Summary
Hepatit B virüsü (HBV) DNA'sının gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için hassas ve doğru bir yöntemdir. Burada, HBV DNA tespiti ve bir numunenin viral yük ölçümü için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Hepatit B virüsü (HBV), dünya çapında karaciğer hastalığının önemli bir nedenidir. Akut veya kronik enfeksiyonlara yol açarak bireyleri ölümcül siroz ve karaciğer kanserine karşı oldukça duyarlı hale getirebilir. Kandaki HBV DNA'sının doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için gereklidir. HBV DNA'yı tespit etmek için en yaygın yöntem, virüsü tespit etmek ve antiviral tedaviye yanıtı izlemek için viral yükü değerlendirmek için kullanılabilen gerçek zamanlı PCR'dir. Burada, IVD işaretli gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kit kullanarak insan serumu veya plazmasında HBV DNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Kit, HBV genomunun yüksek oranda korunmuş çekirdek bölgesini hedefleyen primerler ve problar kullanır ve tüm HBV genotiplerini (A, B, C, D, E, F, G, H, I ve J) doğru bir şekilde ölçebilir. Kit ayrıca olası PCR inhibisyonunu izlemek için endojen bir dahili kontrol içerir. Bu test 40 döngü boyunca çalışır ve kesilmesi 38 Ct'dir. Klinik örneklerde HBV DNA'sının miktar tayini için kit ile birlikte 5 miktar tayini standardı seti sağlanır. Standartlar, nükleik asit testi için 4. DSÖ Uluslararası HBV DNA Standardına (NIBSC kodu 10/266) göre kalibre edilmiş bilinen HBV'ye özgü DNA konsantrasyonlarını içerir. Standartlar, HBV'ye özgü DNA amplifikasyonunun işlevselliğini doğrulamak ve bir numunede HBV DNA'sının miktar tayinine izin veren standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. PCR kiti kullanılarak 2.5 IU/mL kadar düşük HBV DNA'sı tespit edildi. Kitin yüksek hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği, onu klinik laboratuvarlarda güçlü bir araç haline getirerek sağlık uzmanlarının HBV enfeksiyonlarını etkili bir şekilde teşhis etmesine ve yönetmesine yardımcı olur.
Introduction
Hepatit B virüsü (HBV), Orthohepadnavirus cinsi ve Hepadnaviridae ailesi1'den kısmen çift sarmallı bir DNA virüsüdür. Kişinin yaşamı boyunca devam eden ve potansiyel olarak karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinomayol açan kronik bir enfeksiyonu tetikleyebilir 2,3,4. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 2019 yılında tahmini 296 milyon insan kronik hepatit B enfeksiyonu ile yaşıyordu ve her yıl 1,5 milyon kişi yeni enfekte oldu5.
Serum veya plazma örneklerinde HBV DNA'nın tanımlanması ve ölçümü, devam eden hepatit B enfeksiyonu olan bireyleri tespit etmek, antiviral tedavinin etkinliğini değerlendirmek ve tedavi başarısı olasılığını tahmin etmek için değerli bir yöntem olarak hizmet eder 6,7,8,9,10,11. Yüksek viral yük, siroz ve karaciğer kanseri dahil olmak üzere karaciğer hastalığının ilerlemesi riskinin artmasıyla ilişkilidir12,13. Bu nedenle, HBV enfeksiyonunun ilerlemesini izlemek ve tedavi ile ilgili kararları bildirmek için viral yükün hassas ölçümü çok önemlidir.
