Summary
זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR) של DNA של נגיף הפטיטיס B (HBV) היא שיטה רגישה ומדויקת לאבחון וניטור זיהום HBV. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי DNA HBV ומדידת עומס נגיפי של דגימה.
Abstract
נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא גורם משמעותי למחלות כבד ברחבי העולם. זה יכול להוביל לזיהומים חריפים או כרוניים, מה שהופך אנשים רגישים מאוד שחמת קטלנית וסרטן הכבד. זיהוי וכימות מדויקים של DNA HBV בדם חיוניים לאבחון וניטור זיהום HBV. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי DNA HBV היא PCR בזמן אמת, אשר ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הנגיף ולהעריך את העומס הנגיפי כדי לפקח על התגובה לטיפול אנטי ויראלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או פלזמה באמצעות ערכה מבוססת PCR בזמן אמת המסומנת IVD. הערכה משתמשת בפריימרים ובבדיקות המכוונים לאזור הליבה השמור ביותר של גנום HBV ויכולים לכמת במדויק את כל הגנוטיפים של HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I ו-J). הערכה כוללת גם בקרה פנימית אנדוגנית לניטור עיכוב PCR אפשרי. בדיקה זו נמשכת 40 מחזורים, והחיתוך שלה הוא 38 Ct. לכימות DNA HBV בדגימות קליניות, מסופקת ערכה של 5 תקני כימות עם הערכה. התקנים מכילים ריכוזים ידועים של DNA ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). התקנים משמשים לאימות הפונקציונליות של הגברה ספציפית ל- HBV DNA וליצירת עקומה סטנדרטית, המאפשרת לכמת DNA HBV בדגימה. DNA HBV נמוך של 2.5IU/mL זוהה באמצעות ערכת PCR. הרגישות הגבוהה ויכולת השחזור של הערכה הופכות אותה לכלי רב עוצמה במעבדות קליניות, ומסייעת לאנשי מקצוע בתחום הבריאות באבחון וניהול יעיל של זיהומי HBV.
Introduction
נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא נגיף DNA דו-גדילי חלקית מהסוג Orthohepadnavirus וממשפחת Hepadnaviridae 1. זה יכול לעורר זיהום כרוני שנמשך לאורך כל החיים, מה שעלול להוביל שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular 2,3,4. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), אוכלוסייה מוערכת של 296 מיליון אנשים חיו עם זיהום כרוני הפטיטיס B בשנת 2019, ו -1.5 מיליון אנשים נדבקו חדשים מדי שנה5.
זיהוי ומדידה של DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה משמשים כשיטה רבת ערך לאיתור אנשים עם זיהום מתמשך בהפטיטיס B, הערכת יעילות הטיפול האנטי-ויראלי וחיזוי ההסתברות להצלחת הטיפול 6,7,8,9,10,11. עומס נגיפי גבוה קשור לסיכון מוגבר להתקדמות מחלות כבד, כולל שחמת הכבד וסרטן הכבד12,13. לפיכך, מדידה מדויקת של עומס נגיפי היא חיונית למעקב אחר התקדמות זיהום HBV ולקבלת החלטות לגבי הטיפול.
לבדיקות PCR כמותיות בזמן אמת יש רגישות גבוהה יותר, טווח דינמי רחב יותר וכימות מדויק יותר של DNA HBV מאשר טכניקות PCR קונבנציונליות 14,15,16,17. מספר ערכות אבחון מולקולריות מסחריות בזמן אמת מבוססות PCR לכימות DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה זמינות בשוק. במאמר זה אנו מתארים תהליך עבודה מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או בפלזמה באמצעות ערכה מסחרית זמינה מסחרית המבוססת על PCR בזמן אמת. הערכה נמצאת בשימוש נרחב18,19, בעלות נמוכה אך רגישה מאוד, ומאפייני הביצועים שלה דומים לערכות אחרות הזמינות מסחרית עם סימון CE18. מלבד הגברה של אזור היעד HBV, גן בקרה פנימית אנדוגני כלול גם בערכה כדי לאמת את איכות הדגימות, איכות ה- DNA שחולץ, הגברת PCR ועיכוב PCR אפשרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים או דגימות קליניות. החומר הביולוגי היחיד ששימש היה התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). תקן זה הוא חומר עזר הזמין לציבור ואינו מכיל מידע אישי או נתונים הניתנים לזיהוי. כיוון שכך, לא נדרש אישור אתי למחקר זה.
