Summary
वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित पता लगाने और हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) डीएनए की मात्रा का ठहराव एचबीवी संक्रमण के निदान और निगरानी के लिए एक संवेदनशील और सटीक तरीका है। यहां, हम एचबीवी डीएनए का पता लगाने और एक नमूने के वायरल लोड माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) दुनिया भर में यकृत रोग का एक महत्वपूर्ण कारण है। यह तीव्र या पुराने संक्रमण का कारण बन सकता है, जिससे व्यक्ति घातक सिरोसिस और यकृत कैंसर के लिए अतिसंवेदनशील हो जाते हैं। एचबीवी संक्रमण के निदान और निगरानी के लिए रक्त में एचबीवी डीएनए का सटीक पता लगाना और मात्रा का ठहराव आवश्यक है। एचबीवी डीएनए का पता लगाने का सबसे आम तरीका रीयल-टाइम पीसीआर है, जिसका उपयोग वायरस का पता लगाने और एंटीवायरल थेरेपी की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए वायरल लोड का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम आईवीडी-चिह्नित रीयल-टाइम पीसीआर-आधारित किट का उपयोग करके मानव सीरम या प्लाज्मा में एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। किट प्राइमरों और जांच का उपयोग करता है जो एचबीवी जीनोम के अत्यधिक संरक्षित कोर क्षेत्र को लक्षित करते हैं और सभी एचबीवी जीनोटाइप (ए, बी, सी, डी, ई, एफ, जी, एच, आई और जे) को सटीक रूप से निर्धारित कर सकते हैं। किट में संभावित पीसीआर निषेध की निगरानी के लिए एक अंतर्जात आंतरिक नियंत्रण भी शामिल है। यह परख 40 चक्रों के लिए चलता है, और इसका कटऑफ 38 सीटी है। नैदानिक नमूनों में एचबीवी डीएनए की मात्रा का ठहराव के लिए, किट के साथ 5 परिमाणीकरण मानकों का एक सेट प्रदान किया जाता है। मानकों में एचबीवी-विशिष्ट डीएनए की ज्ञात सांद्रता होती है जो न्यूक्लिक एसिड परीक्षण (एनआईबीएससी कोड 10/266) के लिए एचबीवी डीएनए के लिए 4वें डब्ल्यूएचओ अंतर्राष्ट्रीय मानक के खिलाफ कैलिब्रेट की जाती है। मानकों का उपयोग एचबीवी-विशिष्ट डीएनए प्रवर्धन की कार्यक्षमता को मान्य करने और एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, जिससे एक नमूने में एचबीवी डीएनए की मात्रा का ठहराव हो सकता है। पीसीआर किट का उपयोग करके एचबीवी डीएनए का 2.5 आईयू / एमएल के रूप में कम पता लगाया गया था। किट की उच्च संवेदनशीलता और प्रजनन क्षमता इसे नैदानिक प्रयोगशालाओं में एक शक्तिशाली उपकरण बनाती है, जो एचबीवी संक्रमणों के प्रभावी निदान और प्रबंधन में स्वास्थ्य पेशेवरों की सहायता करती है।
Introduction
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) जीनस ऑर्थोहेपडनावायरस और हेपडनविरिडे परिवार1 से आंशिक रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस है। यह एक पुराने संक्रमण को ट्रिगर कर सकता है जो जीवन भर बना रहता है, संभावित रूप से यकृत सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा 2,3,4 का कारण बनता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, 2019 में 296 मिलियन लोगों की अनुमानित आबादी क्रोनिक हेपेटाइटिस बी संक्रमण के साथ रह रही थी, और हर साल5 मिलियन लोग नए संक्रमित थे।
सीरम या प्लाज्मा नमूनों में एचबीवी डीएनए की पहचान और माप चल रहे हेपेटाइटिस बी संक्रमण वाले व्यक्तियों का पता लगाने, एंटीवायरल उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने और उपचार की सफलता की संभावना की भविष्यवाणी करने के लिए एक मूल्यवान विधि के रूप में कार्य करता है 6,7,8,9,10,11. उच्च वायरल लोड सिरोसिस और जिगर कैंसर12,13 सहित जिगर रोग की प्रगति का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है. इसलिए, एचबीवी संक्रमण की प्रगति पर नज़र रखने और उपचार के बारे में निर्णयों को सूचित करने के लिए वायरल लोड का सटीक माप महत्वपूर्ण है।