Kantitatif gerçek zamanlı PCR testleri, geleneksel PCR tekniklerine göre daha yüksek duyarlılığa, daha geniş dinamik aralığa ve HBV DNA'sının daha doğru miktar tayinine sahiptir 14,15,16,17. Serum veya plazma örneklerinde HBV DNA'nın miktar tayini için çeşitli ticari gerçek zamanlı PCR tabanlı moleküler tanı kitleri piyasada mevcuttur. Burada, ticari olarak temin edilebilen, IVD işaretli gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kit kullanarak insan serumu veya plazmasında HBV DNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir iş akışı açıklıyoruz. Kit, yaygın olarak kullanılan18,19, düşük maliyetli, ancak oldukça hassas bir tahlildir ve performans özellikleri, piyasada bulunan diğer CE işaretli kit(ler)18 ile karşılaştırılabilir. HBV hedef bölge amplifikasyonunun yanı sıra, numunelerin kalitesini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini, PCR amplifikasyonunu ve olası PCR inhibisyonunu doğrulamak için kite endojen bir dahili kontrol geni de dahil edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma herhangi bir insan katılımcıyı veya klinik örneği içermemiştir. Kullanılan tek biyolojik materyal, nükleik asit testi için HBV DNA'sı için 4. DSÖ Uluslararası Standardı (NIBSC kodu 10/266) idi. Bu standart, herhangi bir kişisel bilgi veya tanımlanabilir veri içermeyen, kamuya açık bir referans materyalidir. Bu nedenle, bu çalışma için herhangi bir etik onay gerekmemiştir.
1. DNA Ekstraksiyonu
- Viral DNA'yı insan serumu veya plazma örneğinden çıkarın. Ekstrakte edilen DNA'yı PCR'de daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
NOT: DNA ekstraksiyonu için önerilen serum veya plazma hacmi 500 μL'dir ve elüsyon hacmi 50 μL'dir. Bu çalışmada, viral DNA, bir viral nükleik asit ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak ekstrakte edildi.
2. Gerçek zamanlı PCR
- PCR'ye başlamadan önce gerçek zamanlı PCR kitinin tüm reaktiflerini (Tablo 1) oda sıcaklığında (RT; 15-25 °C) çözün. Çözüldüğünde, bileşenleri orta hızda 10 saniye boyunca darbeli girdap ile karıştırın ve RT'de 15 saniye boyunca 8.000 × g'da santrifüjleyin. Çözülen tüm bileşenleri bir soğutma bloğunda tutun.
- Reaksiyon hazırlama
- Tablo 2'ye göre bir PCR karışımı hazırlayın. Numune sayısına, standartlara ve şablon kontrolüne göre eklenecek reaktiflerin hacmini hesaplayın.
NOT: PCR karışımını hazırlarken, her bir reaktifin en az %10 ekstra hacmi eklenmelidir (örneğin, 10 reaksiyon gerekiyorsa, 11 reaksiyon için hesaplayın). - Yukarıda hazırlanmış PCR karışımının 15 μL'sini her bir PCR tüpüne pipetleyin. Ardından, ekstrakte edilmiş örnek DNA'dan 15 μL ekleyin. HBV DNA'sını tespit etmek için pozitif kontrol (PC) olarak HBV standartlarından en az birinden (HBV Standardı 1-5) 15 μL ve negatif kontrol (NC) olarak 15 μL PCR dereceli nükleaz içermeyen su ekleyin. HBV DNA'nın kantitasyonu için gerekli standart bir eğri oluşturmak için, her PCR çalıştırması için kit ile birlikte verilen 5 kantitasyon standardının tümünü (HBV Standardı 1-5) kullanın.
- Tüpleri kapatın, bileşenleri orta hızda 10 saniye boyunca darbeli girdapla karıştırın ve termal döngüleyiciye geçmeden önce RT'de 15 saniye boyunca 8.000 × g'da santrifüjleyin. Floresan algılamayı engelleyebileceğinden, reaksiyon karışımında kabarcık olmadığından emin olun.
- Tablo 2'ye göre bir PCR karışımı hazırlayın. Numune sayısına, standartlara ve şablon kontrolüne göre eklenecek reaktiflerin hacmini hesaplayın.
- Program kurulumu
- Termal döngüleyiciyi Tablo 3'te önerildiği gibi döngü koşullarını kullanarak programlayın.
- Kanal/Florofor Seçimi
- Tablo 4'te belirtildiği gibi, yaygın olarak kullanılan gerçek zamanlı PCR platformları için floresan boyaları seçin.
