Summary
Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени является чувствительным и точным методом диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Здесь мы представляем протокол обнаружения ДНК ВГВ и измерения вирусной нагрузки в образце.
Abstract
Вирус гепатита В (ВГВ) является одной из основных причин заболеваний печени во всем мире. Это может привести к острым или хроническим инфекциям, что делает людей очень восприимчивыми к смертельному циррозу и раку печени. Точное обнаружение и количественное определение ДНК ВГВ в крови имеют важное значение для диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Наиболее распространенным методом обнаружения ДНК ВГВ является ПЦР в реальном времени, которая может быть использована для обнаружения вируса и оценки вирусной нагрузки для мониторинга ответа на противовирусную терапию. В этой статье мы опишем подробный протокол обнаружения и количественного определения ДНК ВГВ в сыворотке или плазме крови человека с использованием набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. В наборе используются праймеры и зонды, которые нацелены на высококонсервативную основную область генома ВГВ и могут точно количественно определить все генотипы ВГВ (A, B, C, D, E, F, G, H, I и J). Набор также включает в себя эндогенный внутренний контроль для мониторинга возможного ингибирования ПЦР. Этот анализ рассчитан на 40 циклов, а его пороговое значение составляет 38 Ct. Для количественного определения ДНК HBV в клинических образцах в комплекте с набором поставляется набор из 5 стандартов количественного определения. Стандарты содержат известные концентрации ДНК, специфичной для ВГВ, которые откалиброваны в соответствии с4-м Международным стандартом ВОЗ по ДНК ВГВ для теста на нуклеиновые кислоты (код NIBSC 10/266). Стандарты используются для проверки функциональности амплификации ДНК, специфичной для ВГВ, и для создания стандартной кривой, позволяющей количественно определить ДНК ВГВ в образце. С помощью набора для ПЦР была выявлена ДНК вируса гепатита В до 2,5 МЕ/мл. Высокая чувствительность и воспроизводимость набора делают его мощным инструментом в клинических лабораториях, помогая медицинским работникам эффективно диагностировать и лечить инфекции ВГВ.
Introduction
Вирус гепатита В (HBV) представляет собой частично двухцепочечный ДНК-вирус из рода Orthohepadnavirus и семейства Hepadnaviridae 1. Он может спровоцировать хроническую инфекцию, которая сохраняется на протяжении всей жизни, потенциально приводя к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме 2,3,4. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2019 году население страны составляло 296 миллионов человек с хронической инфекцией гепатита В, икаждый год 1,5 миллиона человек заражались новыми инфекциями.
Идентификация и измерение ДНК ВГВ в образцах сыворотки или плазмы служат ценным методом для выявления лиц с текущей инфекцией гепатита В, оценки эффективности противовирусного лечения и прогнозирования вероятности успеха лечения 6,7,8,9,10,11. Высокая вирусная нагрузка связана с повышенным риском прогрессирования заболеваний печени, включая цирроз и рак печени12,13. Следовательно, точное измерение вирусной нагрузки имеет решающее значение для отслеживания прогрессирования инфекции ВГВ и принятия обоснованных решений о лечении.
Количественные ПЦР-анализы в реальном времени обладают более высокой чувствительностью, более широким динамическим диапазоном и более точным количественным определением ДНК ВГВ, чем традиционные методы ПЦР 14,15,16,17. На рынке доступно несколько коммерческих наборов молекулярной диагностики на основе ПЦР в реальном времени для количественного определения ДНК ВГВ в образцах сыворотки или плазмы. В этой статье мы подробно опишем рабочий процесс обнаружения и количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке или плазме крови человека с использованием коммерчески доступного набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. Этот набор представляет собой широко используемый18,19, недорогой, но высокочувствительный анализ, и его эксплуатационные характеристики сопоставимы с другими коммерчески доступными наборами с маркировкой CE18. Помимо амплификации целевой области ВГВ, в набор также включен эндогенный ген внутреннего контроля для проверки качества образцов, качества выделенной ДНК, амплификации ПЦР и возможного ингибирования ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В этом исследовании не участвовали люди или клинические образцы. Единственным использованным биологическим материалом был4-й Международный стандарт ВОЗ по ДНК ВГВ для анализа нуклеиновых кислот (код NIBSC 10/266). Настоящий стандарт является общедоступным справочным материалом, не содержащим никакой личной информации или идентифицируемых данных. Таким образом, для этого исследования не требовалось никакого этического одобрения.