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर assays उच्च संवेदनशीलता, व्यापक गतिशील रेंज, और पारंपरिक पीसीआर तकनीक 14,15,16,17 की तुलना में एचबीवी डीएनए की अधिक सटीक मात्रा का ठहराव है. सीरम या प्लाज्मा नमूनों में एचबीवी डीएनए की मात्रा के लिए कई वाणिज्यिक वास्तविक समय पीसीआर-आधारित आणविक नैदानिक किट बाजार में उपलब्ध हैं। यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, आईवीडी-चिह्नित रीयल-टाइम पीसीआर-आधारित किट का उपयोग करके मानव सीरम या प्लाज्मा में एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक विस्तृत वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं। किट एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया 18,19, कम लागत, अभी तक अत्यधिक संवेदनशील परख है, और इसकी प्रदर्शन विशेषताओं अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीई चिह्नित किट (ओं)18के साथ तुलनीय हैं. एचबीवी लक्ष्य क्षेत्र प्रवर्धन के अलावा, नमूनों की गुणवत्ता, निकाले गए डीएनए की गुणवत्ता, पीसीआर प्रवर्धन और संभावित पीसीआर निषेध को सत्यापित करने के लिए किट में एक अंतर्जात आंतरिक नियंत्रण जीन भी शामिल है।
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Protocol
इस अध्ययन में कोई मानव प्रतिभागी या नैदानिक नमूने शामिल नहीं थे। उपयोग की जाने वाली एकमात्र जैविक सामग्री न्यूक्लिक एसिड परीक्षण (एनआईबीएससी कोड 10/266) के लिए एचबीवी डीएनए के लिए 4वें डब्ल्यूएचओ अंतर्राष्ट्रीय मानक थी। यह मानक एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध संदर्भ सामग्री है जिसमें कोई व्यक्तिगत जानकारी या पहचान योग्य डेटा नहीं है। जैसे, इस अध्ययन के लिए कोई नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी।
1. डीएनए निष्कर्षण
- मानव सीरम या प्लाज्मा नमूने से वायरल डीएनए निकालें। पीसीआर में आगे उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर निकाले गए डीएनए को स्टोर करें।
नोट: डीएनए निष्कर्षण के लिए सीरम या प्लाज्मा की अनुशंसित मात्रा 500 माइक्रोन है, और क्षालन मात्रा 50 माइक्रोन है। इस अध्ययन में, वायरल डीएनए को एक वायरल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके निकाला गया था।
2. रीयल-टाइम पीसीआर
- पीसीआर शुरू करने से पहले कमरे के तापमान (आरटी; 15-25 डिग्री सेल्सियस) पर वास्तविक समय पीसीआर किट के सभी अभिकर्मकों (तालिका 1) को पिघलाएं। जब thawed, एक मध्यम गति से 10 s के लिए पल्स भंवर द्वारा घटकों को मिलाएं और RT पर 15 s के लिए 8,000 × g पर अपकेंद्रित्र करें।
- प्रतिक्रिया की तैयारी
- तालिका 2 के अनुसार एक पीसीआर मिश्रण तैयार करें। नमूनों, मानकों और कोई टेम्पलेट नियंत्रण की संख्या के आधार पर जोड़े जाने वाले अभिकर्मकों की मात्रा की गणना करें।
नोट: पीसीआर मिश्रण तैयार करते समय, प्रत्येक अभिकर्मक की कम से कम 10% अतिरिक्त मात्रा को जोड़ा जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, यदि 10 प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता होती है, तो 11 प्रतिक्रियाओं की गणना करें)। - उपरोक्त तैयार पीसीआर के पिपेट 15 माइक्रोन प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में मिश्रण करते हैं। फिर, निकाले गए नमूना डीएनए के 15 माइक्रोन जोड़ें। एचबीवी डीएनए (एचबीवी मानक 1-5) के लिए कम से कम एक मानक के 15 माइक्रोन को एचबीवी डीएनए और नकारात्मक नियंत्रण (एनसी) के रूप में पीसीआर-ग्रेड न्यूक्लीज-मुक्त पानी के 15 माइक्रोन का पता लगाने के लिए सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) के रूप में जोड़ें। एचबीवी डीएनए की मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक पीसीआर रन के लिए किट (एचबीवी मानक 5-1) के साथ आपूर्ति किए गए सभी 5 परिमाणन मानकों का उपयोग करें।
- ट्यूबों को बंद करें, एक मध्यम गति से 10 एस के लिए पल्स भंवर द्वारा घटकों को मिलाएं, और थर्मल साइक्लर के लिए आगे बढ़ने से पहले आरटी पर 15 एस के लिए 8,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले प्रतिक्रिया मिश्रण में हैं, क्योंकि यह प्रतिदीप्ति का पता लगाने में हस्तक्षेप कर सकता है।
- तालिका 2 के अनुसार एक पीसीआर मिश्रण तैयार करें। नमूनों, मानकों और कोई टेम्पलेट नियंत्रण की संख्या के आधार पर जोड़े जाने वाले अभिकर्मकों की मात्रा की गणना करें।
- कार्यक्रम सेटअप
- तालिका 3 में अनुशंसित साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग करके थर्मल साइक्लर को प्रोग्राम करें।
- चैनल/फ्लोरोफोर चयन
- तालिका 4में वर्णित के रूप में, आमतौर पर इस्तेमाल किया वास्तविक समय पीसीआर प्लेटफार्मों के लिए फ्लोरोसेंट रंगों का चयन करें.
