Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكشف القائم على تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي والقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B

Published: December 15, 2023 doi: 10.3791/66249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
13B BlackBio Biotech India Limited

Summary

يعد الكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B (HBV) القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتحديده الكمي في الوقت الفعلي طريقة حساسة ودقيقة لتشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B ورصدها. هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياس الحمل الفيروسي للعينة.

Abstract

فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو سبب مهم لأمراض الكبد في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي إلى التهابات حادة أو مزمنة ، مما يجعل الأفراد عرضة للإصابة بتليف الكبد القاتل وسرطان الكبد. يعد الكشف الدقيق عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في الدم وقياسه أمرا ضروريا لتشخيص ومراقبة عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B هي تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، والذي يمكن استخدامه للكشف عن الفيروس وتقييم الحمل الفيروسي لمراقبة الاستجابة للعلاج المضاد للفيروسات. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في المصل البشري أو البلازما باستخدام مجموعة تستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تحمل علامة IVD. تستخدم المجموعة البادئات والمجسات التي تستهدف المنطقة الأساسية المحفوظة للغاية لجينوم HBV ويمكنها تحديد جميع الأنماط الجينية HBV بدقة (A ، B ، C ، D ، E ، F ، G ، H ، I ، و J). تتضمن المجموعة أيضا تحكما داخليا داخليا لمراقبة تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل. يعمل هذا الفحص لمدة 40 دورة ، وقطعه هو 38 قيراطا. لتحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينات السريرية ، يتم توفير مجموعة من 5 معايير قياس كمي مع المجموعة. تحتوي المعايير على تركيزات معروفة من الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B والتي تمت معايرتها وفقا لمعيارمنظمة الصحة العالمية الدولي الرابع للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لاختبار الحمض النووي (رمز NIBSC 10/266). تستخدم المعايير للتحقق من صحة وظائف تضخيم الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B ولإنشاء منحنى قياسي ، مما يسمح بالقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في العينة. تم الكشف عن الحمض النووي HBV منخفض يصل إلى 2.5 وحدة دولية / مل باستخدام مجموعة PCR. إن الحساسية العالية وقابلية التكرار للمجموعة تجعلها أداة قوية في المختبرات السريرية ، مما يساعد المتخصصين في الرعاية الصحية في تشخيص عدوى فيروس التهاب الكبد B وإدارتها بشكل فعال.

Introduction

فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو فيروس DNA مزدوج تقطعت به السبل جزئيا من جنس Orthohepadnavirus وعائلة Hepadnaviridae 1. يمكن أن يؤدي إلى عدوى مزمنة تستمر طوال حياة المرء ، مما قد يؤدي إلى تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية2،3،4. وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، كان ما يقدر بنحو 296 مليون شخص يعيشون مع عدوى التهاب الكبد B المزمن في عام 2019 ، وأصيب 1.5 مليون شخص حديثا كلعام 5.

يعد تحديد وقياس الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في عينات المصل أو البلازما بمثابة طريقة قيمة للكشف عن الأفراد المصابين بعدوى التهاب الكبد B المستمرة ، وتقييم فعالية العلاج المضاد للفيروسات ، والتنبؤ باحتمال نجاح العلاج6،7،8،9،10،11. يرتبط الحمل الفيروسي المرتفع بزيادة خطر الإصابة بأمراض الكبد ، بما في ذلك تليف الكبد وسرطان الكبد12,13. وبالتالي ، فإن القياس الدقيق للحمل الفيروسي أمر بالغ الأهمية لتتبع تطور عدوى فيروس التهاب الكبد B وإبلاغ القرارات المتعلقة بالعلاج.

تتميز فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية في الوقت الفعلي بحساسية أعلى ونطاق ديناميكي أوسع وتقدير كمي أكثر دقة للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B مقارنة بتقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية14،15،16،17. تتوفر في السوق العديد من مجموعات التشخيص الجزيئي التجارية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B في عينات المصل أو البلازما. هنا ، نصف سير عمل مفصل للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في المصل البشري أو البلازما باستخدام مجموعة PCR في الوقت الفعلي المتاحة تجاريا والتي تحمل علامة IVD. المجموعة عبارة عناختبار 18,19 مستخدم على نطاق واسع ، منخفض التكلفة ، ولكنه حساس للغاية ، وخصائص أدائه قابلة للمقارنة مع مجموعة (مجموعات) أخرى تحمل علامة CE المتاحة تجاريا 18. بصرف النظر عن تضخيم المنطقة المستهدفة لفيروس التهاب الكبد B ، يتم أيضا تضمين جين تحكم داخلي داخلي في المجموعة للتحقق من جودة العينات وجودة الحمض النووي المستخرج وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل المحتمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