1. Экстракция ДНК
- Извлечение вирусной ДНК из образца сыворотки или плазмы крови человека. Выделенную ДНК хранят при -20 °C до дальнейшего использования в ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый объем сыворотки или плазмы для экстракции ДНК составляет 500 мкл, а объем элюирования - 50 мкл. В этом исследовании вирусная ДНК была выделена с помощью набора для экстракции вирусных нуклеиновых кислот (таблица материалов).
2. ПЦР в реальном времени
- Перед началом ПЦР разморозьте все реагенты (Таблица 1) набора для ПЦР в реальном времени при комнатной температуре (RT; 15-25 °C). После размораживания компоненты перемешивают импульсным вихрем в течение 10 с при умеренной скорости и центрифугируют при 8 000 × г в течение 15 с при RT. Храните все размороженные компоненты на охлаждающем блоке.
- Подготовка к реакции
- Приготовьте ПЦР-смесь в соответствии с таблицей 2. Рассчитайте объем добавляемых реагентов на основе количества образцов, стандартов и отсутствия контроля шаблона.
ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении смеси для ПЦР следует добавить не менее 10% дополнительного объема каждого реагента (например, если требуется 10 реакций, рассчитайте для 11 реакций). - Пипетку 15 мкл вышеуказанной ПЦР-смеси в каждую ПЦР-пробирку. Затем добавьте 15 мкл выделенного образца ДНК. Добавьте 15 мкл, по крайней мере, одного из стандартов для HBV (HBV Standard 1-5) в качестве положительного контроля (PC) для обнаружения ДНК HBV и 15 мкл воды, не содержащей нуклеаз для ПЦР, в качестве отрицательного контроля (NC). Чтобы создать стандартную кривую, необходимую для количественного определения ДНК ВГВ, используйте все 5 стандартов количественного определения, поставляемых с набором (Стандарт ВГВ 1-5) для каждого запуска ПЦР.
- Закройте пробирки, смешайте компоненты импульсным вихревым способом в течение 10 с при умеренной скорости и центрифугируйте при 8 000 × г в течение 15 с при RT перед тем, как перейти к термоциклеру. Убедитесь, что в реакционной смеси нет пузырьков, так как они могут помешать обнаружению флуоресценции.
- Приготовьте ПЦР-смесь в соответствии с таблицей 2. Рассчитайте объем добавляемых реагентов на основе количества образцов, стандартов и отсутствия контроля шаблона.
- Настройка программы
- Запрограммируйте амплификатор, используя условия циклирования, как рекомендовано в таблице 3.
- Выбор канала/флуорофора
- Выберите флуоресцентные красители для широко используемых платформ ПЦР в реальном времени, как указано в таблице 4.
- Анализ данных
- После завершения прогона проанализируйте график усиления по линейной шкале.
- Установка порога
- Установите порог в пределах экспоненциальной фазы ПЦР-реакции. Рекомендуемые пороговые значения для комплекта приведены в таблице 5. Соблюдайте пороговое значение. После того, как оптимальный порог для анализа определен, используйте его последовательно для всех образцов для конкретного ПЦР-аппарата. Это поможет гарантировать, что результаты будут точными и воспроизводимыми.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пороговое значение установлено слишком низко, сигнал может быть ниже уровня шума, и значение Ct будет ненадежным. Если пороговое значение установлено слишком высоко, сигнал может находиться в фазе плато реакции, где усиление не так эффективно, а значение Ct может быть неточным.
- Установите порог в пределах экспоненциальной фазы ПЦР-реакции. Рекомендуемые пороговые значения для комплекта приведены в таблице 5. Соблюдайте пороговое значение. После того, как оптимальный порог для анализа определен, используйте его последовательно для всех образцов для конкретного ПЦР-аппарата. Это поможет гарантировать, что результаты будут точными и воспроизводимыми.
