Drosophila (olika betydelser) Manlig tillbehörskörteldesektion: En metod för att isolera sekundära celler

Overview

Den här videon beskriver dissekeringen av tillbehörskörtlarna från hanflugor och visar ett exempel där den isolerade körteln kommer att dissocieras till en enda cellupphängning.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Immarigeon et al., Ett FACS-baserat protokoll för att isolera RNA från de sekundära cellerna i Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).

1. Lösningar och materialberedning

1. Förbered följande lösningar.
   1. Prepare Serum Supplemented Medium (SSM): Schneiders Drosophila medium kompletterat med 10% värme inaktiverat fetala nötkreatur serum och 1% Penicillin-Streptomycin.
   2. Förbered alikvoter av 1x trypsinenzym (t.ex. TrypLE Express Enzym) och förvara vid rumstemperatur.
   3. Förbered alikvoter av papain [50 U/ml] (lagras vid -20 °C och tinas endast en gång).
   4. Förbered 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS, lagrad vid rumstemperatur).
2. Förbered flera flamrundade rörspetsar för fysisk dissociation av tillbehörskörtlar.
   OBS: Använd tips med låg retention för hantering av tillbehörskörtlar eftersom de tenderar att hålla sig till obehandlad plast. Flamrundningsprocessen minskar spetsöppningen och jämnar ut spetsens kanter. Detta säkerställer en effektiv dissociation efter peptidas matsmältning utan att savda cellmembranen.
   1. Kapa en 200 μL spets med ett vasst blad och för försiktigt över den över en låga för att runda ut spetsen så att öppningen blir bredare men smidig för hantering under steg 2.7.
   2. Begränsa öppningen av flera 1 000 μL-spetsar genom att passera spetsöppningen nära en låga i mindre än en sekund. Vrid spetsen något för att undvika översmältning eller igensättning. Sortera tipsen från smalare till bredare. Detta kan göras genom att tajma ambitionens hastighet. Försök att skilja ett småskaligt urval av AGs för att testa effektiviteten hos de smalaste tipsen.
      OBS: Dessa tips är kritiska för mekanisk agitation. Flamrundade rörspetsar av hög kvalitet möjliggör fullständig dissociation samtidigt som cellens livskraft bevaras. Som sådan tvättas dessa tips noggrant med vatten i slutet av proceduren för återanvändning. Detta möjliggör dagliga reproducerbara dissociationer.

2. Dissekering av tillbehörskörtlar

1. Lägg 20 till 25 manliga Drosophila i en glasrätt på is.
2. Dissekera 1 hane i SSM. Ta av reproduktionskanalen och rensa tillbehörsparet från alla andra vävnader förutom ejakulatorkanalen.
   OBS: Ta bort testiklar eftersom den frisläppta spermierna kan skapa klumpar och störa dissociationsprocessen. Ta bort ejakulatoriska glödlampan, vilket gör hanteringen svår när den flyter.
3. Överför tillbehörskörtlar till en glasplatta fylld med SSM vid rumstemperatur med tång. Upprepa steg 2.2-2.3 20 gånger för att få ett parti med 20 par körtlar i SSM.
   OBS: Dessa steg kommer att uppnås om 15 till 20 min. AGs bör se friska ut, och muskelskiktet peristaltiska rörelser runt körtlar bör vara synliga. GFP kan övervakas med hjälp av ett fluorescerande mikroskop.
4. Överför tillbehörskörtlar till 1x PBS för en 1-2 minuters tvätt vid rumstemperatur.
   OBS: För bättre dissociation är det absolut nödvändigt att skölja körtlarna med PBS. Varaktigheten av detta steg bör dock begränsas eftersom cellerna visar tecken på stress i PBS; dissocierade sekundära celler i PBS sväller snabbt och dör.
5. Späd 20 μL papain [50 U/ml] i 180 μL 1x trypsinenzym för att erhålla dissociationslösningen (för att skala upp eller ner håll 9 μL trypsinenzym och 1 μL papain för varje hane). Överför tillbehörskörtlar till denna lösning med tång.
6. Isolera spetsen på tillbehörskörtlarna (som innehåller sekundära celler) från den proximala delen. Använd fina tångar för att nypa fast mitten av en körtellob och skär med den skarpa spetsen av en andra tång. Ta bort den proximala delen av tillbehörskörtlarna och den ejakulatoriska kanalen för att förbättra dissociationen och minska cellsorteringstiden.
   OBS: Dissekering av den distala delen från 20 par körtlar tar 15 till 20 min och matsmältningen med peptidaser börjar därmed vid rumstemperatur.
7. När alla körtelspetsar har dissekerats överför du dem till ett 1,5 ml-rör med en speciell rörspets på 200 μL som bereds i steg 1.2.1. Den ska vara bred, rundad och våt innan körtlar tas i bruk.
   OBS: För rörtillbehörskörtelvävnad bör spetsarna alltid vara för våta med lämplig lösning (trypsinenzym eller SSM, håll ett rör av var och en för detta ändamål). Skölj försiktigt spetsarna mellan proverna för att undvika kontaminering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013