لم تشمل هذه الدراسة أي مشاركين بشريين أو عينات سريرية. كانت المادة البيولوجية الوحيدة المستخدمة هي المعيار الدولي الرابعلمنظمة الصحة العالمية للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لاختبار الحمض النووي (رمز NIBSC 10/266). هذا المعيار هو مادة مرجعية متاحة للجمهور لا تحتوي على أي معلومات شخصية أو بيانات يمكن التعرف عليها. على هذا النحو ، لم تكن هناك حاجة إلى موافقة أخلاقية لهذه الدراسة.

1. استخراج الحمض النووي

  1. استخراج الحمض النووي الفيروسي من المصل البشري أو عينة البلازما. قم بتخزين الحمض النووي المستخرج في -20 درجة مئوية حتى استخدامه مرة أخرى في تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    ملاحظة: الحجم الموصى به من المصل أو البلازما لاستخراج الحمض النووي هو 500 ميكرولتر ، وحجم الشطف هو 50 ميكرولتر. في هذه الدراسة ، تم استخراج الحمض النووي الفيروسي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الفيروسي (جدول المواد).

2. PCR في الوقت الحقيقي

  1. قم بإذابة جميع الكواشف (الجدول 1) لمجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ 15-25 درجة مئوية) قبل بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل. عند إذابة الجليد ، امزج المكونات عن طريق دوامة النبض لمدة 10 ثوان بسرعة معتدلة وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 15 ثانية في RT. احتفظ بجميع المكونات المذابة على كتلة تبريد.
  2. إعداد رد الفعل
    1. تحضير مزيج PCR وفقا للجدول 2. احسب حجم الكواشف المراد إضافتها بناء على عدد العينات والمعايير وعدم وجود عنصر تحكم في القالب.
      ملاحظة: عند تحضير مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب إضافة حجم إضافي بنسبة 10٪ على الأقل من كل كاشف (على سبيل المثال ، إذا كانت هناك حاجة إلى 10 تفاعلات ، فاحسب 11 تفاعلا).
    2. ماصة 15 ميكرولتر من مزيج PCR المحضر أعلاه في كل أنبوب PCR. ثم أضف 15 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المستخرجة. أضف 15 ميكرولتر من واحد على الأقل من معايير HBV (معيار HBV 1-5) كعنصر تحكم إيجابي (PC) للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B و 15 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز من درجة تفاعل البوليميراز المتسلسل كعنصر تحكم سلبي (NC). لإنشاء منحنى قياسي مطلوب لتحديد كمية الحمض النووي ل HBV ، استخدم جميع معايير القياس الكمي الخمسة المرفقة مع المجموعة (معيار HBV 1-5) لكل تشغيل PCR.
    3. أغلق الأنابيب ، وامزج المكونات عن طريق دوامة النبض لمدة 10 ثوان بسرعة معتدلة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 15 ثانية في RT قبل الانتقال إلى الدورة الحرارية. تأكد من عدم وجود فقاعات في مزيج التفاعل ، لأنها قد تتداخل مع اكتشاف التألق.
  3. إعداد البرنامج
    1. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري باستخدام ظروف الدورة كما هو موصى به في الجدول 3.
  4. اختيار القناة / الفلوروفور
    1. حدد الأصباغ الفلورية لمنصات تفاعل البوليميراز المتسلسل شائعة الاستخدام في الوقت الفعلي ، كما هو مذكور في الجدول 4.
  5. تحليل البيانات
    1. بعد اكتمال التشغيل ، قم بتحليل مخطط التضخيم على مقياس خطي.
    2. إعداد العتبة
      1. اضبط العتبة داخل المرحلة الأسية لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. وترد في الجدول 5 قيم العتبة الموصى بها للمجموعة. كن متسقا مع إعداد العتبة. بمجرد تحديد العتبة المثلى للفحص ، استخدمها باستمرار لجميع العينات لجهاز PCR معين. سيساعد ذلك على ضمان دقة النتائج وتكرارها.
        ملاحظة: إذا تم ضبط العتبة منخفضة جدا ، فقد تكون الإشارة أقل من مستوى الضوضاء ، وستكون قيمة Ct غير موثوقة. إذا تم تعيين العتبة عالية جدا ، فقد تكون الإشارة في مرحلة الهضبة من التفاعل ، حيث لا يكون التضخيم بنفس الكفاءة ، وقد تكون قيمة Ct غير دقيقة.
    3. قطع