1. מיצוי DNA
- חלצו את הדנ"א הנגיפי מסרום אנושי או מדגימת פלזמה. אחסן את ה- DNA שחולץ ב -20 ° C עד לשימוש נוסף ב- PCR.
הערה: הנפח המומלץ של סרום או פלזמה למיצוי DNA הוא 500 μL, ונפח elution הוא 50 μL. במחקר זה, הדנ"א הנגיפי הופק באמצעות ערכה למיצוי חומצות גרעין נגיפיות (Table of Materials).
2. PCR בזמן אמת
- הפשירו את כל הריאגנטים (טבלה 1) של ערכת ה-PCR בזמן אמת בטמפרטורת החדר (RT; 15-25°C) לפני תחילת בדיקת ה-PCR. לאחר ההפשרה, ערבבו את הרכיבים על ידי מערבולות פולס במשך 10 שניות במהירות בינונית וצנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 שניות ב- RT. שמרו את כל הרכיבים המופשרים על בלוק קירור.
- הכנת תגובה
- הכינו תערובת PCR לפי טבלה 2. חשב את נפח הריאגנטים שיש להוסיף בהתבסס על מספר הדגימות, התקנים וללא בקרת תבנית.
הערה: בעת הכנת תערובת PCR, יש להוסיף לפחות 10% נפח נוסף של כל מגיב (למשל, אם נדרשות 10 תגובות, חשב עבור 11 תגובות). - Pipet 15 μL של תערובת PCR שהוכן לעיל לתוך כל צינור PCR. לאחר מכן, הוסף 15 μL של DNA הדגימה שחולץ. הוסף 15 μL של לפחות אחד התקנים עבור HBV (תקן HBV 1-5) כבקרה חיובית (PC) לגילוי DNA HBV ו- 15 μL של מים נטולי נוקלאז ברמת PCR כבקרה שלילית (NC). כדי ליצור עקומה סטנדרטית הנדרשת לכימות הדנ"א של HBV, השתמש בכל 5 תקני הכימות שסופקו עם הערכה (תקן HBV 1-5) עבור כל ריצת PCR.
- סגור את הצינורות, מערבב את הרכיבים על ידי מערבולת פולס במשך 10 שניות במהירות בינונית, וצנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 15 שניות ב- RT לפני שתמשיך למחזור התרמי. ודא שאין בועות בתמהיל התגובה, מכיוון שהוא עלול להפריע לזיהוי פלואורסצנטי.
- הכינו תערובת PCR לפי טבלה 2. חשב את נפח הריאגנטים שיש להוסיף בהתבסס על מספר הדגימות, התקנים וללא בקרת תבנית.
- הגדרת התוכנית
- תכנת את המחזור התרמי לפי תנאי הרכיבה כמומלץ בטבלה 3.
- בחירת ערוץ/פלואורופור
- בחר את הצבעים הפלואורסצנטיים עבור פלטפורמות PCR נפוצות בזמן אמת, כפי שמוזכר בטבלה 4.
- ניתוח נתונים
- לאחר השלמת הריצה, נתח את תרשים ההגברה בקנה מידה ליניארי.
- הגדרת סף
- הגדר את הסף בתוך השלב המעריכי של תגובת PCR. ערכי סף מומלצים עבור הערכה מוזכרים בטבלה 5. היו עקביים עם הגדרת הסף. לאחר קביעת הסף האופטימלי לבדיקה, השתמש בו באופן עקבי עבור כל הדגימות עבור מכשיר PCR מסוים. זה יעזור להבטיח כי התוצאות מדויקות לשחזור.