- Veri analizi
- Çalıştırma tamamlandıktan sonra, amplifikasyon grafiğini doğrusal bir ölçekte analiz edin.
- Eşik ayarı
- Bir PCR reaksiyonunun üstel fazı içindeki eşiği ayarlayın. Kit için önerilen eşik değerleri Tablo 5'te belirtilmiştir. Eşik ayarıyla tutarlı olun. Test için en uygun eşik belirlendikten sonra, belirli bir PCR makinesi için tüm numuneler için tutarlı bir şekilde kullanın. Bu, sonuçların doğru ve tekrarlanabilir olmasını sağlamaya yardımcı olacaktır.
NOT: Eşik çok düşük ayarlanırsa, sinyal gürültü seviyesinin altında olabilir ve Ct değeri güvenilmez olacaktır. Eşik çok yükseğe ayarlanırsa, sinyal, amplifikasyonun o kadar verimli olmadığı ve Ct değerinin yanlış olabileceği reaksiyonun plato fazında olabilir.
- Bir PCR reaksiyonunun üstel fazı içindeki eşiği ayarlayın. Kit için önerilen eşik değerleri Tablo 5'te belirtilmiştir. Eşik ayarıyla tutarlı olun. Test için en uygun eşik belirlendikten sonra, belirli bir PCR makinesi için tüm numuneler için tutarlı bir şekilde kullanın. Bu, sonuçların doğru ve tekrarlanabilir olmasını sağlamaya yardımcı olacaktır.
- Kesme
- Kiti 40 amplifikasyon döngüsü için çalıştırın. Herhangi bir yorumlama için 38 döngünün ötesinde herhangi bir amplifikasyon düşünmeyin.
- Nitel sonuç analizi
- HBV DNA'nın kalitatif tespiti için kiti kullanın. Standart 2'yi HBV için 20 ± 2'de ve IC için 24 ± 3'te beklenen Ct değerleriyle PC olarak kullanın.
- Hiçbir şablon kontrolünün (NTC) hem HBV hem de dahili kontrol (IC) hedefleri için herhangi bir amplifikasyon göstermediğinden emin olun. NTC reaksiyonunda bir amplifikasyon reaksiyonu meydana gelirse, numune kontaminasyonu meydana gelmiş olabilir.
- Test sınırı 38 olduğundan, HBV hedefi için 38 Ct'den önceki herhangi bir amplifikasyonu HBV pozitif bir numune olarak düşünün. Tüm kontroller yukarıda belirtilen gereksinimleri karşıladığında, Tablo 6'da belirtilen yorumları izleyen bir örnek düşünün.
- Nicel sonuç analizi
- Nükleik asit amplifikasyon teknikleri (NAT) için HBV DNA için 4. DSÖ Uluslararası standardına göre kalibre edilmiş HBV'ye özgü DNA için bilinen konsantrasyonların 5 miktar tayini standardı setini kullanın (NAT)20 (Tablo 7).
- Standart bir eğri oluşturmak için bu standartları kullanın. Bilinmeyen bir numunenin HBV DNA'sını ölçmek için standart eğriyi kullanın.
NOT: Gerçek zamanlı PCR yazılımı, 5 standardın tümünün HBV hedefleri için elde edilen Ct değerlerini ve bunların mikrolitre başına uluslararası birimlerde (IU/μL) karşılık gelen konsantrasyonlarını kullanarak standart bir eğri oluşturacaktır. - Bilinmeyen numuneler için değerleri yalnızca standartların eğimi -3.1 ile -3.6 arasındaysa,R2 değeri 0.99 ile 1.0 arasındaysa, PCR verimliliği %90-%110 (0.9-1.1) arasındaysa ve negatif kontrolde amplifikasyon yoksa yorumlayın.