      1. قم بتشغيل المجموعة لمدة 40 دورة تضخيم. لا تفكر في أي تضخيم يتجاوز 38 دورة لأي تفسير.
    4. تحليل النتائج النوعية
      1. استخدم المجموعة للكشف النوعي عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد الوبائي. استخدم المعيار 2 كجهاز كمبيوتر مع قيم Ct المتوقعة عند 20 ± 2 ل HBV و 24 ± 3 ل IC.
      2. تأكد من عدم وجود عنصر تحكم في القالب (NTC) لا يظهر أي تضخيم لكل من أهداف HBV والتحكم الداخلي (IC). إذا حدث تفاعل تضخيم في تفاعل NTC ، فقد يكون تلوث العينة قد حدث.
      3. نظرا لأن قطع الفحص هو 38 ، ضع في اعتبارك أي تضخيم قبل 38 قيراطا لهدف HBV كعينة إيجابية لفيروس التهاب الكبد الوبائي. عندما تفي جميع الضوابط بالمتطلبات المذكورة أعلاه ، ضع في اعتبارك عينة تتبع التفسيرات المذكورة في الجدول 6.
    5. تحليل النتائج الكمية
      1. استخدم مجموعة من 5 معايير للقياس الكمي للتركيزات المعروفة للحمض النووي النوعي لفيروس التهاب الكبد B والتي تمت معايرتها مقابل المعيار الدولي الرابع لمنظمة الصحة العالمية للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لتقنيات تضخيم الحمض النووي (NAT)20 (الجدول 7).
      2. استخدم هذه المعايير لإنشاء منحنى قياسي. استخدم المنحنى القياسي لتحديد الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B لعينة غير معروفة.
        ملاحظة: سيولد برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي منحنى قياسيا باستخدام قيم Ct التي تم الحصول عليها لأهداف HBV لجميع المعايير ال 5 وتركيزاتها المقابلة بالوحدات الدولية لكل ميكرولتر (IU / μL).
      3. قم بتفسير قيم العينات غير المعروفة فقط إذا كان ميل المعايير يقع بين -3.1 و -3.6 ، وقيمة R2 بين 0.99 و 1.0 ، وكفاءة PCR بين 90٪ -110٪ (0.9-1.1) ، ولا يوجد تضخيم في التحكم السلبي.
      4. سيقوم البرنامج بحساب تركيز كل عينة إيجابية HBV بالوحدات الدولية لكل ميكرولتر (IU / μL). لحساب الحمل الفيروسي (تحويل IU / μL إلى وحدات دولية لكل مليلتر [IU / mL]) ، استخدم المعادلة التالية:
        النتيجة (وحدة دولية / مل) = (النتيجة [وحدة دولية / ميكرولتر] × حجم الشطف [ميكرولتر]) / حجم العينة (مل)
        ملاحظة: تم استخراج المعيار الدوليالرابع لمنظمة الصحة العالمية للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B ، رمز NIBSC 10/266 ، لتنقية الحمض النووي الفيروسي من بلازما 0.5 مل ، واستخلص الحمض النووي الفيروسي المنقى إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف واستخدم مع مجموعة PCR كعينة مرجعية جنبا إلى جنب مع معايير 5 HBV و NTC. تم حساب الحمل الفيروسي HBV للعينة المرجعية (رمز NIBSC 10/266) على أنه (6659 وحدة دولية / ميكرولتر × 50 ميكرولتر) / 0.5 مل = 6,65,900 وحدة دولية / مل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر الشكل 1 رسم تخطيطي لسير العمل للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه من البلازما / المصل البشري. يظهر مخطط تضخيم للمعيار 2 (المستخدم كجهاز كمبيوتر) و NTC لكل من HBV و IC في الشكل 2. يوضح الشكل 3 منحنيات التضخيم لعينة إيجابية لفيروس التهاب الكبد B ، وعينة سلبية من HBV ، وعينة مع تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل. يوضح الشكل 4 منحنى التضخيم وقيمة Ct ل HBV وتركيز HBV الذي تم الحصول عليه بالوحدات الدولية لكل ميكرولتر (IU / μL) لرمز NIBSC 10/266. يتم عرض منحنيات التضخيم لهدف HBV لجميع معايير HBV ال 5 للمجموعة ومنحنى قياسي تمثيلي لنفسه في الشكل 5. ميل المنحنى القياسي هو -3.361 ، R2 هو 0.99996 ، والكفاءة 0.98. يتم عرض منحنيات التضخيم لهدف IC لجميع معايير HBV ال 5 في الشكل 6.