- Отсечка
- Запустите комплект на 40 циклов усиления. Не рассматривайте возможность усиления сверх 38 циклов для любой интерпретации.
- Качественный анализ результата
- Используйте набор для качественного обнаружения ДНК ВГВ. Используйте Стандарт 2 в качестве ПК с ожидаемыми значениями Ct 20 ± 2 для HBV и 24 ± 3 для IC.
- Убедитесь, что ни один шаблонный элемент управления (NTC) не демонстрирует усиления как для HBV, так и для целей внутреннего контроля (IC). Если в реакции NTC происходит реакция амплификации, то, возможно, произошло загрязнение образца.
- Поскольку пороговое значение для анализа составляет 38, рассматривайте любую амплификацию до 38 Ct для мишени HBV как HBV-положительный образец. Когда все контрольные элементы удовлетворяют вышеуказанным требованиям, рассматривают образец, следуя интерпретациям, указанным в таблице 6.
- Количественный анализ результатов
- Используйте набор из 5 количественных стандартов известных концентраций для ДНК, специфичной для ВГВ, которые откалиброваны в соответствии с 4-м Международным стандартом ВОЗ для ДНК ВГВ для методов амплификации нуклеиновых кислот (NAT)20 (таблица 7).
- Используйте эти стандарты для создания стандартной кривой. Используйте стандартную кривую для количественного определения ДНК вируса гепатита В неизвестного образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для ПЦР в режиме реального времени построит стандартную кривую, используя значения Ct, полученные для мишеней для HBV всех 5 стандартов, и их соответствующие концентрации в международных единицах на микролитр (МЕ/мкл). - Интерпретируйте значения для неизвестных образцов только в том случае, если наклон стандартов находится в диапазоне от -3,1 до -3,6, значение R2 находится в диапазоне от 0,99 до 1,0, эффективность ПЦР находится в диапазоне от 90% до 110% (0,9-1,1) и отсутствует амплификация в отрицательном контроле.
- Программное обеспечение рассчитает концентрацию каждого HBV-положительного образца в международных единицах на микролитр (МЕ/мкл). Для расчета вирусной нагрузки (пересчета МЕ/мкл в международные единицы на миллилитр [МЕ/мл]) используйте следующее уравнение:
Результат (МЕ/мл) = (Результат [МЕ/мкл] x Объем элюирования [мкл])/ Объем образца (мл)
ПРИМЕЧАНИЕ:4-й Международный стандарт ВОЗ для ДНК гепатита В, код NIBSC 10/266, был экстрагирован для очистки вирусной ДНК из 0,5 мл плазмы, элюирован очищенной вирусной ДНК в 50 мкл элюирующего буфера и использован с набором для ПЦР в качестве эталонного образца вместе со стандартами 5 HBV и NTC. Вирусную нагрузку ВГВ контрольного образца (код NIBSC 10/266) рассчитывали как (6659 МЕ/мкл х 50 мкл)/0,5 мл = 6,65,900 МЕ/мл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Принципиальная схема рабочего процесса по обнаружению и количественному определению ДНК вируса гепатита В из плазмы/сыворотки крови человека показана на рисунке 1. График усиления Стандарта 2 (используется в качестве ПК) и NTC как для HBV, так и для IC показан на рисунке 2. На рисунке 3 показаны кривые амплификации для HBV-положительного образца, HBV-отрицательного образца и образца с ингибированием ПЦР. Кривая амплификации, значение Ct для HBV и полученная концентрация HBV в международных единицах на микролитр (МЕ/мкл) для кода NIBSC 10/266 показаны на рисунке 4. На рисунке 5 показаны кривые усиления для мишени ВГВ всех 5 стандартов ВГВ, входящих в комплект, и репрезентативная стандартная кривая для них. Наклон стандартной кривой равен -3,361, R2 равен 0,99996, а КПД равен 0,98. Кривые усиления для мишени IC всех 5 стандартов HBV показаны на рисунке 6.