- Yazılım, her HBV pozitif numunenin konsantrasyonunu mikrolitre başına uluslararası birimlerde (IU/μL) hesaplayacaktır. Viral yükü hesaplamak için (IU/μL'nin mililitre başına uluslararası birimlere [IU/mL]), aşağıdaki denklemi kullanın:
Sonuç (IU/mL) = (Sonuç [IU/μL] x Elüsyon Hacmi [μL])/ Numune Hacmi (mL)
NOT: HBV DNA için 4. DSÖ Uluslararası Standardı, NIBSC kodu 10/266, 0.5 mL plazmadan viral DNA saflaştırması için ekstrakte edildi, saflaştırılmış viral DNA'yı 50 μL elüsyon tamponuna ayrıştırdı ve PCR kiti ile birlikte 5 HBV standardı ve NTC ile birlikte referans numune olarak kullanıldı. Referans numunenin (NIBSC kodu 10/266) HBV viral yükü (6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL olarak hesaplandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan plazmasından/serumundan HBV DNA'sını tespit etmek ve ölçmek için iş akışının şematik bir diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir. Hem HBV hem de IC için Standart 2 (PC olarak kullanılır) ve NTC'nin bir amplifikasyon grafiği Şekil 2'de gösterilmektedir. Şekil 3 , bir HBV-pozitif numune, bir HBV-negatif numune ve PCR inhibisyonu olan bir numune için amplifikasyon eğrilerini göstermektedir. NIBSC kodu 10/266 için amplifikasyon eğrisi, HBV için Ct değeri ve mikrolitre başına uluslararası birimlerde (IU/μL) elde edilen HBV konsantrasyonu Şekil 4'te gösterilmektedir. Kitin tüm 5 HBV standardının HBV hedefi için amplifikasyon eğrileri ve bunun için temsili bir standart eğri Şekil 5'te gösterilmektedir. Standart eğrinin eğimi -3.361,R2 0.99996 ve verimlilik 0.98'dir. 5 HBV standardının tümünün IC hedefi için amplifikasyon eğrileri Şekil 6'da gösterilmektedir.
Şekil 1: İnsan plazması/serum örneklerinden HBV DNA'sını tespit etmek ve ölçmek için iş akışının şematik diyagramı. HBV'den şüphelenilen kişinin insan serumu/plazma örneğinden viral DNA'yı çıkarın. Şablon DNA/standart(lar)ı hariç her bir PCR bileşenini ekleyerek PCR karışımını hazırlayın. PCR tüplerine/kuyularına dağıtın. Ekstrakte edilen viral DNA'yı/standart(lar)ı şablon DNA olarak ekleyin ve PCR tüplerini kapatın. Gerçek zamanlı bir PCR makinesine yükleyin, PCR çalıştırmasını başlatın ve çalıştırma tamamlandıktan sonra sonucu analiz edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Standart 2 (PC olarak kullanılır) ve NTC'nin amplifikasyon grafiği. Burada hem HBV hem de IC hedefleri için HBV standart 2'nin bir amplifikasyon grafiği gösterilmektedir. Nitel sonuç analizi için Standart 2 pozitif kontrol olarak kullanılabilir. NTC için, hedeflerin hiçbiri için amplifikasyon gözlenmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HBV pozitif numune, HBV negatif numune ve PCR inhibisyonu olan bir numune için amplifikasyon grafikleri. Üç farklı örnek için amplifikasyon grafikleri gösterilmektedir: HBV pozitif (Vaka 1), HBV negatif (Vaka 2) ve PCR inhibitörleri içeren bir örnek (Vaka 3) burada gösterilmektedir. HBV pozitif numune durumunda, her iki hedef de amplifiye edilirken, HBV negatif numune için sadece IC amplifiye edildi ve HBV hedefi için beklendiği gibi amplifikasyon gözlenmedi. Vaka 3 için ne HBV ne de IC amplifiye edilmedi, bu da PCR şablonu olarak kullanılan DNA örneğinde bulunan PCR inhibisyonları nedeniyle PCR inhibisyonunun meydana geldiği anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Amplifikasyon eğrisi, HBV için Ct değeri ve NIBSC kodu 10/266 için elde edilen HBV konsantrasyonu (IU/μL). NIBSC kodu 10/266'nın ekstrakte edilmiş viral DNA'sı, 5 HBV standardı ve NTC ile birlikte çalıştırıldı. HBV hedefi için amplifikasyon eğrisi, üst paneldeki NIBSC kodu 10/266 örneği için gösterilmiştir. HBV için Ct değeri 18.94'tür ve hesaplanan konsantrasyon alt panelde gösterilen 6659 IU / μL'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 5 HBV standardının tümünün HBV hedefi ve standart eğrisi için amplifikasyon eğrileri. 