- डेटा विश्लेषण
- रन पूरा होने के बाद, रैखिक पैमाने पर प्रवर्धन साजिश का विश्लेषण करें।
- थ्रेशोल्ड सेटिंग
- पीसीआर प्रतिक्रिया के घातीय चरण के भीतर दहलीज सेट करें। किट के लिए अनुशंसित थ्रेशोल्ड मान तालिका 5में उल्लिखित हैं। थ्रेशोल्ड सेटिंग के अनुरूप रहें। एक बार परख के लिए इष्टतम सीमा निर्धारित है, यह एक विशेष पीसीआर मशीन के लिए सभी नमूनों के लिए लगातार उपयोग करें. इससे यह सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी कि परिणाम सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं।
नोट: यदि थ्रेशोल्ड बहुत कम सेट है, तो सिग्नल शोर स्तर से नीचे हो सकता है, और सीटी मान अविश्वसनीय होगा। यदि थ्रेशोल्ड बहुत अधिक सेट किया गया है, तो सिग्नल प्रतिक्रिया के पठार चरण में हो सकता है, जहां प्रवर्धन उतना कुशल नहीं है, और सीटी मान गलत हो सकता है।
- पीसीआर प्रतिक्रिया के घातीय चरण के भीतर दहलीज सेट करें। किट के लिए अनुशंसित थ्रेशोल्ड मान तालिका 5में उल्लिखित हैं। थ्रेशोल्ड सेटिंग के अनुरूप रहें। एक बार परख के लिए इष्टतम सीमा निर्धारित है, यह एक विशेष पीसीआर मशीन के लिए सभी नमूनों के लिए लगातार उपयोग करें. इससे यह सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी कि परिणाम सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं।
- कटऑफ
- 40 प्रवर्धन चक्रों के लिए किट चलाएं। किसी भी व्याख्या के लिए 38 चक्रों से परे किसी भी प्रवर्धन पर विचार न करें।
- गुणात्मक परिणाम विश्लेषण
- एचबीवी डीएनए के गुणात्मक पता लगाने के लिए किट का प्रयोग करें। एचबीवी के लिए 20 ± 2 और आईसी के लिए 24 ± 3 पर अपेक्षित सीटी मानों के साथ पीसी के रूप में मानक 2 का उपयोग करें।
- सुनिश्चित करें कि कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) एचबीवी और आंतरिक नियंत्रण (आईसी) लक्ष्य दोनों के लिए कोई प्रवर्धन प्रदर्शित नहीं करता है। यदि एनटीसी प्रतिक्रिया में एक प्रवर्धन प्रतिक्रिया होती है, तो नमूना संदूषण हो सकता है।
- चूंकि परख कटऑफ 38 है, इसलिए एचबीवी-पॉजिटिव नमूने के रूप में एचबीवी लक्ष्य के लिए 38 सीटी से पहले किसी भी प्रवर्धन पर विचार करें। जब सभी नियंत्रण उपर्युक्त आवश्यकताओं को पूरा करते हैं, तो तालिका 6 में उल्लिखित व्याख्याओं के बाद एक नमूने पर विचार करें।
- मात्रात्मक परिणाम विश्लेषण
- एचबीवी-विशिष्ट डीएनए के लिए ज्ञात सांद्रता के 5 परिमाणीकरण मानकों के सेट का उपयोग करें जो न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन तकनीकों (एनएटी)20 (तालिका 7)के लिए एचबीवी डीएनए के लिए 4 वें डब्ल्यूएचओ अंतर्राष्ट्रीय मानक के खिलाफ कैलिब्रेट किए गए हैं।
- एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए इन मानकों को नियोजित करें। एक अज्ञात नमूने के एचबीवी डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें।
नोट: रीयल-टाइम पीसीआर सॉफ्टवेयर सभी 5 मानकों के एचबीवी लक्ष्यों के लिए प्राप्त सीटी मूल्यों और प्रति माइक्रोलीटर (आईयू / - अज्ञात नमूनों के मूल्यों की व्याख्या केवल तभी करें जब मानकों का ढलान -3.1 और -3.6 के बीच आता है, R2 मान 0.99 और 1.0 के बीच है, पीसीआर दक्षता 90% -110% (0.9-1.1) के बीच है, और नकारात्मक नियंत्रण में कोई प्रवर्धन नहीं है।
- सॉफ्टवेयर प्रति माइक्रोलीटर (IU/μL) अंतरराष्ट्रीय इकाइयों में प्रत्येक HBV-पॉजिटिव नमूने की एकाग्रता की गणना करेगा। वायरल लोड की गणना करने के लिए (IU/μL का अंतर्राष्ट्रीय इकाइयों में प्रति मिलीलीटर [IU/mL]) में रूपांतरण, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:
परिणाम (IU/mL) = (परिणाम [IU/μL] x क्षालन मात्रा [μL])/ नमूना मात्रा (एमएल)