Рисунок 1: Принципиальная схема рабочего процесса для обнаружения и количественного определения ДНК ВГВ в образцах плазмы/сыворотки крови человека. Извлечение вирусной ДНК из образца сыворотки/плазмы крови человека с подозрением на ВГВ. Приготовьте смесь для ПЦР, добавив каждый компонент ПЦР, кроме шаблонной ДНК / стандарта(ов). Распределите его в ПЦР-пробирки/лунки. Добавьте извлеченную вирусную ДНК/стандарт(ы) в качестве матричной ДНК и закройте пробирки для ПЦР. Загрузите его в ПЦР-машину в режиме реального времени, запустите ПЦР-запуск и проанализируйте результат после завершения запуска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: График усиления Стандарта 2 (используется в качестве ПК) и NTC. График усиления HBV стандарта 2 показан здесь как для мишеней HBV, так и для IC. Для качественного анализа результатов в качестве положительного контроля может быть использован Стандарт 2. Для NTC ни для одной из мишеней не наблюдалось усиления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Графики амплификации для HBV-положительного образца, HBV-отрицательного образца и образца с ингибированием ПЦР. Здесь показаны графики амплификации для трех различных образцов: ВГВ-положительных (Случай 1), ВГВ-отрицательных (Случай 2) и образца, содержащего ингибиторы ПЦР (Случай 3). В случае ВГВ-положительного образца обе мишени амплифицируются, в то время как для ВГВ-отрицательного образца амплифицировался только ИЦ, а для ВГВ-мишени, как ожидалось, амплификация не наблюдалась. Ни ВГВ, ни ИЦ не амплифицировались в случае 3, что означает, что ингибирование ПЦР происходило из-за ингибиторов ПЦР, присутствующих в образце ДНК, используемом в качестве матрицы ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Кривая амплификации, значение Ct для HBV и полученная концентрация HBV (МЕ/мкл) для кода NIBSC 10/266. Выделенную вирусную ДНК кода NIBSC 10/266 проводили вместе со стандартами 5 HBV и NTC. Кривая амплификации для мишени HBV показана для образца NIBSC с кодом 10/266 на верхней панели. Его значение Ct для HBV составляет 18,94, а расчетная концентрация составляет 6659 МЕ/мкл, показанная на нижней панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Кривые усиления для мишени ВГВ всех 5 стандартов ВГВ и стандартная кривая. На верхней панели показаны кривые усиления для мишени HBV (зеленый канал) всех 5 стандартов HBV. На нижней панели показана стандартная кривая вместе с ее наклоном (3,361), значением R2 (0,99996) и эффективностью ПЦР (0,98). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Кривые усиления для мишени IC всех 5 стандартов HBV. Здесь показаны кривые усиления 5 стандартов HBV для ИС (желтый канал). Как и ожидалось, они выглядят одинаково при схожих значениях Ct. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Кривые амплификации для мишени для HBV всех 5 стандартов HBV и NTC были построены в трех экземплярах. Графики амплификации трех репликаций для мишени ВГВ (зеленый канал) 5 стандартов ВГВ показывают аналогичные результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Кривые амплификации для мишени ВГВ кода NIBSC 10/266, кода NIBSC 14/198 и его пяти разведений. Здесь представлены кривые амплификации для мишени ВГВ (зеленый канал) контрольных образцов NIBSC код 10/266, NIBSC код 14/198 и его пять разведений (1,25 МЕ/мл, 2,5 МЕ/мл, 5 МЕ/мл, 25 МЕ/мл и 50 МЕ/мл). Амплификация не была обнаружена для 1,25 МЕ/мл, в то время как другие разведения показали правильные кривые амплификации до 38 Ct. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагент | Описание |
| Мультиплексный мастер-микс | ПЦР-буфер, ДНК-полимераза Hot Start Taq и другие компоненты ПЦР |
| Смесь праймеров для зондов HBV | Праймеры и смесь зондов для обнаружения ВГВ |
| Смесь зондов для эндогенного праймера IC | Праймеры и смесь зондов для обнаружения эндогенного внутреннего контроля (ИК) |
| Стандарты для HBV | · Стандарт HBV 1 |
| · Стандарт HBV 2 | |
| · Стандарт HBV 3 | |
| · Стандарт HBV 4 | |
| · Стандарт HBV 5 | |
| Негативный контроль | Вода, не содержащая нуклеаз для ПЦР |
Таблица 1: Реагенты, поставляемые в комплекте с набором для ПЦР в реальном времени, и их описание
| Реагент | Объем на реакцию |
| Мультиплексный мастер-микс | 11 мкл |