5 HBV standardının tümünün HBV hedefi (yeşil kanal) için amplifikasyon eğrileri üst panelde gösterilmiştir. Alt panelde eğimi (3.361),R2 değeri (0.99996) ve PCR verimliliği (0.98) ile birlikte standart bir eğri gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 5 HBV standardının tümünün IC hedefi için amplifikasyon eğrileri. IC (sarı kanal) için 5 HBV standardının amplifikasyon eğrileri burada gösterilmektedir. Beklendiği gibi, benzer Ct değerleriyle aynı görünüyorlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: 5 HBV standardının ve NTC'nin tümünün HBV hedefi için amplifikasyon eğrileri üç kopya halinde çalıştırıldı. 5 HBV standardının HBV hedefi (Yeşil kanal) için üç kopyanın amplifikasyon grafikleri benzer sonuçlar göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: NIBSC kodu 10/266, NIBSC kodu 14/198 ve beş dilüsyonunun HBV hedefi için amplifikasyon eğrileri. NIBSC kodu 10/266, NIBSC kodu 14/198 referans örneklerinin HBV hedefi (yeşil kanal) ve beş dilüsyonunun (1.25 IU/mL, 2.5 IU/mL, 5 IU/mL, 25 IU/mL ve 50 IU/mL) amplifikasyon eğrileri burada gösterilmektedir. 1.25 IU/mL için amplifikasyon tespit edilmedi, diğer dilüsyonlar ise 38 Ct'den önce uygun amplifikasyon eğrileri gösterdi.
| Reaktif | Tarif |
| Multipleks ana karışım | PCR tamponu, Hot Start Taq DNA polimeraz ve diğer PCR bileşenleri |
| HBV primer prob karışımı | HBV tespiti için primerler ve prob karışımı |
| Endojen IC primer prob karışımı | Endojen dahili kontrol (IC) tespiti için primerler ve prob karışımı |
| HBV için Standartlar | · HBV Standart 1 |
| · HBV Standart 2 | |
| · HBV Standardı 3 | |
| · HBV Standardı 4 | |
| · HBV Standart 5 | |
| Negatif Kontrol | PCR sınıfı nükleaz içermeyen su |
Tablo 1: Gerçek zamanlı PCR kiti ile birlikte verilen reaktifler ve açıklamaları
| Reaktif | Reaksiyon başına hacim |
| Multipleks ana karışım | 11 μL |
| HBV primer prob karışımı | 2 μL |
| Endojen IC primer prob karışımı | 2 μL |
| Toplam reaksiyon hacmi | 15 μL |
Tablo 2: PCR karışımının hazırlanması için reaksiyon başına eklenecek her bir reaktifin hacmi
| Adım | Sıcaklık (°С) | Saat | Veri toplama | Döngü |
| İlk Denatürasyon | 94 | 10 dk | - | 1 |
| PCR döngüsü | 94 | 15 Saniye | - | 40 |
| 55 | 60 Saniye | Üzerinde | ||
| 72 | 15 Saniye | - |
Tablo 3: PCR döngü koşulları
| Hedef | Rotor-Gen Q* | CFX 96 Serisi | ABI gerçek zamanlı PCR# |
| HBV (Kalp Damarı | Yeşil | FAM (Aile) | FAM (Aile) |
| IC | Sarı | BÜYÜ | VİC |
| *Otomatik Kazanç Optimizasyonu Kurulumu - '1. Alımdan Önce Optimizasyon Gerçekleştir'i seçin | |||
| #Yalnızca Applied Biosystems'in gerçek zamanlı PCR makineleri için, kitin ana karışımı ROX içerdiğinden, plaka kurulumu sırasında 'Pasif Referans' boyası olarak ROX'u seçin | |||
Tablo 4: Farklı gerçek zamanlı PCR platformları için boya seçimi
| Gerçek Zamanlı PCR Enstrümanı | Boya | Eşik değer aralığı§ |
| ABI gerçek zamanlı PCR¶ | FAM (Aile) | 0.2–0.25 |