הערה: אם הסף מוגדר נמוך מדי, ייתכן שהאות נמוך מרמת הרעש וערך ה- Ct לא יהיה אמין. אם הסף מוגדר גבוה מדי, האות עשוי להיות בשלב המישור של התגובה, שבו ההגברה אינה יעילה, וערך ה- Ct עשוי להיות לא מדויק.
- הגדר את הסף בתוך השלב המעריכי של תגובת PCR. ערכי סף מומלצים עבור הערכה מוזכרים בטבלה 5. היו עקביים עם הגדרת הסף. לאחר קביעת הסף האופטימלי לבדיקה, השתמש בו באופן עקבי עבור כל הדגימות עבור מכשיר PCR מסוים. זה יעזור להבטיח כי התוצאות מדויקות לשחזור.
- חיתוך
- הפעל את הערכה במשך 40 מחזורי הגברה. אין להתייחס לשום הגברה מעבר ל-38 מחזורים לכל פרשנות.
- ניתוח תוצאות איכותי
- השתמש בערכה לזיהוי איכותי של DNA HBV. השתמש בתקן 2 כמחשב עם ערכי Ct צפויים של 20 ± 2 עבור HBV ו- 24 ± 3 עבור IC.
- ודא שאף פקד תבנית (NTC) אינו מציג הגברה הן עבור HBV והן עבור מטרות בקרה פנימית (IC). אם מתרחשת תגובת הגברה בתגובת NTC, ייתכן שהתרחש זיהום דגימה.
- מכיוון שסף הבדיקה הוא 38, שקול כל הגברה לפני 38 Ct עבור יעד HBV כמדגם חיובי ל- HBV. כאשר כל הבקרות עומדות בדרישות שצוינו לעיל, שקול דגימה בהתאם לפרשנויות המוזכרות בטבלה 6.
- ניתוח תוצאות כמותי
- השתמש בקבוצה של 5 תקני כימות של ריכוזים ידועים עבור דנ"א ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומי הרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA עבור טכניקות הגברה של חומצות גרעין (NAT)20 (טבלה 7).
- השתמש בתקנים אלה כדי ליצור עקומת תקן. השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לכמת את הדנ"א HBV של דגימה לא ידועה.
הערה: תוכנת ה-PCR בזמן אמת תיצור עקומה סטנדרטית באמצעות ערכי Ct המתקבלים עבור יעדי HBV של כל 5 התקנים והריכוזים המתאימים להם ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL). - לפרש את הערכים עבור דגימות לא ידועות רק אם שיפוע התקנים נופל בין -3.1 ל -3.6, ערך R2 הוא בין 0.99 ל -1.0, יעילות PCR היא בין 90%-110% (0.9-1.1), ואין הגברה בבקרה השלילית.