| Смесь праймеров для зондов HBV | 2 мкл |
| Смесь зондов для эндогенного праймера IC | 2 мкл |
| Общий объем реакции | 15 мкл |
Таблица 2: Объем каждого реагента, добавляемого на реакцию для приготовления смеси ПЦР
| Шаг | Температура (°С) | Время | Сбор данных | Циклов |
| Начальная денатурация | 94 | 10 мин | - | 1 |
| ПЦР-цикл | 94 | 15 с | - | 40 |
| 55 | 60 с | На | ||
| 72 | 15 с | - |
Таблица 3: Условия циклирования ПЦР
| Цель | Ротор-ген Q* | КФХ 96 | ПЦР ABI в реальном времени# |
| Вирус гепатита В | Зеленый | ФАМ | ФАМ |
| ИС | Жёлтый | ЗАЧАРОВЫВАТЬ | ВИК |
| *Настройка автоматической оптимизации усиления - выберите «Выполнить оптимизацию перед 1-м получением» | |||
| #Только для ПЦР-машин Applied Biosystems в реальном времени выберите ROX в качестве «пассивного эталона» во время настройки планшета, так как мастер-микс набора содержит ROX | |||
Таблица 4: Выбор красителя для различных платформ ПЦР в реальном времени
| Прибор для ПЦР в реальном времени | Красителей | Диапазон пороговых значений§ |
| ПЦР ABI в реальном времени¶ | ФАМ | 0.2–0.25 |
| ВИК | 0.05–0.12 | |
| Био-Рад CFX-96† | ФАМ | 100–800 |
| ЗАЧАРОВЫВАТЬ | 50–400 | |
| Ротор-ген Q | Зеленый | 0.015–0.03 |
| Жёлтый | 0.01–0.02 | |
| §Абсолютное пороговое значение варьируется от прибора к прибору в зависимости от возраста прибора, модели и состояния калибровки | ||
| ¶Эти пороговые значения применимы, когда ROX выбран в качестве красителя «Пассивный эталон» | ||
| †Относительная флуоресценция увеличивается примерно в 2-5 раз, когда вместо прозрачных пробирок Bio-Rad используются белые пробирки для ПЦР. Таким образом, пороговое значение должно быть определено соответствующим образом | ||
Таблица 5: Рекомендуемые пороговые значения для различных платформ ПЦР в реальном времени
| Тип образца | Случай | Вход сигнала усиления | Интерпретация результатов | |||
| FAM/Зеленый | HEX/VIC/Желтый | |||||
| Контроль | Стандарт 2/ПК | Да (20 ± 2) | Да (24 ± 3) | Стандарт 2/ПК работает правильно | ||
| НТЦ | Нет | Нет | НТЦ работает исправно | |||
| Образец | 1 | Да | Да / Нет* | Обнаружена специфичная для ВГВ ДНК | ||
| 2 | Нет | Да | ДНК, специфичная для ВГВ, не обнаружена. Образец не содержит определяемого количества ДНК, специфичной для ВГВ | |||
| 3 | Нет | Нет | Возможно ингибирование ПЦР, разбавление образца ДНК (1:10) / повторное извлечение ДНК из исходного образца и повторение ПЦР | |||
| *Обнаружение системы внутреннего контроля не требуется при обнаружении мишени вируса гепатита В. Высокая нагрузка ДНК ВГВ в образце может привести к снижению или отсутствию сигнала внутреннего контроля | ||||||
Таблица 6: Интерпретация результатов положительных, отрицательных и ПЦР-ингибиторов, содержащих образцы низкого качества
| Стандарт | Концентрация (МЕ/мкл) | Желаемый Ct | |
| Вирус гепатита В | ИС | ||
| (FAM/ Зеленый) | (HEX/VIC/Желтый) | ||
| Стандарт HBV 1 | 5 х 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| Стандарт HBV 2 | 5 х 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| Стандарт HBV 3 | 5 х 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| Стандарт HBV 4 | 5 х 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| Стандарт HBV 5 | 5 х 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Таблица 7: Стандарты ВГВ и его концентрация по отношению к мишени ВГВ и желаемым значениям Ct
| Образец | Ожидаемый CT | Получен CT для HBV | Средний Ct | Стандартное отклонение | CV % | ||
| Репликация 1 | Репликация 2 | Репликация 3 | |||||
| Стандарт HBV 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| Стандарт HBV 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| Стандарт HBV 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| Стандарт HBV 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| Стандарт HBV 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Таблица 8: Полученные значения Ct, среднее, стандартное отклонение и коэффициент вариации (CV%) 5 стандартов ВГВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Коду NIBSC 10/266 присвоена единица 9,55,000 МЕ/мл при восстановлении в 0,5 мл безнуклеазной воды в соответствии с информацией поставщика21. Это можно считать высоконагруженным HBV-положительным образцом. Вирусная нагрузка ВГВ, определенная с помощью набора вирусной нагрузки, использованного в этом исследовании, составила 6 65 900 МЕ/мл (рис. 4). Поскольку эффективность экстракции ДНК любого набора для экстракции ДНК не равна 100%, часть ДНК часто теряется в процессе очистки. Несмотря на то, что вирусная нагрузка, определенная набором, несколько ниже, чем присвоенное поставщиком значение реагента (код NIBSC 10/266), тем не менее, данные являются удовлетворительными, поскольку разница log10 между двумя значениями составляет всего 0,157, что меньше, чем пороговое значение (0,5)22.