| VİC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM (Aile) | 100–800 |
| BÜYÜ | 50–400 | |
| Rotor-Gen Q | Yeşil | 0.015–0.03 |
| Sarı | 0.01–0.02 | |
| §Mutlak eşik değeri, cihazın yaşına, modeline ve kalibrasyon durumuna bağlı olarak cihazdan cihaza değişir | ||
| ¶Bu eşik değerleri, 'Pasif Referans' boyası olarak ROX seçildiğinde geçerlidir | ||
| †Şeffaf tüpler yerine Bio-Rad'ın beyaz PCR tüpleri kullanıldığında bağıl floresan yaklaşık 2 ila 5 kat artar. Bu nedenle, eşik değeri buna göre belirlenmelidir | ||
Tablo 5: Farklı gerçek zamanlı PCR platformları için önerilen eşik değerleri
| Numune türü | Kap | Amplifikasyon Sinyali girişi | Sonuç Yorumlama | |||
| FAM/Yeşil | HEX/VIC/Sarı | |||||
| Kontrol | Standart 2 / PC | Evet (20 ± 2) | Evet (24 ± 3) | Standart 2/PC düzgün çalışıyor | ||
| NTC (NTC) | Hayır | Hayır | NTC düzgün çalışıyor | |||
| Örnek | 1 | Evet | Evet / Hayır* | HBV'ye özgü DNA tespit edildi | ||
| 2 | Hayır | Evet | HBV'ye özgü DNA tespit edilmedi. Numune, saptanabilir miktarda HBV'ye özgü DNA içermiyor | |||
| 3 | Hayır | Hayır | PCR'nin olası inhibisyonu, DNA örneğini seyreltin (1:10) / orijinal örnekten DNA'yı yeniden çıkarın ve PCR'yi tekrarlayın | |||
| *HBV hedefi tespit edildiğinde Dahili Kontrolün tespiti gerekli değildir. Numunedeki yüksek HBV DNA yükü, Dahili Kontrol sinyalinin azalmasına veya yokluğuna yol açabilir | ||||||
Tablo 6: Düşük kaliteli örnekler içeren pozitif, negatif ve PCR inhibitörlerinin sonuç yorumu
| Standart | Konsantrasyon (IU/μl) | İstenilen Ct | |
| HBV (Kalp Damarı | IC | ||
| (FAM/ Yeşil) | (ONALTILIK/VIC/Sarı) | ||
| HBV Standart 1 | 5 X 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standart 2 | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standardı 3 | 5 X 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standardı 4 | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standart 5 | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tablo 7: HBV standartları ve HBV hedefinin konsantrasyonu ve istenen Ct değerleri
| Örnek | Beklenen Ct | HBV için Ct elde edildi | Ortalama Ct | Standart sapma | Özgeçmiş % | ||
| Çoğalt 1 | 2'yi çoğalt | Çoğalt 3 | |||||
| HBV Standart 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV Standart 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV Standardı 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV Standardı 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV Standart 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tablo 8: 5 HBV Standardının elde edilen Ct değerleri, ortalaması, standart sapması ve varyasyon katsayısı (%CV).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIBSC kodu 10/266, tedarikçi bilgilerine göre 9,55,000 mL nükleaz içermeyen suda sulandırıldığında 0.5 IU/mL'lik bir birim olarak atanmıştır21. Bu, yüksek yüklü bir HBV pozitif numune olarak kabul edilebilir. Bu çalışmada kullanılan viral yük kiti ile belirlenen HBV viral yükü 6,65,900 IU/mL idi (Şekil 4). Herhangi bir DNA ekstraksiyon kitinin DNA ekstraksiyon verimliliği %100 olmadığından, saflaştırma işlemi sırasında genellikle bir miktar DNA kaybolur. Kit tarafından belirlenen viral yük, reaktif (NIBSC kodu 10/266) tedarikçisinin atanmış değerinden biraz daha düşük olmasına rağmen, iki değer arasındaki log10 farkı sadece 0.157 olduğundan veriler tatmin edicidir ve bu da kesme değerinden (0.5)22 daha azdır.