- התוכנה תחשב את הריכוז של כל דגימה חיובית HBV ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL). כדי לחשב את העומס הנגיפי (המרה של IU/μL ליחידות בינלאומיות למיליליטר [IU/mL]), השתמש במשוואה הבאה:
תוצאה (IU/mL) = (תוצאה [IU/μL] x נפח Elution [μL])/ נפח דגימה (mL)
הערה: התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA, NIBSC code 10/266, הופק לטיהור DNA נגיפי מפלזמה של 0.5 מ"ל, דילל את ה- DNA הנגיפי המטוהר ל- 50 μL של מאגר אלוציה ושימש עם ערכת ה- PCR כדגימת ייחוס יחד עם 5 תקני HBV ו- NTC. העומס הנגיפי HBV של דגימת הייחוס (קוד NIBSC 10/266) חושב כ- (6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 מ"ל = 6,65,900 IU/mL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דיאגרמה סכמטית של תהליך העבודה לזיהוי וכימות דנ"א HBV מפלזמה/סרום אנושי מוצגת באיור 1. תרשים הגברה של תקן 2 (המשמש כמחשב) ו-NTC עבור HBV ו-IC מוצג באיור 2. איור 3 מראה את עקומות ההגברה עבור דגימה חיובית ל-HBV, דגימה שלילית ל-HBV ודגימה עם עיכוב PCR. עקומת ההגברה, ערך Ct עבור HBV, וריכוז HBV המתקבל ביחידות בינלאומיות למיקרוליטר (IU/μL) עבור קוד NIBSC 10/266 מוצגים באיור 4. עקומות הגברה עבור יעד HBV של כל 5 תקני HBV של הערכה ועקומת תקן מייצגת עבור אותו הדבר מוצגות באיור 5. שיפוע העקומה הסטנדרטית הוא -3.361, R2 הוא 0.99996, והיעילות היא 0.98. עקומות הגברה עבור יעד IC של כל 5 תקני HBV מוצגות באיור 6.
איור 1: דיאגרמה סכמטית של תהליך העבודה כדי לזהות ולכמת דנ"א HBV מדגימות פלזמה/סרום אנושיות. חלץ DNA נגיפי מדגימת סרום / פלזמה אנושית של אדם החשוד ב- HBV. הכן את תמהיל ה- PCR על ידי הוספת כל רכיב PCR למעט ה- DNA / תקני התבנית. יש לפזר אותו לצינורות / בארות PCR. הוסף את ה- DNA הנגיפי / התקנים שחולצו כ- DNA של התבנית, וסגור את צינורות ה- PCR. טען אותו למכונת PCR בזמן אמת, התחל את ריצת ה- PCR ונתח את התוצאה לאחר סיום הריצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים הגברה של תקן 2 (המשמש כמחשב) ו-NTC. תרשים הגברה של תקן HBV 2 מוצג כאן הן עבור מטרות HBV והן עבור IC. עבור ניתוח תוצאות איכותני, תקן 2 יכול לשמש כבקרה חיובית. עבור NTC, לא נצפתה הגברה לאף אחת מהמטרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תרשימי הגברה עבור דגימה חיובית של HBV, דגימה שלילית של HBV ודגימה עם עיכוב PCR. תרשים הגברה עבור שלוש דגימות שונות: HBV חיובי (מקרה 1), HBV שלילי (מקרה 2), ומדגם המכיל מעכבי PCR (מקרה 3) מוצגים כאן. במקרה של הדגימה החיובית של HBV, שתי המטרות מוגברות, בעוד שרק IC הוגבר עבור הדגימה השלילית של HBV, ולא נצפתה הגברה עבור יעד HBV כצפוי. לא HBV ולא IC הוגברו עבור מקרה 3, כלומר עיכוב PCR התרחש עקב מעכבי PCR הנמצאים בדגימת ה- DNA המשמשת כתבנית PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עקומת הגברה, ערך Ct עבור HBV, וריכוז HBV מתקבל (IU/μL) עבור קוד NIBSC 10/266. DNA נגיפי שחולץ של קוד NIBSC 10/266 הופעל יחד עם 5 תקני HBV ו- NTC. עקומת ההגברה עבור יעד HBV מוצגת עבור דוגמת קוד