Набор для определения вирусной нагрузки, используемый в этом протоколе, отличается высокой надежностью и дает воспроизводимые данные, как показано на рисунке 7. В этом эксперименте все 5 стандартов и NTC были запущены в трех экземплярах, а их значения Ct, среднее, стандартное отклонение и коэффициент вариации (CV%) показаны в таблице 8. Более низкое значение CV% (менее 1%), как указано в таблице 8, указывает на то, что эксперимент более надежен и дает высокоточные результаты.
Эталонный образец с очень низкой нагрузкой (код NIBSC: 14/198)23 был использован в комплекте для проверки его уровня детализации. Код NIBSC 14/198 содержит менее 50 МЕ/мл ДНК ВГВ согласно информации поставщика. ДНК выделяли из кода NIBSC 14/198 и готовили множественные разведения (1,25 МЕ/мл, 2,5 МЕ/мл, 5 МЕ/мл и 25 МЕ/мл) ДНК. В наборе использовались все разведения и 5 стандартов HBV в качестве матричной ДНК. Было замечено, что этот набор может обнаруживать все разведения до 2,5 МЕ/мл ДНК ВГВ (рис. 8), и он точно соответствует LoD набора для определения вирусной нагрузки. Таким образом, набор для измерения вирусной нагрузки является высокочувствительным и воспроизводимым инструментом, который могут использоваться молекулярно-диагностическими лабораториями для помощи медицинским работникам в эффективной диагностике и лечении инфекций ВГВ.
Пользователи должны помнить о следующих критических шагах при выполнении процедуры. Пользователи должны использовать только высококачественную выделенную ДНК в качестве ПЦР-шаблона для обеспечения точных результатов. Важно избегать многократных циклов замораживания-оттаивания (не более 3 раз) реагентов. ПЦР-смесь не должна подвергаться воздействию света в течение длительного времени, так как она содержит светочувствительный флуоресцентный зонд и пассивный эталонный краситель ROX. Очень важно, чтобы в каждом прогоне не было элементов управления шаблонами и стандартов, чтобы обеспечить точность и надежность результатов. Калиброванные пипетки со стерильными фильтруемыми наконечниками необходимо использовать всегда. Матричная ДНК и стандарты должны быть добавлены в отдельную зону с помощью пипетки, отличной от зоны подготовки реакции, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Ниже приведены некоторые общие советы по устранению неполадок при обнаружении и количественном определении ДНК вируса гепатита В на основе ПЦР в режиме реального времени. Усиление сигнала при отрицательном контроле может произойти из-за перекрестного загрязнения во время настройки реакции. Таким образом, пользователь должен проверить наличие загрязнений компонентов комплекта. Отсутствие сигнала усиления в соответствии со стандартами может произойти по следующим причинам: (i) Используется неправильная ПЦР-смесь. Пользователь должен проверить, все ли компоненты добавлены правильно или нет. (ii) Использование реагентов с истекшим сроком годности. Пользователь должен проверить дату истечения срока действия, прежде чем настроить реакцию. (iii) Неправильное хранение реагентов. Следите за тем, чтобы реагенты хранились при температуре -20 °C или ниже и не хранились при комнатной температуре в течение длительного времени во время проведения реакции. (iv) Были использованы неправильные условия циклирования ПЦР. В таком случае рекомендуется повторить ПЦР с правильной программой. (iv) Из-за высокой нагрузки на ВГВ в образце и ингибирования ПЦР может наблюдаться слабый или отсутствующий сигнал внутреннего контроля для образцов. Пользователь может разбавить образец ДНК (1:10) и повторить анализ на высокую нагрузку ВГВ в образце. В случае ингибирования ПЦР образец ДНК должен быть повторно экстрагирован с помощью высококачественных реагентов, и анализ должен быть повторен.