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه من عينات البلازما / المصل البشرية. استخراج الحمض النووي الفيروسي من عينة مصل / بلازما الإنسان من الفرد المشتبه في فيروس التهاب الكبد الوبائي. قم بإعداد مزيج PCR عن طريق إضافة كل مكون PCR باستثناء قالب DNA / المعيار (المعايير). قم بتوزيعه في أنابيب / آبار PCR. أضف الحمض النووي الفيروسي المستخرج / المعيار (المعايير) كقالب DNA ، وأغلق أنابيب PCR. قم بتحميله في جهاز PCR في الوقت الفعلي ، وابدأ تشغيل PCR ، وقم بتحليل النتيجة بعد اكتمال التشغيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط تضخيم المعيار 2 (المستخدم كجهاز كمبيوتر) و NTC. يتم عرض مخطط تضخيم لمعيار HBV 2 هنا لكل من أهداف HBV و IC. لتحليل النتائج النوعية ، يمكن استخدام المعيار 2 كعنصر تحكم إيجابي. وبالنسبة للمجلس الوطني الانتقالي، لم يلاحظ أي تضخيم لأي من الهدفين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخططات التضخيم لعينة إيجابية HBV ، عينة سلبية HBV ، وعينة مع تثبيط PCR. يتم عرض مخططات التضخيم لثلاث عينات مختلفة: إيجابية HBV (الحالة 1) ، سلبية HBV (الحالة 2) ، وعينة تحتوي على مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (الحالة 3) هنا. في حالة العينة الإيجابية لفيروس التهاب الكبد B ، يتم تضخيم كلا الهدفين ، في حين تم تضخيم IC فقط للعينة السلبية لفيروس التهاب الكبد B ، ولم يلاحظ أي تضخيم لهدف HBV كما هو متوقع. لم يتم تضخيم HBV أو IC للحالة 3 ، مما يعني أن تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل حدث بسبب مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل الموجودة في عينة الحمض النووي المستخدمة كقالب تفاعل البوليميراز المتسلسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: منحنى التضخيم ، قيمة Ct ل HBV ، وتركيز HBV الذي تم الحصول عليه (IU / μL) لرمز NIBSC 10/266. تم تشغيل الحمض النووي الفيروسي المستخرج من رمز NIBSC 10/266 جنبا إلى جنب مع معايير 5 HBV و NTC. يظهر منحنى التضخيم لهدف HBV لعينة رمز NIBSC 10/266 في اللوحة العلوية. قيمة Ct ل HBV هي 18.94 ، والتركيز المحسوب هو 6659 وحدة دولية / ميكرولتر ، كما هو موضح في اللوحة السفلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: منحنيات التضخيم لهدف HBV لجميع معايير HBV الخمسة والمنحنى القياسي. يتم عرض منحنيات التضخيم لهدف HBV (القناة الخضراء) لجميع معايير HBV ال 5 في اللوحة العلوية. يظهر منحنى قياسي مع ميله (3.361) وقيمة R2 (0.99996) وكفاءة PCR (0.98) في اللوحة السفلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: منحنيات التضخيم لهدف IC لجميع معايير HBV ال 5. يتم عرض منحنيات التضخيم ل 5 معايير HBV ل IC (القناة الصفراء) هنا. كما هو متوقع ، تبدو متشابهة مع قيم Ct مماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تم تشغيل منحنيات التضخيم لهدف HBV لجميع معايير HBV ال 5 و NTC في ثلاث نسخ. تظهر مخططات التضخيم لثلاثة مكررات لهدف HBV (القناة الخضراء) لمعايير HBV ال 5 نتائج مماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: منحنيات التضخيم لهدف HBV لرمز NIBSC 10/266 ، ورمز NIBSC 14/198 ، وتخفيفاته الخمسة. تظهر هنا منحنيات التضخيم لهدف HBV (القناة الخضراء) للعينات المرجعية NIBSC Code 10/266 ، ورمز NIBSC 14/198 ، وتخفيفاته الخمسة (1.25 وحدة دولية / مل ، 2.5 وحدة دولية / مل ، 5 وحدة دولية / مل ، 25 وحدة دولية / مل ، و 50 وحدة دولية / مل). لم يتم الكشف عن أي تضخيم ل 1.25 وحدة دولية / مل ، بينما أظهرت التخفيفات الأخرى منحنيات تضخيم مناسبة قبل 38 قيراطا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الكاشف وصف
مزيج رئيسي متعدد الإرسال المخزن المؤقت PCR ، بدء التشغيل الساخن Taq DNA polymerase ، ومكونات PCR الأخرى
مزيج مسبار التمهيدي HBV الاشعال ومزيج التحقيق للكشف عن فيروس التهاب الكبد B
مزيج مسبار التمهيدي IC الداخلي الاشعال ومزيج المسبار للكشف عن التحكم الداخلي الداخلي (IC)
معايير HBV ·  HBV قياسي 1
·  HBV قياسي 2
·  HBV قياسي 3
·  HBV قياسي 4
·  HBV قياسي 5
السيطرة السلبية ماء خال من النيوكلياز بدرجة تفاعل البوليميراز المتسلسل