NIBSC 10/266 בלוח העליון. ערך ה-Ct שלו עבור HBV הוא 18.94, והריכוז המחושב הוא 6659 IU/μL, המוצג בלוח התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: עקומות הגברה עבור יעד HBV של כל 5 תקני HBV ועקומת התקן. עקומות הגברה עבור יעד HBV (ערוץ ירוק) של כל 5 תקני HBV מוצגות בלוח העליון. עקומה סטנדרטית יחד עם השיפוע שלה (3.361), ערך R2 (0.99996) ויעילות PCR (0.98) מוצגים בלוח התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: עקומות הגברה עבור יעד IC של כל 5 תקני HBV. עקומות הגברה של 5 תקני HBV עבור IC (ערוץ צהוב) מוצגות כאן. כצפוי, הם נראים אותו דבר עם ערכי Ct דומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: עקומות ההגברה עבור יעד HBV של כל 5 תקני HBV ו-NTC הופעלו בשילוש. תרשימי ההגברה של שלושה עותקים משוכפלים עבור יעד HBV (ערוץ ירוק) של 5 תקני HBV מראים תוצאות דומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: עקומות הגברה עבור יעד HBV של קוד NIBSC 10/266, קוד NIBSC 14/198, וחמשת הדילולים שלו. עקומות ההגברה עבור יעד HBV (ערוץ ירוק) של דגימות הייחוס קוד NIBSC 10/266, קוד NIBSC 14/198, וחמשת הדילולים שלו (1.25 IU/mL, 2.5 IU/mL, 5 IU/mL, 25 IU/mL ו- 50 IU/mL) מוצגים כאן. לא זוהתה הגברה עבור 1.25 IU/mL, בעוד דילולים אחרים הראו עקומות הגברה תקינות לפני 38 Ct. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מגיב | תיאור |
| תערובת מאסטר מולטיפלקס | מאגר PCR, Hot Start Taq DNA polymerase ורכיבי PCR אחרים |
| תערובת בדיקות פריימר HBV | פריימרים ותמהיל בדיקות לזיהוי HBV |
| תערובת בדיקות פריימר IC אנדוגנית | פריימרים ותמהיל בדיקה לזיהוי בקרה פנימית אנדוגנית (IC) |
| תקנים עבור HBV | · חדר HBV סטנדרט 1 |
| · תקן HBV 2 | |
| · תקן HBV 3 | |
| · תקן HBV 4 | |
| · תקן HBV 5 | |
| שליטה שלילית | מים ללא נוקלאז בדרגת PCR |
טבלה 1: ריאגנטים שסופקו עם ערכת PCR בזמן אמת ותיאורם
| מגיב | נפח לכל תגובה |
| תערובת מאסטר מולטיפלקס | 11 מיקרוליטר |
| תערובת בדיקות פריימר HBV | 2 μL |
| תערובת בדיקות פריימר IC אנדוגנית | 2 μL |
| נפח התגובה הכולל | 15 מיקרוליטר |
טבלה 2: נפח כל מגיב שיש להוסיף לכל תגובה להכנת תערובת PCR
| צעד | טמפרטורה (°С) | זמן | איסוף נתונים | מחזורים |
| דנטורציה ראשונית | 94 | 10 דק' | - | 1 |
| רכיבת PCR | 94 | 15 שניות | - | 40 |
| 55 | 60 שניות | הלאה | ||
| 72 | 15 שניות | - |
טבלה 3: תנאי מחזור PCR
| יעד | רוטור-גן Q* | CFX 96 | ABI PCR# בזמן אמת |
| HBV | ירוק | FAM | FAM |
| IC | צהוב | הקס | ויק |
| *הגדרת מיטוב רווח אוטומטי - בחר 'בצע מיטוב לפני רכישה ראשונה' | |||
| #רק עבור מכונות PCR בזמן אמת של אפלייד ביוסיסטמס, בחרו ROX כצבע 'ייחוס פסיבי' במהלך הגדרת הצלחת, מכיוון שתערובת האב של הערכה מכילה ROX | |||
טבלה 4: בחירת צבע עבור פלטפורמות PCR שונות בזמן אמת
| מכשיר PCR בזמן אמת | צבעים | טווח ערכי סף§ |
| ABI PCR בזמן אמת¶ | FAM | 0.2–0.25 |
| ויק | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| הקס | 50–400 | |