नोट: एचबीवी डीएनए, एनआईबीएससी कोड 10/266 के लिए 4वें डब्ल्यूएचओ अंतर्राष्ट्रीय मानक, 0.5 एमएल प्लाज्मा से वायरल डीएनए शुद्धि के लिए निकाला गया था, शुद्ध वायरल डीएनए को क्षालन बफर के 50 माइक्रोन में एल्यूट किया गया था और पीसीआर किट के साथ 5 एचबीवी मानकों और एनटीसी के साथ संदर्भ नमूने के रूप में उपयोग किया जाता था। संदर्भ नमूने (एनआईबीएससी कोड 10/266) के एचबीवी वायरल लोड की गणना (6659 आईयू/जेडएल x 50 माइक्रोन)/0.5 एमएल = 6,65,900 आईयू/एमएल के रूप में की गई थी।
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Representative Results
मानव प्लाज्मा/सीरम से एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्कफ़्लो का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1में दिखाया गया है। एचबीवी और आईसी दोनों के लिए मानक 2 (पीसी के रूप में प्रयुक्त) और एनटीसी का एक प्रवर्धन प्लॉट चित्र 2 में दिखाया गया है। चित्रा 3 एक एचबीवी पॉजिटिव नमूना, एक एचबीवी-नकारात्मक नमूना और पीसीआर निषेध के साथ एक नमूना के लिए प्रवर्धन घटता दिखाता है। प्रवर्धन वक्र, एचबीवी के लिए सीटी मान, और एनआईबीएससी कोड 10/266 के लिए अंतरराष्ट्रीय इकाइयों प्रति माइक्रोलीटर (आईयू / किट के सभी 5 एचबीवी मानकों के एचबीवी लक्ष्य के लिए प्रवर्धन वक्र और उसी के लिए एक प्रतिनिधि मानक वक्र चित्र 5 में दिखाए गए हैं। मानक वक्र का ढलान -3.361 है, R2 0.99996 है, और दक्षता 0.98 है। सभी 5 एचबीवी मानकों के आईसी लक्ष्य के लिए प्रवर्धन घटता चित्रा 6 में दिखाए गए हैं।
चित्रा 1: मानव प्लाज्मा/सीरम नमूनों से एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध आरेख। एचबीवी संदिग्ध व्यक्ति के मानव सीरम / प्लाज्मा नमूने से वायरल डीएनए निकालें। टेम्पलेट डीएनए/मानक (ओं) को छोड़कर प्रत्येक पीसीआर घटक को जोड़कर पीसीआर मिश्रण तैयार करें। इसे पीसीआर ट्यूब/कुओं में डालें। निकाले गए वायरल डीएनए/मानक (ओं) को टेम्पलेट डीएनए के रूप में जोड़ें, और पीसीआर ट्यूबों को बंद करें। इसे रीयल-टाइम पीसीआर मशीन में लोड करें, पीसीआर रन शुरू करें, और रन पूरा होने के बाद परिणाम का विश्लेषण करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: मानक 2 (पीसी के रूप में प्रयुक्त) और एनटीसी का प्रवर्धन प्लॉट। एचबीवी मानक 2 का एक प्रवर्धन प्लॉट एचबीवी और आईसी दोनों लक्ष्यों के लिए यहां दिखाया गया है। गुणात्मक परिणाम विश्लेषण के लिए, मानक 2 का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। एनटीसी के लिए, किसी भी लक्ष्य के लिए कोई प्रवर्धन नहीं देखा गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एचबीवी पॉजिटिव नमूने, एचबीवी नकारात्मक नमूने, और पीसीआर निषेध के साथ एक नमूना के लिए प्रवर्धन भूखंड। तीन अलग-अलग नमूनों के लिए प्रवर्धन भूखंड: एचबीवी पॉजिटिव (केस 1), एचबीवी नकारात्मक (केस 2), और पीसीआर इनहिबिटर (केस 3) युक्त एक नमूना यहां दिखाया गया है। एचबीवी पॉजिटिव नमूने के मामले में, दोनों लक्ष्यों को प्रवर्धित किया जाता है, जबकि एचबीवी नकारात्मक नमूने के लिए केवल आईसी को प्रवर्धित किया गया था, और एचबीवी लक्ष्य के लिए कोई प्रवर्धन अपेक्षित नहीं देखा गया था। केस 3 के लिए न तो एचबीवी और न ही आईसी को बढ़ाया गया था, जिसका अर्थ है कि पीसीआर टेम्पलेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले डीएनए नमूने में मौजूद पीसीआर अवरोधकों के कारण पीसीआर अवरोध हुआ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रवर्धन वक्र, एचबीवी के लिए सीटी मान, और एनआईबीएससी कोड 10/266 के लिए एचबीवी एकाग्रता (आईयू / एनआईबीएससी कोड 10/266 के निकाले गए वायरल डीएनए को 5 एचबीवी मानकों और एनटीसी के साथ चलाया गया था। HBV लक्ष्य के लिए प्रवर्धन वक्र ऊपरी पैनल में NIBSC कोड 10/266 नमूने के लिए दिखाया गया है। HBV के लिए इसका Ct मान 18.94 है, और परिकलित सांद्रता 6659 IU/μL है, जिसे निचले पैनल में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: सभी 5 एचबीवी मानकों और मानक वक्र के एचबीवी लक्ष्य के लिए प्रवर्धन घटता। सभी 5 HBV मानकों के HBV लक्ष्य (ग्रीन चैनल) के