الجدول 1: الكواشف المزودة بمجموعة PCR في الوقت الفعلي ووصفها

الكاشف الحجم لكل تفاعل
مزيج رئيسي متعدد الإرسال 11 ميكرولتر
مزيج مسبار التمهيدي HBV 2 ميكرولتر
مزيج مسبار التمهيدي IC الداخلي 2 ميكرولتر
إجمالي حجم التفاعل 15 ميكرولتر

الجدول 2: حجم كل كاشف يضاف لكل تفاعل لإعداد مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل

درج درجة الحرارة (°С) الوقت جمع البيانات دورات
التمسخ الأولي 94 10 دقائق - 1
ركوب الدراجات PCR 94 15 ثانية - 40
55 60 ثانية على
72 15 ثانية -

الجدول 3: ظروف ركوب الدراجات PCR

هدف الجين الدوار Q* سي اف اكس 96 ABI في الوقت الحقيقي PCR #
HBV أخضر فام فام
آي سي أصفر الهيكس فيك
*إعداد تحسين الكسب التلقائي - حدد "إجراء التحسين قبل اكتساب 1st"
#فقط بالنسبة لأجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي من Applied Biosystems ، حدد ROX كصبغة "مرجعية سلبية" أثناء إعداد اللوحة ، حيث يحتوي المزيج الرئيسي للمجموعة على ROX

الجدول 4: اختيار الصبغة لمنصات تفاعل البوليميراز المتسلسل المختلفة في الوقت الفعلي

أداة PCR في الوقت الحقيقي أصباغ نطاق قيمة العتبة§
ABI PCR في الوقت الحقيقي فام 0.2–0.25
فيك 0.05–0.12
بيو راد CFX-96† فام 100–800
الهيكس 50–400
الدوار جين Q أخضر 0.015–0.03
أصفر 0.01–0.02
§تختلف قيمة العتبة المطلقة من أداة إلى أخرى حسب عمر الجهاز وطرازه وحالة المعايرة
تنطبق قيم العتبة هذه عند تحديد ROX كصبغة "مرجع سلبي"
†يزداد التألق النسبي بحوالي 2 إلى 5 أضعاف عند استخدام أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل البيضاء من Bio-Rad بدلا من الأنابيب الشفافة. لذلك ، يجب تحديد قيمة العتبة وفقا لذلك

الجدول 5: قيم العتبة الموصى بها لمختلف منصات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي

نوع العينة حال إشارة التضخيم في تفسير النتائج
FAM / الأخضر عرافة / فيك / أصفر
تحكم قياسي 2 / كمبيوتر شخصي نعم (20 ± 2) نعم (24 ± 3) قياسي 2 / PC يعمل بشكل صحيح
إن تي سي لا لا NTC يعمل بشكل صحيح
عينة 1 نعم نعم / لا* تم الكشف عن الحمض النووي المحدد لفيروس التهاب الكبد B
2 لا نعم لم يتم الكشف عن الحمض النووي المحدد ل HBV. لا تحتوي العينة على كمية يمكن اكتشافها من الحمض النووي الخاص بفيروس التهاب الكبد B
3 لا لا تثبيط محتمل ل PCR ، تمييع عينة الحمض النووي (1:10) / إعادة استخراج الحمض النووي من العينة الأصلية وتكرار PCR
*لا يلزم الكشف عن الرقابة الداخلية عند اكتشاف هدف HBV. يمكن أن يؤدي الحمل العالي للحمض النووي HBV في العينة إلى تقليل أو عدم وجود إشارة التحكم الداخلي

الجدول 6: تفسير نتائج مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية والسلبية التي تحتوي على عينات رديئة الجودة

معيار التركيز (وحدة دولية / ميكرولتر) CT المطلوب
HBV آي سي
(فام / أخضر) (عرافة / فيك / أصفر)
HBV قياسي 1 5 س 104 17 ± 2 24 ± 3
HBV قياسي 2 5 س 103 20 ± 2 24 ± 3
HBV قياسي 3 5 س 102  23 ± 2 24 ± 3
HBV قياسي 4 5 س 101 27 ± 2 24 ± 3
HBV قياسي 5 5 س 100  31 ± 2 24 ± 3

الجدول 7: معايير فيروس التهاب الكبد B وتركيزه على هدف HBV وقيم Ct المرغوبة

عينة المتوقع CT تم الحصول عليها CT ل HBV متوسط Ct الانحراف المعياري السيرة الذاتية ٪
النسخ المتماثل 1 النسخ المتماثل 2 النسخ المتماثل 3
HBV قياسي 1 17 ± 2 17.01 16.89 17.07 16.99 0.09 0.54
HBV قياسي 2 20 ± 2 20.29 20.32 20.34 20.32 0.03 0.12
HBV قياسي 3 23 ± 2 23.61 23.88 23.73 23.74 0.14 0.57
HBV قياسي 4 27 ± 2 26.95 27.03 27.12 27.03 0.09 0.31
HBV قياسي 5 31 ± 2 30.58 30.91 31 30.83 0.22 0.72

الجدول 8: قيم Ct التي تم الحصول عليها ، والمتوسط ، والانحراف المعياري ، ومعامل الاختلاف (CV٪) ل 5 معايير HBV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تعيين رمز NIBSC 10/266 لوحدة 9،55،000 وحدة دولية / مل عند إعادة تكوينها في 0.5 مل من الماء الخالي من النيوكلياز وفقا لمعلومات المورد21. يمكن اعتبار هذا عينة إيجابية عالية الحمل HBV. كان الحمل الفيروسي HBV الذي حددته مجموعة الحمل الفيروسي المستخدمة في هذه الدراسة 6،65،900 وحدة دولية / مل (الشكل 4). نظرا لأن كفاءة استخراج الحمض النووي لأي مجموعة استخراج الحمض النووي ليست 100٪ ، فغالبا ما يتم فقد بعض الحمض النووي أثناء عملية التنقية. على الرغم من أن الحمل الفيروسي الذي تحدده المجموعة أقل قليلا من القيمة المخصصة للمورد للكاشف (رمز NIBSC 10/266) ، إلا أن البيانات لا تزال مرضية لأن فرق log10 بين القيمتين هو 0.157 فقط وهو أقل من قيمة القطع (0.5) 22.

مجموعة الحمل الفيروسي المستخدمة في هذا البروتوكول قوية للغاية وتعطي بيانات قابلة للتكرار ، كما هو موضح في الشكل 7. في هذه التجربة ، تم تشغيل جميع المعايير ال 5 و NTC في ثلاث نسخ ، وقيم Ct الخاصة بهم ، والمتوسط ، والانحراف المعياري ، ومعامل الاختلاف (CV٪) موضحة في الجدول 8. تشير نسبة CV٪ المنخفضة التي تقل عن 1٪ ، كما هو مذكور في الجدول 8 ، إلى أن التجربة أكثر موثوقية وتنتج نتائج دقيقة للغاية.