| רוטור-גן Q | ירוק | 0.015–0.03 |
| צהוב | 0.01–0.02 | |
| §ערך סף מוחלט משתנה ממכשיר למכשיר בהתאם לגיל המכשיר, הדגם ומצב הכיול | ||
| ¶ערכי סף אלה ישימים כאשר ROX נבחר כצבע 'ייחוס פסיבי' | ||
| †הפלואורסצנטיות היחסית גדלה בערך פי 2 עד פי 5 כאשר משתמשים בצינורות PCR לבנים של Bio-Rad במקום בצינורות שקופים. לכן, יש לקבוע את ערך הסף בהתאם | ||
טבלה 5: ערכי סף מומלצים עבור פלטפורמות PCR שונות בזמן אמת
| סוג דוגמה | מזוודה | אות הגברה ב | פרשנות התוצאה | |||
| FAM/ירוק | HEX/VIC/צהוב | |||||
| לשלוט | 2/PC סטנדרטי | כן (20 ± 2) | כן (24 ± 3) | מחשב סטנדרטי 2/PC פועל כראוי | ||
| NTC | לא | לא | NTC פועל כראוי | |||
| לדוגמה | 1 | כן | כן / לא* | זוהה DNA ספציפי ל-HBV | ||
| 2 | לא | כן | DNA ספציפי ל- HBV לא זוהה. הדגימה אינה מכילה כמות ניתנת לזיהוי של DNA ספציפי ל-HBV | |||
| 3 | לא | לא | עיכוב אפשרי של PCR, לדלל את דגימת ה- DNA (1:10) / לחלץ מחדש DNA מהדגימה המקורית ולחזור על PCR | |||
| *זיהוי הבקרה הפנימית אינו נדרש כאשר יעד HBV מזוהה. עומס DNA HBV גבוה בדגימה יכול להוביל להפחתה או היעדר אות בקרה פנימית | ||||||
טבלה 6: פענוח תוצאות של מעכבי PCR חיוביים, שליליים המכילים דגימות באיכות ירודה
| תקן | ריכוז (IU/μl) | Ct הרצוי | |
| HBV | IC | ||
| (FAM / ירוק) | (הקס/ויק/צהוב) | ||
| חדר HBV סטנדרט 1 | 5 X 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| תקן HBV 2 | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| תקן HBV 3 | 5 X 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| תקן HBV 4 | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| תקן HBV 5 | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
טבלה 7: תקני HBV וריכוזם של יעד HBV וערכי Ct רצויים
| לדוגמה | צפוי Ct | השיג Ct עבור HBV | ממוצע Ct | סטיית תקן | קורות חיים % | ||
| שכפול 1 | שכפול 2 | שכפול 3 | |||||
| חדר HBV סטנדרט 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| תקן HBV 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| תקן HBV 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| תקן HBV 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| תקן HBV 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
טבלה 8: ערכי Ct מתקבלים, ממוצע, סטיית תקן ומקדם שונות (CV%) של 5 תקני HBV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קוד NIBSC 10/266 הוקצה ליחידה של 9,55,000 IU/mL כאשר הוא מורכב מחדש ב- 0.5 מ"ל של מים ללא Nuclease בהתאם למידע הספק21. זה יכול להיחשב מדגם חיובי HBV עומס גבוה. העומס הנגיפי של HBV שנקבע על-ידי ערכת העומס הנגיפי ששימשה במחקר זה היה 6,65,900 IU/mL (איור 4). מכיוון שיעילות מיצוי הדנ"א של כל ערכת מיצוי דנ"א אינה 100%, חלק מהדנ"א אובד לעתים קרובות במהלך תהליך הטיהור. למרות שהעומס הנגיפי שנקבע על ידי הערכה נמוך מעט מהערך שהוקצה לספק מגיב (קוד NIBSC 10/266), עדיין הנתונים משביעי רצון מכיוון שההפרש log10 בין שני הערכים הוא רק 0.157 שהוא פחות מערך החיתוך (0.5)22.