Bu protokolde kullanılan viral yük kiti oldukça sağlamdır ve Şekil 7'de gösterildiği gibi tekrarlanabilir veriler verir. Bu deneyde, 5 standardın tümü ve NTC üç kopya halinde çalıştırılmış ve bunların Ct değerleri, ortalaması, standart sapması ve varyasyon katsayısı (% CV%) Tablo 8'de gösterilmiştir. Tablo 8'de belirtildiği gibi, %1'den daha düşük bir CV%, deneyin daha güvenilir olduğunu ve yüksek doğrulukta sonuçlar verdiğini gösterir.
LoD'sini kontrol etmek için kit ile birlikte çok düşük yüklü bir referans numunesi (NIBSC kodu: 14/198)23 kullanıldı. NIBSC kodu 14/198, tedarikçi bilgilerine göre 50 IU/mL'den az HBV DNA içerir. DNA, NIBSC kodu 14/198'den ekstrakte edildi ve DNA'nın çoklu dilüsyonları (1.25 IU/mL, 2.5 IU/mL, 5 IU/mL ve 25 IU/mL) hazırlandı. Kit, şablon DNA olarak tüm dilüsyonları ve 5 HBV standardını kullandı. Bu kitin 2.5 IU/mL HBV DNA'ya kadar tüm dilüsyonları tespit edebildiği (Şekil 8) ve viral yük kitinin LoD'si ile tam olarak eşleştiği gözlemlendi. Bu nedenle, viral yük kiti, moleküler tanı laboratuvarlarının sağlık uzmanlarına HBV enfeksiyonlarını etkili bir şekilde teşhis etmede ve yönetmede yardımcı olmak için kullanabileceği oldukça hassas ve tekrarlanabilir bir araçtır.
Kullanıcılar, prosedürü gerçekleştirirken aşağıdaki kritik adımları akıllarında tutmalıdır. Kullanıcılar, doğru sonuçlar elde etmek için PCR şablonu olarak yalnızca yüksek kaliteli ekstrakte edilmiş DNA kullanmalıdır. Reaktiflerin çoklu donma-çözülme döngülerinden (en fazla 3 kez) kaçınmak önemlidir. PCR karışımı, ışığa duyarlı floresan probu ve pasif referans boyası ROX içerdiğinden uzun süre ışığa maruz bırakılmamalıdır. Sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlamak için her çalıştırmaya her zaman şablon kontrolü ve standartları dahil etmemek çok önemlidir. Her zaman steril filtreli uçlara sahip kalibre edilmiş pipetler kullanılmalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için şablon DNA ve standartlar, reaksiyon hazırlama alanından farklı bir pipetle ayrı bir alana eklenmelidir.
Aşağıdakiler, hepatit B virüsü DNA'sının gerçek zamanlı PCR tabanlı tespiti ve miktar tayini için bazı yaygın sorun giderme ipuçlarıdır. Negatif kontrolde amplifikasyon sinyali, reaksiyon kurulumu sırasında çapraz kontaminasyon nedeniyle meydana gelebilir. Bu nedenle, kullanıcı kit bileşenlerinin kirlenmesini kontrol etmelidir. Aşağıdaki nedenlerden dolayı standartlarla amplifikasyon sinyali oluşmayabilir: (i) Yanlış PCR karışımı kullanılmış. Kullanıcı, tüm bileşenlerin doğru şekilde eklenip eklenmediğini kontrol etmelidir. (ii) Son kullanma tarihi geçmiş reaktiflerin kullanımı. Kullanıcı, reaksiyon kurulmadan önce son kullanma tarihini kontrol etmelidir. (iii) Reaktiflerin uygun olmayan şekilde saklanması. Reaksiyon kurulumu sırasında reaktiflerin -20 °C veya altında saklandığından ve uzun süre oda sıcaklığında tutulmadığından emin olun. (iv) Yanlış PCR döngüsü koşulu kullanıldı. Böyle bir durumda PCR'ın doğru programla tekrarlanması önerilir. (iv) Numunedeki yüksek HBV yükü ve PCR inhibisyonu nedeniyle numuneler için dahili kontrol sinyalinin zayıf olması veya hiç olmaması meydana gelebilir. Kullanıcı, DNA örneğini (1:10) seyreltebilir ve örnekteki yüksek HBV yükü için testi tekrarlayabilir. PCR inhibisyonu durumunda, numune DNA'sı iyi kalitede reaktiflerle yeniden ekstrakte edilmeli ve test tekrarlanmalıdır.