लिए प्रवर्धन वक्र ऊपरी पैनल में दिखाए गए हैं। निचले पैनल में इसकी ढलान (3.361), R2 मान (0.99996), और PCR दक्षता (0.98) के साथ एक मानक वक्र दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: सभी 5 एचबीवी मानकों के आईसी लक्ष्य के लिए प्रवर्धन घटता। आईसी (पीला चैनल) के लिए 5 एचबीवी मानकों के प्रवर्धन वक्र यहां दिखाए गए हैं। जैसा कि अपेक्षित था, वे समान सीटी मूल्यों के साथ समान दिखते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: सभी 5 एचबीवी मानकों और एनटीसी के एचबीवी लक्ष्य के लिए प्रवर्धन घटता तीन प्रतियों में चलाए गए थे। 5 एचबीवी मानकों के एचबीवी लक्ष्य (ग्रीन चैनल) के लिए तीन प्रतिकृतियों के प्रवर्धन भूखंड समान परिणाम दिखाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8: एनआईबीएससी कोड 10/266, एनआईबीएससी कोड 14/198 के एचबीवी लक्ष्य और इसके पांच कमजोर पड़ने के लिए प्रवर्धन घटता। संदर्भ नमूनों एनआईबीएससी कोड 10/266, एनआईबीएससी कोड 14/198, और इसके पांच कमजोर पड़ने (1.25 आईयू / एमएल, 2.5 आईयू / एमएल, 5 आईयू / एमएल, 25 आईयू / एमएल, और 50 आईयू / एमएल) के एचबीवी लक्ष्य (ग्रीन चैनल) के लिए प्रवर्धन वक्र यहां दिखाए गए हैं। एमएल के लिए कोई प्रवर्धन नहीं पाया गया था, जबकि अन्य कमजोर पड़ने से पहले उचित प्रवर्धन घटता दिखाया गया था 38 सीटी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | विवरण: __________ |
| मल्टीप्लेक्स मास्टर मिक्स | पीसीआर बफर, हॉट स्टार्ट टाक डीएनए पोलीमरेज़, और अन्य पीसीआर घटक |
| एचबीवी प्राइमर जांच मिश्रण | एचबीवी का पता लगाने के लिए प्राइमर और जांच मिश्रण |
| अंतर्जात आईसी प्राइमर जांच मिश्रण | अंतर्जात आंतरिक नियंत्रण (आईसी) का पता लगाने के लिए प्राइमर और जांच मिश्रण |
| एचबीवी के लिए मानक | · एचबीवी मानक 1 |
| · एचबीवी मानक 2 | |
| · एचबीवी मानक 3 | |
| · एचबीवी मानक 4 | |
| · एचबीवी मानक 5 | |
| नकारात्मक नियंत्रण | पीसीआर ग्रेड न्यूक्लियस मुक्त पानी |
तालिका 1: वास्तविक समय पीसीआर किट और उनके विवरण के साथ आपूर्ति किए गए अभिकर्मक
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | प्रति प्रतिक्रिया आयतन |
| मल्टीप्लेक्स मास्टर मिक्स | 11 माइक्रोन |
| एचबीवी प्राइमर जांच मिश्रण | 2 माइक्रोन |
| अंतर्जात आईसी प्राइमर जांच मिश्रण | 2 माइक्रोन |
| कुल प्रतिक्रिया मात्रा | 15 माइक्रोन |
तालिका 2: पीसीआर मिश्रण तैयारी के लिए प्रति प्रतिक्रिया जोड़ा जा करने के लिए प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा
| कहीं जाना | तापमान (°С) | समय | डेटा संग्रहण | चक्र |
| प्रारंभिक विकृतीकरण | 94 | 10 मिण्ट | - | 1 |
| पीसीआर साइकिलिंग | 94 | 15 एस | - | 40 |
| 55 | 60 एस | पर | ||
| 72 | 15 एस | - |
तालिका 3: पीसीआर साइकिलिंग की स्थिति
| लक्ष्य | रोटर-जीन क्यू * | सीएफएक्स 96 | एबीआई रीयल-टाइम पीसीआर # |
| एचबीवी | हरा | परिवार | परिवार |
| आईसी | पीला | हेक्स | विक |
| *ऑटो-गेन ऑप्टिमाइज़ेशन सेटअप- 'पहले अधिग्रहण से पहले ऑप्टिमाइजेशन करें' चुनें | |||
| #केवल एप्लाइड बायोसिस्टम्स की रीयल-टाइम पीसीआर मशीनों के लिए, प्लेट सेटअप के दौरान ROX को 'पैसिव रेफरेंस' डाई के रूप में चुनें, क्योंकि किट के मास्टर मिक्स में ROX होता है | |||
तालिका 4: विभिन्न रीयल-टाइम पीसीआर प्लेटफार्मों के लिए डाई चयन
| रीयल टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट | रंजक | थ्रेशोल्ड मान सीमा§ |
| एबीआई रीयल-टाइम पीसीआर¶ | परिवार | 0.2–0.25 |
| विक | 0.05–0.12 | |
| बायो-रेड सीएफएक्स -96† | परिवार | 100–800 |
| हेक्स | 50–400 | |
| रोटर-जीन क्यू | हरा | 0.015–0.03 |
| पीला | 0.01–0.02 | |
| §एक निरपेक्ष थ्रेशोल्ड मान उपकरण की आयु, मॉडल और अंशांकन स्थिति के आधार पर उपकरण से उपकरण में भिन्न होता है | ||