ערכת העומס הנגיפי המשמשת בפרוטוקול זה חזקה מאוד ומספקת נתונים הניתנים לשחזור, כפי שמוצג באיור 7. בניסוי זה, כל 5 התקנים וה-NTC הופעלו בשלשה, וערכי ה-Ct שלהם, הממוצע, סטיית התקן ומקדם השונות שלהם (CV%) מוצגים בטבלה 8. CV% נמוך יותר של פחות מ-1%, כפי שצוין בטבלה 8, מצביע על כך שהניסוי אמין יותר ומפיק תוצאות מדויקות ביותר.
מדגם ייחוס בעומס נמוך מאוד (קוד NIBSC: 14/198)23 שימש עם הערכה כדי לבדוק את LoD שלה. קוד NIBSC 14/198 מכיל פחות מ- 50 IU/mL של DNA HBV לפי פרטי הספק. DNA הופק מקוד NIBSC 14/198, והוכן דילולים מרובים (1.25 IU/mL, 2.5 IU/mL, 5IU/mL ו-25 IU/mL) של ה-DNA. הערכה השתמשה בכל הדילולים וב-5 תקני HBV כדנ"א של תבנית. נצפה כי ערכה זו יכולה לזהות את כל הדילולים עד 2.5 IU/mL של דנ"א HBV (איור 8), והיא תואמת בדיוק את LoD של ערכת העומס הנגיפי. לפיכך, ערכת העומס הנגיפי היא כלי רגיש ביותר וניתן לשחזור שמעבדות אבחון מולקולריות יכולות להשתמש בו כדי לסייע לאנשי מקצוע בתחום הבריאות באבחון וניהול יעיל של זיהומי HBV.
על המשתמשים לזכור את השלבים הקריטיים הבאים בעת ביצוע ההליך. המשתמשים חייבים להשתמש רק ב- DNA מופק באיכות גבוהה כתבנית PCR כדי להבטיח תוצאות מדויקות. חשוב להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים (לא יותר מ-3 פעמים) של הריאגנטים. תערובת ה- PCR לא צריכה להיות חשופה לאור במשך זמן רב מכיוון שהיא מכילה את הבדיקה הפלואורסצנטית הרגישה לאור ואת צבע הייחוס הפסיבי ROX. חשוב תמיד לא לכלול בקרת תבניות ותקנים בכל ריצה כדי להבטיח את הדיוק והאמינות של התוצאות. פיפטות מכוילות עם קצוות מסוננים סטריליים יש להשתמש תמיד. יש להוסיף את הדנ"א והתקנים של התבנית באזור נפרד עם פיפטה שונה מאזור הכנת התגובה כדי למנוע זיהום צולב.
להלן כמה עצות נפוצות לפתרון בעיות לזיהוי מבוסס PCR בזמן אמת וכימות של DNA של נגיף הפטיטיס B. אות הגברה בבקרה שלילית עלול להתרחש עקב זיהום צולב במהלך הגדרת התגובה. לכן, המשתמש צריך לבדוק זיהום של רכיבי הערכה. לא עלול להתרחש אות הגברה עם תקנים עקב הסיבות הבאות: (i) נעשה שימוש בתערובת PCR שגויה. על המשתמש לבדוק אם כל הרכיבים נוספו כראוי או לא. (ii) שימוש בריאגנטים שפג תוקפם. על המשתמש לבדוק את תאריך התפוגה לפני הגדרת התגובה. (iii) אחסון לא תקין של ריאגנטים. ודא שהריאגנטים מאוחסנים בטמפרטורה של -20°C ומטה, ולא נשמרים בטמפרטורת החדר במשך זמן רב במהלך הגדרת התגובה. (iv) נעשה שימוש במצב מחזור PCR שגוי. במקרה כזה, מומלץ לחזור על ה- PCR עם התוכנית הנכונה. (iv) אות חלש או ללא אות של הבקרה הפנימית עבור דגימות עלול להתרחש עקב עומס HBV גבוה בדגימה ועיכוב PCR. המשתמש יכול לדלל את דגימת הדנ"א (1:10) ולחזור על הבדיקה עבור עומס HBV גבוה בדגימה. במקרה של עיכוב PCR, יש לחלץ מחדש את ה- DNA של הדגימה עם ריאגנטים באיכות טובה, ויש לחזור על הבדיקה.
זיהוי וכימות מבוססי PCR בזמן אמת של DNA של נגיף הפטיטיס B היא טכניקה רגישה וספציפית מאוד, אך יש לה כמה מגבלות כמו עלות ומורכבות. מכשירי PCR בזמן אמת וריאגנטים יכולים להיות יקרים, ועלות הבדיקה יכולה להוות חסם עבור חלק מהחולים ומערכות הבריאות. PCR בזמן אמת היא טכניקה מורכבת הדורשת כוח אדם מיומן לבצע את הבדיקה ולפרש את התוצאות. זוהי מדידה עקיפה של העומס הנגיפי, ולכן הן איכות התקנים והן DNA התבנית עשויים להשפיע על התוצאה. גנוטיפ חדש של HBV ו / או מוטציה (ים) באזור הבדיקה הראשונית עלול להוביל לתוצאות שליליות שגויות.
זיהוי וכימות מבוססי PCR בזמן אמת של DNA HBV היא שיטה רגישה וספציפית ביותר שיכולה לזהות רמות נמוכות של DNA נגיפי. בהשוואה לשיטות אחרות כמו בדיקות סרולוגיות (ELISA ובדיקת זרימה רוחבית), ל- PCR בזמן אמת יש מספר יתרונות. ראשית, הוא רגיש יותר מהבדיקות הסרולוגיות. שנית, הוא יכול לכמת את כמות הדנ"א HBV הקיים בדגימה, בעוד שבדיקות סרולוגיות יכולות לספק תוצאה איכותית בלבד. לבסוף, PCR בזמן אמת נוטה פחות לתוצאות חיוביות כוזבות מאשר הבדיקות הסרולוגיות24. בסך הכל, PCR בזמן אמת היא השיטה הרגישה, הספציפית והכמותית ביותר הזמינה לזיהוי וכימות של DNA HBV. זוהי גם טכניקה מהירה יחסית, מה שהופך אותה לאידיאלית לשימוש קליני.
זיהוי וכימות מבוסס PCR בזמן אמת של DNA של נגיף הפטיטיס B הוא כלי רב עוצמה עם מספר יישומים עתידיים, כולל פיתוח טיפולים אנטי-ויראליים חדשים ובדיקות נקודת טיפול. הטכניקה יכולה לשמש לסינון תרופות אנטי-ויראליות חדשות ולמעקב אחר יעילותן בניסויים קליניים. זה יכול להוביל לפיתוח טיפולים יעילים יותר ורעילים פחות לזיהום HBV. מכשירי PCR בזמן אמת הופכים קטנים וניידים יותר, מה שמאפשר לבצע בדיקות עומס נגיפי HBV בנקודת הטיפול. זה יכול לשפר את הגישה לבדיקות ולהוביל לאבחון מוקדם יותר וטיפול בזיהום HBV. ניתן להתאים את העוצרים של ערכה מבוססת PCR בזמן אמת זו עם PCR דיגיטלי לכימות מוחלט לניטור מדויק יותר של עומס הבקבוקון.
בנוסף ליישומים ספציפיים אלה, זיהוי וכימות מבוססי PCR בזמן אמת של DNA HBV עשויים למלא תפקיד חשוב במחקר ופיתוח של כלים ואסטרטגיות חדשות למניעה, אבחון וטיפול בזיהום HBV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים קשורים לחברת Kilpest India Limited, יצרנית ערכת העומס הנגיפי HBV ששימשה במחקר זה.
Acknowledgments
אנו מודים לפראבין, קוסום, צ'נדאן, אישה, רשמי, בבלי, שיבני, אנקיטה ושייקה על עזרתם הטכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
