fœtal inactivé à 10 % de chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine.
   2. Préparer des aliquots d’enzyme 1x trypsine (p. ex., trypLE Express Enzyme) et les conserver à température ambiante.
   3. Préparer des aliquots de papain [50 U/mL] (stockés à -20 °C et décongelés une seule fois).
   4. Préparer 1x phosphate tampon salin (PBS, stocké à température ambiante).
2. Préparez plusieurs pointes de pipet arrondies à la flamme pour la dissociation physique des glandes accessoires.
   REMARQUE: Utilisez des conseils de faible rétention pour manipuler les glandes accessoires car elles ont tendance à adhérer au plastique non traité. Le processus d’arrondi des flammes réduit l’ouverture de la pointe et lisse les bords de la pointe. Ceci assure une dissociation efficace après digestion de peptidase sans cisaillé les membranes cellulaires.
   1. Coupez une pointe de 200 μL avec une lame tranchante et passez-la doucement au-dessus d’une flamme pour arrondir sa pointe de sorte que l’ouverture soit plus large mais lisse pour la manipulation pendant l’étape 2.7.
   2. Rétrécir l’ouverture de plusieurs pointes de 1 000 μL en passant l’ouverture de la pointe près d’une flamme pendant moins d’une seconde. Faites pivoter légèrement la pointe pour éviter de trop fondre ou de colmater. Trier les pointes de plus en plus étroites. Cela peut être fait en chronométrant la vitesse de l’aspiration. Essayez de dissocier un échantillon à petite échelle d’GC pour tester l’efficacité des pointes les plus étroites.
      REMARQUE: Ces conseils sont essentiels à l’agitation mécanique. Des pointes de pipet s’arrondissant à la flamme permettent une dissociation complète tout en préservant la viabilité des cellules. En tant que tel, ces pointes sont lavées à fond avec de l’eau à la fin de la procédure de réutilisation. Cela permet une dissociation reproductible au jour le jour.

2. Dissection des glandes accessoires

1. Mettre 20 à 25 drosophiles mâles dans un plat en verre sur la glace.
2. Disséquer 1 mâle en SSM. Enlèvent son appareil reproducteur et dégagez la paire accessoire de glande de tous les autres tissus en dehors du conduit éjaculatoire.
   REMARQUE: Enlever les testicules parce que le sperme libéré peut créer des touffes et perturber le processus de dissociation. Retirez l’ampoule éjaculatoire, ce qui rend la manipulation difficile lorsqu’elle flotte.
3. Avec des forceps, transférer les glandes accessoires dans une plaque de verre remplie de SSM à température ambiante. Répétez les étapes 2.2-2.3 20 fois pour obtenir un lot de 20 paires de glandes en SSM.
   REMARQUE: Ces étapes seront réalisées en 15 à 20 minutes. Les AG devraient sembler sains, et les mouvements périssaltiques de la couche musculaire autour des glandes devraient être visibles. GFP peut être surveillé à l’aide d’un microscope fluorescent.
4. Transférer les glandes accessoires à 1x PBS pour un lavage de 1-2 min à température ambiante.
   REMARQUE: Pour une meilleure dissociation, il est impératif de rincer les glandes avec PBS. La durée de cette étape, cependant, devrait être limitée car les cellules montrent des signes de stress dans PBS ; cellules secondaires dissociées dans PBS gonflent et meurent rapidement.
5. Diluer 20 μL de papain [50 U/mL] en 180 μL d’enzyme trypsine 1x pour obtenir la solution de dissociation (pour monter ou descendre garder 9 μL d’enzyme trypsine et 1 μL de papaïne pour chaque mâle). Avec des forceps, transférez les glandes accessoires à cette solution.
6. Isoler la pointe des glandes accessoires (contenant des cellules secondaires) de la partie proximale. Utilisez des forceps fins pour pincer fermement le milieu d’un lobe glandulaire et couper avec la pointe pointue d’un deuxième forceps. Enlever la partie proximale des glandes accessoires et le conduit éjaculatoire pour améliorer la dissociation et réduire le temps de tri cellulaire.
   REMARQUE: Disséquer la partie distale de 20 paires de glandes prendra 15 à 20 min et la digestion par peptidases commencera donc à température ambiante.
7. Après que tous les bouts de glande aient été disséqués, transférez-les dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pointe spéciale de pipet de 200 μL préparée à l’étape 1.2.1. Il doit être large, arrondi et humide avant de manipuler les glandes.
   REMARQUE: Pour pipet tissu de glande accessoire, les conseils doivent toujours être pré-humides avec la solution appropriée (enzyme de trypsine ou SSM, gardez un tube de chacun à cette fin). Rincez soigneusement les pointes entre les échantillons pour éviter la contamination.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013