| ¶ये थ्रेशोल्ड मान तब लागू होते हैं जब ROX को 'निष्क्रिय संदर्भ' डाई के रूप में चुना जाता है | ||
| †सापेक्ष प्रतिदीप्ति के बारे में 2 से 5 गुना बढ़ जाता है जब बायो-रेड के सफेद पीसीआर ट्यूबों का उपयोग स्पष्ट ट्यूबों के बजाय किया जाता है। इसलिए, थ्रेशोल्ड वैल्यू तदनुसार निर्धारित की जानी चाहिए | ||
तालिका 5: विभिन्न रीयल-टाइम पीसीआर प्लेटफार्मों के लिए अनुशंसित थ्रेशोल्ड मान
| नमूना प्रकार | मामला | प्रवर्धन संकेत में | परिणाम व्याख्या | |||
| परिवार/हरा | हेक्स/वीआईसी/पीला | |||||
| नियंत्रण | मानक 2/पीसी | हाँ (20 ± 2) | हाँ (24 ± 3) | मानक 2/PC ठीक से काम कर रहा है | ||
| एनटीसी | नहीं | नहीं | एनटीसी ठीक से काम कर रहा है | |||
| नमूना | 1 | हाँ | हाँ नहीं * | एचबीवी विशिष्ट डीएनए का पता चला | ||
| 2 | नहीं | हाँ | एचबीवी विशिष्ट डीएनए का पता नहीं चला। नमूने में एचबीवी विशिष्ट डीएनए की पता लगाने योग्य मात्रा नहीं है | |||
| 3 | नहीं | नहीं | पीसीआर का संभावित निषेध, डीएनए नमूना पतला (1:10) / मूल नमूने से डीएनए को फिर से निकालें और पीसीआर दोहराएं | |||
| *एचबीवी लक्ष्य का पता चलने पर आंतरिक नियंत्रण का पता लगाने की आवश्यकता नहीं होती है। नमूने में उच्च एचबीवी डीएनए लोड आंतरिक नियंत्रण संकेत की कमी या अनुपस्थिति का कारण बन सकता है | ||||||
तालिका 6: खराब गुणवत्ता वाले नमूनों वाले सकारात्मक, नकारात्मक और पीसीआर अवरोधकों की परिणाम व्याख्या
| स्टैंडर्ड | एकाग्रता (IU/μl) | वांछित सीटी | |
| एचबीवी | आईसी | ||
| (परिवार/हरा) | (हेक्स/वीआईसी/पीला) | ||
| एचबीवी मानक 1 | 5 एक्स 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| एचबीवी मानक 2 | 5 एक्स 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| एचबीवी मानक 3 | 5 एक्स 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| एचबीवी मानक 4 | 5 एक्स 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| एचबीवी मानक 5 | 5 एक्स 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
तालिका 7: एचबीवी मानकों और एचबीवी लक्ष्य और वांछित सीटी मूल्यों की इसकी एकाग्रता
| नमूना | अपेक्षित सीटी | एचबीवी के लिए सीटी प्राप्त किया | औसत सीटी | मानक विचलन | सीवी% | ||
| 1 को दोहराने | 2 को दोहराने | 3 को दोहराने | |||||
| एचबीवी मानक 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| एचबीवी मानक 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| एचबीवी मानक 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| एचबीवी मानक 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| एचबीवी मानक 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
तालिका 8: प्राप्त सीटी मान, औसत, मानक विचलन, और 5 एचबीवी मानकों के भिन्नता (सीवी%) का गुणांक।
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Discussion
एनआईबीएससी कोड 10/266 को 9,55,000 आईयू/एमएल की एक इकाई सौंपी गई है जब आपूर्तिकर्ताकी जानकारी के अनुसार न्यूक्लीज-मुक्त पानी के 0.5 एमएल में पुनर्गठन किया गया है। इसे एक उच्च-लोड एचबीवी पॉजिटिव नमूना माना जा सकता है। इस अध्ययन में प्रयुक्त वायरल लोड किट द्वारा निर्धारित एचबीवी वायरल लोड 6,65,900 आईयू / एमएल (चित्रा 4) था। चूंकि किसी भी डीएनए निष्कर्षण किट की डीएनए निष्कर्षण दक्षता 100% नहीं है, इसलिए शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान कुछ डीएनए अक्सर खो जाते हैं। हालांकि किट द्वारा निर्धारित वायरल लोड अभिकर्मक (एनआईबीएससी कोड 10/266) आपूर्तिकर्ता के निर्दिष्ट मूल्य से थोड़ा कम है, फिर भी डेटा संतोषजनक है क्योंकि दो मूल्यों के बीच लॉग 10 अंतर केवल 0.157 है जो कटऑफ मूल्य (0.5)22से कम है।
इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल वायरल लोड किट अत्यधिक मजबूत है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा देता है, के रूप में चित्रा 7 में दिखाया गया है. इस प्रयोग में, सभी 5 मानकों और एनटीसी को तीन प्रतियों में चलाया गया था, और उनके सीटी मान, औसत, मानक विचलन और भिन्नता के गुणांक (सीवी%) को तालिका 8में दिखाया गया है। तालिका 8 में उल्लिखित 1% से कम सीवी%, इंगित करता है कि प्रयोग अधिक विश्वसनीय है और अत्यधिक सटीक परिणाम उत्पन्न करता है।
किट के साथ एक बहुत कम लोड संदर्भ नमूना (एनआईबीएससी कोड: 14/198)23 का उपयोग इसके एलओडी की जांच करने के लिए किया गया था। NIBSC कोड 14/198 में आपूर्तिकर्ता की जानकारी के अनुसार HBV डीएनए का 50 IU/mL से कम है। डीएनए एनआईबीएससी कोड 14/198 से निकाला गया था, और डीएनए के कई कमजोर पड़ने (1.25 आईयू / एमएल, 2.5 आईयू / एमएल, 5 आईयू / एमएल, और 25 आईयू / एमएल) तैयार किए गए थे। किट ने टेम्पलेट डीएनए के रूप में सभी कमजोर पड़ने और 5 एचबीवी मानकों का उपयोग किया। यह किट एचबीवी डीएनए (चित्रा 8) के 2.5 आईयू / एमएल तक सभी कमजोर पड़ने का पता लगा सकते हैं कि देखा गया था, और यह बिल्कुल वायरल लोड किट के एलओडी से मेल खाता है. इसलिए, वायरल लोड किट एक अत्यधिक संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपकरण है जिसका उपयोग आणविक नैदानिक प्रयोगशालाएं एचबीवी संक्रमणों के प्रभावी ढंग से निदान और प्रबंधन में स्वास्थ्य पेशेवरों की सहायता के लिए कर सकती हैं।
उपयोगकर्ताओं को प्रक्रिया करते समय निम्नलिखित महत्वपूर्ण चरणों को ध्यान में रखना चाहिए। उपयोगकर्ताओं को सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पीसीआर टेम्पलेट के रूप में केवल उच्च गुणवत्ता वाले निकाले गए डीएनए को नियोजित करना चाहिए। अभिकर्मकों के कई फ्रीज-पिघलना चक्रों (3 बार से अधिक नहीं) से बचना महत्वपूर्ण है। पीसीआर मिश्रण को लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क में नहीं आना चाहिए क्योंकि इसमें प्रकाश-संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच और निष्क्रिय संदर्भ डाई रॉक्स शामिल हैं। परिणामों की सटीकता और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक रन में हमेशा कोई टेम्पलेट नियंत्रण और मानक शामिल नहीं करना महत्वपूर्ण है। बाँझ फ़िल्टर्ड युक्तियों के साथ कैलिब्रेटेड पिपेट का उपयोग हमेशा किया जाना चाहिए। टेम्पलेट डीएनए और मानकों पार संदूषण से बचने के लिए प्रतिक्रिया तैयारी क्षेत्र से एक अलग विंदुक के साथ एक अलग क्षेत्र में जोड़ा जाना चाहिए.
हेपेटाइटिस बी वायरस डीएनए का वास्तविक समय पीसीआर-आधारित पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए कुछ सामान्य समस्या निवारण युक्तियाँ निम्नलिखित हैं। नकारात्मक नियंत्रण में प्रवर्धन संकेत प्रतिक्रिया सेटअप के दौरान पार संदूषण के कारण हो सकता है. तो, उपयोगकर्ता किट घटकों के संदूषण के लिए जाँच करनी चाहिए. निम्नलिखित कारणों से मानकों के साथ कोई प्रवर्धन संकेत नहीं हो सकता है: (i) गलत पीसीआर मिश्रण का उपयोग किया गया। उपयोगकर्ता को यह जांचना चाहिए कि सभी घटक सही ढंग से जोड़े गए हैं या नहीं। (ii) समाप्त अभिकर्मकों का उपयोग। प्रतिक्रिया सेट होने से पहले उपयोगकर्ता को समाप्ति तिथि की जांच करनी चाहिए। (iii) अभिकर्मकों का अनुचित भंडारण। सुनिश्चित करें कि अभिकर्मकों -20 डिग्री सेल्सियस या नीचे पर संग्रहीत कर रहे हैं और प्रतिक्रिया सेटअप के दौरान एक लंबे समय के लिए कमरे के तापमान पर नहीं रखा. (iv) गलत पीसीआर साइकलिंग स्थिति का उपयोग किया गया था। ऐसे मामले में, पीसीआर को सही प्रोग्राम के साथ दोहराने की सिफारिश की जाती है। (iv) नमूने में उच्च एचबीवी लोड और पीसीआर निषेध के कारण नमूनों के लिए आंतरिक नियंत्रण का कमजोर या कोई संकेत नहीं हो सकता है। उपयोगकर्ता डीएनए नमूना (1:10) को पतला कर सकता है और नमूने में उच्च एचबीवी लोड के लिए परख दोहरा सकता है। पीसीआर निषेध के मामले में, नमूना डीएनए अच्छी गुणवत्ता अभिकर्मकों के साथ फिर से निकाला जाना चाहिए, और परख दोहराया जाना चाहिए.