Обнаружение и количественное определение ДНК вируса гепатита В методом ПЦР в режиме реального времени является очень чувствительным и специфическим методом, но у него есть некоторые ограничения, такие как стоимость и сложность. Приборы и реагенты для ПЦР в режиме реального времени могут быть дорогостоящими, а стоимость тестирования может стать препятствием для некоторых пациентов и систем здравоохранения. ПЦР в реальном времени — это сложный метод, требующий обученного персонала для проведения анализа и интерпретации результатов. Это косвенное измерение вирусной нагрузки, поэтому на результат может влиять как качество стандартов, так и матричная ДНК. Новый генотип вируса гепатита В и/или мутация (мутации) в области праймер-зонд могут привести к ложноотрицательным результатам.
Обнаружение и количественное определение ДНК ВГВ методом ПЦР в режиме реального времени является высокочувствительным и специфичным методом, который может обнаруживать низкие уровни вирусной ДНК. По сравнению с другими методами, такими как серологические тесты (ИФА и анализ бокового потока), ПЦР в реальном времени имеет ряд преимуществ. Во-первых, он более чувствителен, чем серологические тесты. Во-вторых, он может количественно определить количество ДНК ВГВ, присутствующей в образце, в то время как серологические тесты могут дать только качественный результат. Наконец, ПЦР в реальном времени менее подвержена ложноположительным результатам, чем серологические тесты24. В целом, ПЦР в реальном времени является наиболее чувствительным, специфичным и количественным методом обнаружения и количественного определения ДНК вируса гепатита В. Это также относительно быстрый метод, что делает его идеальным для клинического использования.
Обнаружение и количественное определение ДНК вируса гепатита В на основе ПЦР в режиме реального времени является мощным инструментом, имеющим несколько будущих применений, включая разработку новых противовирусных методов лечения и тестирование в местах оказания медицинской помощи. Методика может быть использована для скрининга новых противовирусных препаратов и мониторинга эффективности этих препаратов в клинических испытаниях. Это может привести к разработке более эффективных и менее токсичных методов лечения инфекции ВГВ. Приборы для ПЦР в режиме реального времени становятся все меньше и портативнее, что позволяет проводить тестирование на вирусную нагрузку ВГВ в месте оказания медицинской помощи. Это может улучшить доступ к тестированию и привести к более ранней диагностике и лечению инфекции ВГВ. Регенты этого набора на основе ПЦР в реальном времени могут быть адаптированы к цифровой ПЦР для абсолютного количественного определения для более точного мониторинга загрузки флаконов.
В дополнение к этим конкретным приложениям, обнаружение и количественное определение ДНК ВГВ методом ПЦР в режиме реального времени, вероятно, будут играть важную роль в исследованиях и разработке новых инструментов и стратегий профилактики, диагностики и лечения инфекции ВГВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы связаны с компанией Kilpest India Limited, производителем набора для определения вирусной нагрузки ВГВ, используемого в этом исследовании.
Acknowledgments
Выражаем благодарность за техническую помощь Правину, Кусуму, Чандану, Ише, Рашми, Бабли, Шивани, Анките и Шикхе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