تم استخدام عينة مرجعية منخفضة الحمل للغاية (رمز NIBSC: 14/198) 23 مع المجموعة للتحقق من LoD. يحتوي رمز NIBSC 14/198 على أقل من 50 وحدة دولية / مل من الحمض النووي HBV وفقا لمعلومات المورد. تم استخراج الحمض النووي من رمز NIBSC 14/198 ، وتم تحضير تخفيفات متعددة (1.25 وحدة دولية / مل ، 2.5 وحدة دولية / مل ، 5 وحدة دولية / مل ، و 25 وحدة دولية / مل) من الحمض النووي. استخدمت المجموعة جميع التخفيفات و 5 معايير HBV كقالب DNA. لوحظ أن هذه المجموعة يمكنها اكتشاف جميع التخفيفات حتى 2.5 وحدة دولية / مل من الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B (الشكل 8) ، وهي تتطابق تماما مع LoD لمجموعة الحمل الفيروسي. وبالتالي ، فإن مجموعة الحمل الفيروسي هي أداة حساسة للغاية وقابلة للتكرار يمكن لمختبرات التشخيص الجزيئي استخدامها لمساعدة المتخصصين في الرعاية الصحية في تشخيص وإدارة عدوى فيروس التهاب الكبد B بشكل فعال.

يجب على المستخدمين أن يضعوا في اعتبارهم الخطوات الهامة التالية عند تنفيذ الإجراء. يجب على المستخدمين استخدام الحمض النووي المستخرج عالي الجودة فقط كقالب PCR لضمان نتائج دقيقة. من المهم تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة (لا تزيد عن 3 مرات) للكواشف. يجب عدم تعريض مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل للضوء لفترة طويلة لأنه يحتوي على مسبار الفلورسنت الحساس للضوء والصبغة المرجعية السلبية ROX. من الأهمية بمكان عدم تضمين أي عنصر تحكم في القالب ومعايير في كل عملية لضمان دقة النتائج وموثوقيتها. يجب استخدام الماصات المعايرة ذات الأطراف المصفاة المعقمة دائما. يجب إضافة قالب الحمض النووي والمعايير في منطقة منفصلة مع ماصة مختلفة عن منطقة تحضير التفاعل لتجنب التلوث المتبادل.

فيما يلي بعض النصائح الشائعة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للكشف في الوقت الفعلي عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وتحديده كميا. قد تحدث إشارة التضخيم في التحكم السلبي بسبب التلوث المتبادل أثناء إعداد التفاعل. لذلك ، يجب على المستخدم التحقق من تلوث مكونات المجموعة. قد لا تحدث إشارة تضخيم مع المعايير للأسباب التالية: (ط) استخدام خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل غير الصحيح. يجب على المستخدم التحقق مما إذا كانت جميع المكونات قد تمت إضافتها بشكل صحيح أم لا. (ii) استخدام الكواشف منتهية الصلاحية. يجب على المستخدم التحقق من تاريخ انتهاء الصلاحية قبل إعداد التفاعل. (iii) التخزين غير السليم للكواشف. تأكد من تخزين الكواشف عند -20 درجة مئوية أو أقل وعدم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة أثناء إعداد التفاعل. (iv) تم استخدام حالة خاطئة لركوب الدراجات PCR. في مثل هذه الحالة ، يوصى بتكرار PCR مع البرنامج الصحيح. (iv) قد تحدث إشارة ضعيفة أو معدومة للتحكم الداخلي للعينات بسبب الحمل العالي لفيروس التهاب الكبد B في العينة وتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن للمستخدم تخفيف عينة الحمض النووي (1:10) وتكرار الفحص لحمل HBV العالي في العينة. في حالة تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب إعادة استخراج عينة الحمض النووي بكواشف عالية الجودة ، ويجب تكرار الفحص.

يعد الكشف في الوقت الفعلي عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه بتقنية حساسة ومحددة للغاية ، ولكن لها بعض القيود مثل التكلفة والتعقيد. يمكن أن تكون أدوات وكواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باهظة الثمن ، ويمكن أن تكون تكلفة الاختبار عائقا أمام بعض المرضى وأنظمة الرعاية الصحية. تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي هو تقنية معقدة تتطلب موظفين مدربين لإجراء الفحص وتفسير النتائج. إنه قياس غير مباشر للحمل الفيروسي ، لذلك قد تؤثر جودة المعايير وقالب الحمض النووي على النتيجة. قد يؤدي النمط الجيني الجديد لفيروس التهاب الكبد B و / أو الطفرة (الطفرات) في منطقة المسبار التمهيدي إلى نتائج سلبية خاطئة.