Hepatit B virüsü DNA'sının gerçek zamanlı PCR tabanlı tespiti ve miktar tayini çok hassas ve spesifik bir tekniktir, ancak maliyet ve karmaşıklık gibi bazı sınırlamaları vardır. Gerçek zamanlı PCR cihazları ve reaktifleri pahalı olabilir ve test maliyeti bazı hastalar ve sağlık sistemleri için bir engel olabilir. Gerçek zamanlı PCR, testi gerçekleştirmek ve sonuçları yorumlamak için eğitimli personel gerektiren karmaşık bir tekniktir. Viral yükün dolaylı bir ölçümüdür, bu nedenle hem standartların kalitesi hem de şablon DNA sonucu etkileyebilir. HBV'nin yeni genotipi ve/veya primer-prob bölgesindeki mutasyon(lar) yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
HBV DNA'nın gerçek zamanlı PCR tabanlı tespiti ve miktar tayini, düşük viral DNA seviyelerini tespit edebilen oldukça hassas ve spesifik bir yöntemdir. Serolojik testler (ELISA ve lateral akış testi) gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, gerçek zamanlı PCR'nin çeşitli avantajları vardır. Birincisi, serolojik testlerden daha duyarlıdır. İkinci olarak, bir numunede bulunan HBV DNA miktarını ölçebilirken, serolojik testler sadece kalitatif bir sonuç sağlayabilir. Son olarak, gerçek zamanlı PCR, serolojik testlerden daha az yanlış pozitifliğe eğilimlidir24. Genel olarak, gerçek zamanlı PCR, HBV DNA'nın tespiti ve kantitasyonu için mevcut en hassas, spesifik ve kantitatif yöntemdir. Aynı zamanda nispeten hızlı bir tekniktir, bu da onu klinik kullanım için ideal kılar.
Hepatit B virüsü DNA'sının gerçek zamanlı PCR tabanlı tespiti ve miktarının belirlenmesi, yeni antiviral tedaviler ve hasta başı testleri geliştirmek de dahil olmak üzere gelecekteki çeşitli uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Teknik, yeni antiviral ilaçları taramak ve bu ilaçların klinik çalışmalardaki etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Bu, HBV enfeksiyonu için daha etkili ve daha az toksik tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. Gerçek zamanlı PCR cihazları daha küçük ve daha taşınabilir hale geliyor, bu da bakım noktasında HBV viral yük testi yapmayı mümkün kılıyor. Bu, teste erişimi iyileştirebilir ve HBV enfeksiyonunun daha erken tanı ve tedavisine yol açabilir. Bu gerçek zamanlı PCR tabanlı kitin vekilleri, flakon yükünün daha doğru izlenmesi için mutlak miktar tayini için dijital PCR ile uyarlanabilir.
Bu özel uygulamalara ek olarak, HBV DNA'nın gerçek zamanlı PCR tabanlı tespiti ve kantitasyonunun, HBV enfeksiyonunu önlemek, teşhis etmek ve tedavi etmek için yeni araç ve stratejilerin araştırılması ve geliştirilmesinde önemli bir rol oynaması muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan HBV viral yük kitinin üreticisi olan Kilpest India Limited ile ilişkilidir.
Acknowledgments
Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita ve Shikha'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