हेपेटाइटिस बी वायरस डीएनए का वास्तविक समय पीसीआर-आधारित पता लगाने और मात्रा का ठहराव एक बहुत ही संवेदनशील और विशिष्ट तकनीक है, लेकिन इसकी लागत और जटिलता जैसी कुछ सीमाएं हैं। रीयल-टाइम पीसीआर उपकरण और अभिकर्मक महंगे हो सकते हैं, और परीक्षण की लागत कुछ रोगियों और स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों के लिए बाधा हो सकती है। रीयल-टाइम पीसीआर एक जटिल तकनीक है जिसमें प्रशिक्षित कर्मियों को परख करने और परिणामों की व्याख्या करने की आवश्यकता होती है। यह वायरल लोड का अप्रत्यक्ष माप है, इसलिए मानकों की गुणवत्ता और टेम्पलेट डीएनए दोनों परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। प्राइमर-जांच क्षेत्र में एचबीवी और/या उत्परिवर्तन (ओं) के उपन्यास जीनोटाइप से झूठे नकारात्मक परिणाम हो सकते हैं।
एचबीवी डीएनए का वास्तविक समय पीसीआर-आधारित पता लगाना और मात्रा का ठहराव एक अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट विधि है जो वायरल डीएनए के निम्न स्तर का पता लगा सकती है। सीरोलॉजिकल टेस्ट (एलिसा और लेटरल फ्लो परख) जैसे अन्य तरीकों की तुलना में, रीयल-टाइम पीसीआर के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह सीरोलॉजिकल परीक्षणों की तुलना में अधिक संवेदनशील है। दूसरे, यह एक नमूने में मौजूद एचबीवी डीएनए की मात्रा निर्धारित कर सकता है, जबकि सीरोलॉजिकल परीक्षण केवल गुणात्मक परिणाम प्रदान कर सकते हैं। अंत में, वास्तविक समय पीसीआर सीरोलॉजिकल परीक्षण24 की तुलना में झूठी सकारात्मकता के लिए कम प्रवण है। कुल मिलाकर, रीयल-टाइम पीसीआर एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए उपलब्ध सबसे संवेदनशील, विशिष्ट और मात्रात्मक विधि है। यह एक अपेक्षाकृत तेज़ तकनीक भी है, जो इसे नैदानिक उपयोग के लिए आदर्श बनाती है।
हेपेटाइटिस बी वायरस डीएनए का वास्तविक समय पीसीआर-आधारित पता लगाना और मात्रा का निर्धारण भविष्य के कई अनुप्रयोगों के साथ एक शक्तिशाली उपकरण है, जिसमें नए एंटीवायरल थेरेपी और पॉइंट-ऑफ-केयर परीक्षण विकसित करना शामिल है। तकनीक का उपयोग नई एंटीवायरल दवाओं की जांच करने और नैदानिक परीक्षणों में इन दवाओं की प्रभावकारिता की निगरानी के लिए किया जा सकता है। इससे एचबीवी संक्रमण के लिए अधिक प्रभावी और कम विषाक्त उपचार का विकास हो सकता है। रीयल-टाइम पीसीआर उपकरण छोटे और अधिक पोर्टेबल होते जा रहे हैं, जिससे देखभाल के बिंदु पर एचबीवी वायरल लोड परीक्षण करना संभव हो जाता है। यह परीक्षण तक पहुंच में सुधार कर सकता है और एचबीवी संक्रमण के पहले निदान और उपचार का कारण बन सकता है। इस वास्तविक समय पीसीआर आधारित किट के रीजेंट्स शीशी लोड की अधिक सटीक निगरानी के लिए पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए डिजिटल पीसीआर के साथ अनुकूलित किया जा सकता है.
इन विशिष्ट अनुप्रयोगों के अलावा, एचबीवी डीएनए की वास्तविक समय पीसीआर-आधारित पहचान और मात्रा का ठहराव एचबीवी संक्रमण को रोकने, निदान और उपचार के लिए नए उपकरणों और रणनीतियों के अनुसंधान और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की संभावना है।
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Disclosures
लेखक इस अध्ययन में इस्तेमाल होने वाली एचबीवी वायरल लोड किट के निर्माता किलपेस्ट इंडिया लिमिटेड से जुड़े हैं।
Acknowledgments
हम प्रवीण, कुसुम, चंदन, ईशा, रश्मि, बबली, शिवानी, अंकिता और शिखा को उनकी तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
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