يعد الكشف في الوقت الفعلي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل والقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B طريقة حساسة للغاية ومحددة يمكنها اكتشاف مستويات منخفضة من الحمض النووي الفيروسي. بالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل الاختبارات المصلية (ELISA ومقايسة التدفق الجانبي) ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي له العديد من المزايا. أولا ، إنه أكثر حساسية من الاختبارات المصلية. ثانيا ، يمكنه تحديد كمية الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B الموجود في العينة ، في حين أن الاختبارات المصلية يمكن أن توفر نتيجة نوعية فقط. أخيرا ، يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أقل عرضة للإيجابيات الكاذبة من الاختبارات المصلية24. بشكل عام ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي الطريقة الأكثر حساسية وتحديدا وكمية المتاحة للكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وتحديده. إنها أيضا تقنية سريعة نسبيا ، مما يجعلها مثالية للاستخدام السريري.

يعد الكشف في الوقت الفعلي عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه كميا أداة قوية لها العديد من التطبيقات المستقبلية ، بما في ذلك تطوير علاجات جديدة مضادة للفيروسات واختبار نقطة الرعاية. يمكن استخدام هذه التقنية لفحص الأدوية المضادة للفيروسات الجديدة ومراقبة فعالية هذه الأدوية في التجارب السريرية. هذا يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات أكثر فعالية وأقل سمية لعدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي. أصبحت أدوات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أصغر حجما وأكثر قابلية للحمل ، مما يجعل من الممكن إجراء اختبار الحمل الفيروسي HBV في نقطة الرعاية. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تحسين الوصول إلى الاختبار ويؤدي إلى التشخيص والعلاج المبكرين لعدوى فيروس التهاب الكبد B. يمكن تكييف حكام هذه المجموعة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقياس الكمي المطلق لمراقبة أكثر دقة لحمل القارورة.

بالإضافة إلى هذه التطبيقات المحددة ، من المرجح أن يلعب الكشف عن الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B وقياسه في الوقت الفعلي وقياسه دورا مهما في البحث والتطوير لأدوات واستراتيجيات جديدة للوقاية من عدوى فيروس التهاب الكبد B وتشخيصها وعلاجها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يرتبط المؤلفون بشركة Kilpest India Limited ، الشركة المصنعة لمجموعة الحمل الفيروسي HBV المستخدمة في هذه الدراسة.

Acknowledgments

نحن نعرب عن تقديرنا لبرافين وكوسوم وشاندان وإيشا وراشمي وبابلي وشيفاني وأنكيتا وشيخة لمساعدتهم الفنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA NIBSC NIBSC code: 10/266 The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines  ThermoFisher Scientific ABI 7500; QuantStudio 5 This is a real time PCR machine 
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 NIBSC NIBSC code: 14/198 This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine Qiagen Rotor-Gene Q This is a real time PCR machine 
TRUPCR HBV Viral Load kit  Kilpest India Limited 3B294 This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit Kilpest India Limited 3B214 This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  3. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  4. Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
  5. World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
  6. Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
  7. Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
  8. Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
  9. Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
  10. Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
  11. Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
  12. Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
  13. Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
  14. Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
  15. Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
  16. Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
  17. Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
  18. Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
  19. Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
  20. NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
  21. Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
  22. Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
  23. Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
  24. Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 202 ، فيروس التهاب الكبد B (HBV) ، الحمل الفيروسي ، تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، المعايير ، المنحنى القياسي ، قيمة Ct ، الرقابة الداخلية الداخلية
الكشف القائم على تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي والقياس الكمي للحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bag, S., Ghosh, S., Lalwani, R.,… More

Bag, S., Ghosh, S., Lalwani, R., Vishnoi, P., Gupta, S., Dubey, D. Real-Time Polymerase Chain Reaction-Based Detection and Quantification of Hepatitis B Virus DNA. J. Vis. Exp. (202), e66249, doi:10.3791/66249 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter