Summary
Realtidsdetektion och kvantifiering av hepatit B-virus (HBV) DNA är en känslig och exakt metod för att diagnostisera och övervaka HBV-infektion. Här presenterar vi ett protokoll för HBV-DNA-detektion och virusmängdsmätning av ett prov.
Abstract
Hepatit B-virus (HBV) är en betydande orsak till leversjukdom över hela världen. Det kan leda till akuta eller kroniska infektioner, vilket gör individer mycket mottagliga för dödlig skrumplever och levercancer. Noggrann detektion och kvantifiering av HBV-DNA i blodet är avgörande för att diagnostisera och övervaka HBV-infektion. Den vanligaste metoden för att detektera HBV-DNA är realtids-PCR, som kan användas för att upptäcka viruset och bedöma virusmängden för att övervaka svaret på antiviral behandling. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för detektion och kvantifiering av HBV-DNA i humant serum eller plasma med hjälp av ett IVD-märkt realtids-PCR-baserat kit. Satsen använder primers och sonder som riktar sig mot den mycket konserverade kärnregionen av HBV-genomet och kan exakt kvantifiera alla HBV-genotyper (A, B, C, D, E, F, G, H, I och J). Satsen innehåller också en endogen intern kontroll för att övervaka eventuell PCR-hämning. Denna analys körs i 40 cykler och dess cutoff är 38 Ct. För kvantifiering av HBV-DNA i kliniska prover medföljer en uppsättning av 5 kvantifieringsstandarder med satsen. Standarderna innehåller kända koncentrationer av HBV-specifikt DNA som kalibreras mot WHO:s 4:e internationella standard för HBV-DNA för nukleinsyratestet (NIBSC-kod 10/266). Standarderna används för att validera funktionaliteten hos den HBV-specifika DNA-amplifieringen och för att generera en standardkurva som möjliggör kvantifiering av HBV-DNA i ett prov. HBV-DNA så lågt som 2,5 IE/ml detekterades med hjälp av PCR-kitet. Satsens höga känslighet och reproducerbarhet gör det till ett kraftfullt verktyg i kliniska laboratorier och hjälper vårdpersonal att effektivt diagnostisera och hantera HBV-infektioner.
Introduction
Hepatit B-virus (HBV) är ett delvis dubbelsträngat DNA-virus från släktena Orthohepadnavirus och Hepadnaviridae-familjen 1. Det kan utlösa en kronisk infektion som kvarstår under hela livet, vilket kan leda till levercirros och hepatocellulärt karcinom 2,3,4. Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) levde en uppskattad befolkning på 296 miljoner människor med kronisk hepatit B-infektion 2019, och 1,5 miljoner människor smittades varje år5.
Identifiering och mätning av HBV-DNA i serum- eller plasmaprover fungerar som en värdefull metod för att upptäcka individer med en pågående hepatit B-infektion, bedöma effekten av antiviral behandling och förutsäga sannolikheten för behandlingsframgång 6,7,8,9,10,11. Hög virusmängd är förknippad med en ökad risk för progression av leversjukdom, inklusive skrumplever och levercancer12,13. Därför är exakt mätning av virusmängd avgörande för att spåra utvecklingen av HBV-infektion och informera beslut om behandling.
Kvantitativa realtids-PCR-analyser har högre känslighet, bredare dynamiskt omfång och mer exakt kvantifiering av HBV-DNA än konventionella PCR-tekniker 14,15,16,17. Det finns flera kommersiella realtids-PCR-baserade molekylära diagnostiska kit för kvantifiering av HBV-DNA i serum- eller plasmaprover på marknaden. Här beskriver vi ett detaljerat arbetsflöde för detektion och kvantifiering av HBV-DNA i humant serum eller plasma med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt, IVD-märkt realtids-PCR-baserat kit. Satsen är en allmänt använd 18,19, billig, men ändå mycket känslig analys, och dess prestandaegenskaper är jämförbara med andra kommersiellt tillgängliga CE-märkta satser18. Förutom amplifieringen av HBV-målregionen ingår också en endogen intern kontrollgen i satsen för att verifiera kvaliteten på prover, kvaliteten på extraherat DNA, PCR-amplifiering och eventuell PCR-hämning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie involverade inga mänskliga deltagare eller kliniska prover. Det enda biologiska material som användes var den 4:e internationella WHO-standarden för HBV-DNA för nukleinsyratest (NIBSC-kod 10/266). Denna standard är ett offentligt tillgängligt referensmaterial som inte innehåller någon personlig information eller identifierbar data. Som sådan krävdes inget etiskt godkännande för denna studie.
1. DNA-extraktion
- Extrahera virus-DNA från humant serum eller plasmaprov. Förvara extraherat DNA vid -20 °C tills vidare användning i PCR.
OBS: Den rekommenderade volymen serum eller plasma för DNA-extraktion är 500 μL och elueringsvolymen är 50 μL. I denna studie extraherades virus-DNA med hjälp av ett viralt nukleinsyraextraktionskit (Table of Materials).
2. PCR i realtid
- Tina alla reagenser (tabell 1) i realtids-PCR-kitet vid rumstemperatur (RT; 15-25 °C) innan du startar PCR. När de tinats upp, blanda komponenterna genom pulsvirvling i 10 s med måttlig hastighet och centrifugera med 8 000 × g i 15 s vid RT. Förvara alla tinade komponenter på ett kylblock.
- Förberedelse av reaktion
- Bered en PCR-blandning enligt tabell 2. Beräkna volymen av reagenser som ska tillsättas baserat på antalet prover, standarder och ingen mallkontroll.
OBS: Vid beredning av PCR-blandningen bör minst 10 % extra volym av varje reagens tillsättas (t.ex. om 10 reaktioner krävs, beräkna för 11 reaktioner). - Pipett 15 μL av den ovan förberedda PCR-blandningen i varje PCR-rör. Tillsätt sedan 15 μL av det extraherade prov-DNA:t. Tillsätt 15 μl av minst ett av standarderna för HBV (HBV-standard 1–5) som en positiv kontroll (PC) för detektion av HBV-DNA och 15 μl nukleasfritt vatten av PCR-kvalitet som en negativ kontroll (NC). För att generera en standardkurva som krävs för kvantifiering av HBV-DNA, använd alla 5 kvantifieringsstandarder som medföljer satsen (HBV Standard 1-5) för varje PCR-körning.
- Stäng rören, blanda komponenterna genom pulsvirvlning i 10 s med måttlig hastighet och centrifugera med 8 000 × g i 15 s vid RT innan du fortsätter till termocyklern. Se till att inga bubblor finns i reaktionsblandningen, eftersom det kan störa fluorescensdetektionen.
- Bered en PCR-blandning enligt tabell 2. Beräkna volymen av reagenser som ska tillsättas baserat på antalet prover, standarder och ingen mallkontroll.
- Inställning av program
- Programmera den termiska cyklern med hjälp av de cykelförhållanden som rekommenderas i tabell 3.
- Val av kanal/fluorofor
- Välj fluorescerande färgämnen för vanliga realtids-PCR-plattformar, som nämns i tabell 4.
- Analys av data
- När körningen är klar, analysera förstärkningsdiagrammet på en linjär skala.
- Inställning av tröskelvärde
- Ställ in tröskeln inom den exponentiella fasen av en PCR-reaktion. Rekommenderade tröskelvärden för satsen anges i tabell 5. Var konsekvent med tröskelinställningen. När det optimala tröskelvärdet för analysen har bestämts, använd det konsekvent för alla prover för en viss PCR-maskin. Detta kommer att bidra till att säkerställa att resultaten är korrekta och reproducerbara.
OBS: Om tröskeln är inställd för lågt kan signalen vara under brusnivån och Ct-värdet blir opålitligt. Om tröskeln är för högt inställd kan signalen befinna sig i platåfasen av reaktionen, där förstärkningen inte är lika effektiv, och Ct-värdet kan vara felaktigt.
- Ställ in tröskeln inom den exponentiella fasen av en PCR-reaktion. Rekommenderade tröskelvärden för satsen anges i tabell 5. Var konsekvent med tröskelinställningen. När det optimala tröskelvärdet för analysen har bestämts, använd det konsekvent för alla prover för en viss PCR-maskin. Detta kommer att bidra till att säkerställa att resultaten är korrekta och reproducerbara.
- Genväg
- Kör satsen i 40 amplifieringscykler. Överväg inte någon förstärkning utöver 38 cykler för någon tolkning.
- Kvalitativ resultatanalys
- Använd satsen för kvalitativ detektion av HBV-DNA. Använd Standard 2 som PC med förväntade Ct-värden vid 20 ± 2 för HBV och 24 ± 3 för IC.
- Se till att ingen mallkontroll (NTC) inte uppvisar någon förstärkning för både HBV- och internkontrollmål (IC). Om en amplifieringsreaktion inträffar i NTC-reaktionen kan provkontaminering ha inträffat.
- Eftersom analysens cutoff är 38, betrakta all amplifiering före 38 Ct för HBV-målet som ett HBV-positivt sample. När alla kontroller uppfyller de ovan angivna kraven, överväg ett prov enligt de tolkningar som nämns i tabell 6.
- Kvantitativ resultatanalys
- Använd uppsättningen med 5 kvantifieringsstandarder för kända koncentrationer för HBV-specifikt DNA som kalibreras mot WHO:s 4:e internationella standard för HBV-DNA för nukleinsyraamplifieringstekniker (NAT)20 (tabell 7).
- Använd dessa standarder för att generera en standardkurva. Använd standardkurvan för att kvantifiera HBV-DNA från ett okänt prov.
OBS: PCR-programvaran i realtid kommer att generera en standardkurva med hjälp av de Ct-värden som erhållits för HBV-målen för alla 5 standarderna och deras motsvarande koncentrationer i internationella enheter per mikroliter (IE/μL). - Tolka endast värdena för okända prover om lutningen på standarder faller mellan -3.1 och -3.6, R2-värdet är mellan 0.99 och 1.0, PCR-effektiviteten är mellan 90%-110% (0.9-1.1), och det finns ingen förstärkning i den negativa kontrollen.
- Programvaran kommer att beräkna koncentrationen av varje HBV-positivt prov i internationella enheter per mikroliter (IE/μL). För att beräkna virusmängden (omvandling av IE/μL till internationella enheter per milliliter [IE/ml]), använd följande ekvation:
Resultat (IE/ml) = (resultat [IE/μL] x elueringsvolym [μL])/ provvolym (ml)
OBS: Den 4:e internationella WHO-standarden för HBV-DNA, NIBSC-kod 10/266, extraherades för viral DNA-rening från 0,5 ml plasma, eluerade det renade virala DNA:t till 50 μL elueringsbuffert och användes med PCR-kitet som referensprov tillsammans med de 5 HBV-standarderna och NTC. HBV-virusmängden i referensprovet (NIBSC-kod 10/266) beräknades som (6659 IE/μL x 50 μL)/0,5 ml = 6,65,900 IE/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett schematiskt diagram över arbetsflödet för att detektera och kvantifiera HBV-DNA från human plasma/serum visas i figur 1. Ett förstärkningsdiagram för Standard 2 (används som PC) och NTC för både HBV och IC visas i figur 2. Figur 3 visar amplifieringskurvorna för ett HBV-positivt prov, ett HBV-negativt prov och ett prov med PCR-hämning. Förstärkningskurvan, Ct-värdet för HBV och erhållen HBV-koncentration i internationella enheter per mikroliter (IE/μL) för NIBSC-kod 10/266 visas i figur 4. Förstärkningskurvor för HBV-målet för alla 5 HBV-standarder i satsen och en representativ standardkurva för densamma visas i figur 5. Lutningen på standardkurvan är -3,361, R2 är 0,99996 och effektiviteten är 0,98. Förstärkningskurvor för IC-målet för alla 5 HBV-standarder visas i figur 6.
Figur 1: Schematisk bild av arbetsflödet för att detektera och kvantifiera HBV-DNA från humana plasma-/serumprover. Extrahera viralt DNA från humant serum/plasmaprov från HBV-misstänkt individ. Bered PCR-blandningen genom att tillsätta varje PCR-komponent utom mallen DNA/standard(er). Dosera det i PCR-rör/brunnar. Lägg till extraherat viralt DNA/standard(er) som mall-DNA och stäng PCR-rören. Ladda in den i en PCR-maskin i realtid, starta PCR-körningen och analysera resultatet när körningen är klar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förstärkningsdiagram för Standard 2 (används som dator) och NTC. Ett förstärkningsdiagram över HBV-standard 2 visas här för både HBV- och IC-målen. För kvalitativ resultatanalys kan Standard 2 användas som en positiv kontroll. För NTC observerades ingen förstärkning för något av målen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Amplifieringsdiagram för HBV-positivt prov, HBV-negativt prov och ett prov med PCR-hämning. Amplifieringsdiagram för tre olika prover: HBV-positiva (fall 1), HBV-negativa (fall 2) och ett prov som innehåller PCR-hämmare (fall 3) visas här. När det gäller det HBV-positiva provet är båda målen amplifierade, medan endast IC amplifierades för det HBV-negativa provet, och ingen amplifiering för HBV-målet observerades som förväntat. Varken HBV eller IC amplifierades för fall 3, vilket innebär att PCR-hämning inträffade på grund av de PCR-hämmare som fanns i DNA-provet som användes som PCR-mall. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förstärkningskurva, Ct-värde för HBV och erhållen HBV-koncentration (IE/μL) för NIBSC-kod 10/266. Extraherat viralt DNA av NIBSC-kod 10/266 kördes tillsammans med de 5 HBV-standarderna och NTC. Förstärkningskurvan för HBV-målet visas för NIBSC-kod 10/266-provet i den övre panelen. Dess Ct-värde för HBV är 18,94 och den beräknade koncentrationen är 6659 IE/μL, som visas i den nedre panelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Förstärkningskurvor för HBV-målet för alla 5 HBV-standarder och standardkurvan. Förstärkningskurvor för HBV-målet (grön kanal) för alla 5 HBV-standarder visas i den övre panelen. En standardkurva tillsammans med dess lutning (3,361), R2-värde (0,99996) och PCR-effektivitet (0,98) visas i den nedre panelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Förstärkningskurvor för IC-målet för alla 5 HBV-standarder. Förstärkningskurvor för 5 HBV-standarder för IC (gul kanal) visas här. Som förväntat ser de likadana ut med liknande Ct-värden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Förstärkningskurvor för HBV-målet för alla 5 HBV-standarder och NTC kördes i tre exemplar. Förstärkningsdiagrammen för tre replikat för HBV-målet (grön kanal) för de 5 HBV-standarderna visar liknande resultat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Förstärkningskurvor för HBV-målet i NIBSC-kod 10/266, NIBSC-kod 14/198 och dess fem utspädningar. Förstärkningskurvorna för HBV-målet (grön kanal) för referensproverna NIBSC-kod 10/266, NIBSC-kod 14/198 och dess fem utspädningar (1,25 IE/ml, 2,5 IE/ml, 5 IE/ml, 25 IE/ml och 50 IE/ml) visas här. Ingen amplifiering detekterades för 1,25 IE/ml, medan andra spädningar visade korrekta amplifieringskurvor före 38 Ct. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens | Beskrivning: __________ |
| Multiplex master mix | PCR-buffert, Hot Start Taq DNA-polymeras och andra PCR-komponenter |
| Blandning av HBV-primersond | Primers och sondblandning för HBV-detektion |
| Endogen IC-primersondblandning | Primers och sondblandning för detektion av endogen intern kontroll (IC) |
| Standarder för HBV | · HBV Standard 1 |
| · HBV Standard 2 | |
| · HBV Standard 3 | |
| · HBV Standard 4 | |
| · HBV Standard 5 | |
| Negativ kontroll | Nukleasfritt vatten av PCR-kvalitet |
Tabell 1: Reagenser som levereras med realtids-PCR-kitet och deras beskrivning
| Reagens | Volym per reaktion |
| Multiplex master mix | 11 μL |
| Blandning av HBV-primersond | 2 μL |
| Endogen IC-primersondblandning | 2 μL |
| Total reaktionsvolym | 15 μL |
Tabell 2: Volym av varje reagens som ska tillsättas per reaktion vid beredning av PCR-blandningar
| Steg | Temperatur (°С) | Tid | Datainsamling | Cykler |
| Inledande denaturering | 94 | 10 minuter | - | 1 |
| PCR-cykling | 94 | 15 sek | - | 40 |
| 55 | 60-årsåldern | På | ||
| 72 | 15 sek | - |
Tabell 3: PCR-cykelförhållanden
| Mål | Rotor-gen Q* | CFX 96 | ABI-PCR i realtid# |
| HBV (på engelska) | Grön | FAM | FAM |
| IC | Gul | HEX | VIC |
| *Inställning av automatisk förstärkningsoptimering - välj "Utför optimering före 1:a förvärvet" | |||
| #Endast för Applied Biosystems realtids-PCR-maskiner, välj ROX som "Passive Reference"-färgämne under plattinställningen, eftersom mastermixen i satsen innehåller ROX | |||
Tabell 4: Färgval för olika realtids-PCR-plattformar
| PCR-instrument i realtid | Färgämnen | Intervall för tröskelvärde§ |
| ABI-PCR i realtid¶ | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| HEX | 50–400 | |
| Rotor-Gene Q | Grön | 0.015–0.03 |
| Gul | 0.01–0.02 | |
| §Ett absolut tröskelvärde varierar från instrument till instrument beroende på instrumentets ålder, modell och kalibreringsstatus | ||
| ¶Dessa tröskelvärden är tillämpliga när ROX väljs som färgämne med passiv referens | ||
| †Den relativa fluorescensen ökar med cirka 2 till 5 gånger när Bio-Rads vita PCR-rör används istället för klara rör. Tröskelvärdet bör därför bestämmas i enlighet med detta | ||
Tabell 5: Rekommenderade tröskelvärden för olika realtids-PCR-plattformar
| Typ av urval | Fall | Förstärkningssignal in | Tolkning av resultat | |||
| FAM/Grön | HEX/VIC/Gul | |||||
| Kontroll | Standard 2/st | Ja (20 ± 2) | Ja (24 ± 3) | Standard 2/PC fungerar som den ska | ||
| NTC (NTC) | Nej | Nej | NTC fungerar som det ska | |||
| Prov | 1 | Ja | Ja / Nej* | HBV-specifikt DNA påvisat | ||
| 2 | Nej | Ja | HBV-specifikt DNA har inte upptäckts. Provet innehåller inte detekterbar mängd HBV-specifikt DNA | |||
| 3 | Nej | Nej | Möjlig hämning av PCR, späd DNA-provet (1:10) / extrahera DNA från originalprovet och upprepa PCR | |||
| *Detektering av den interna kontrollen krävs inte när HBV-målet detekteras. Hög HBV-DNA-belastning i provet kan leda till minskning eller frånvaro av intern kontrollsignal | ||||||
Tabell 6: Resultattolkning av positiva, negativa och PCR-hämmare som innehåller prover av dålig kvalitet
| Standard | Koncentration (IE/μl) | Önskad Ct | |
| HBV (på engelska) | IC | ||
| (FAM/ Grön) | (HEX/VIC/Gul) | ||
| HBV Standard 1 | 5 x 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 2 | 5 x 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 3 | 5 x 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 4 | 5 x 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 5 | 5 x 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tabell 7: HBV-standarder och dess koncentration av HBV-målet och önskade Ct-värden
| Prov | Förväntad Ct | Erhållen Ct för HBV | Genomsnittlig Ct | Standardavvikelse | CV % | ||
| Replikera 1 | Replikera 2 | Replikera 3 | |||||
| HBV Standard 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV Standard 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV Standard 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV Standard 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV Standard 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tabell 8: Erhållna Ct-värden, medelvärde, standardavvikelse och variationskoefficient (CV%) för 5 HBV-standarder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIBSC-kod 10/266 har tilldelats en enhet på 9,55 000 IE/ml när den bereds i 0,5 ml nukleasfritt vatten enligt leverantörsinformationen21. Detta kan betraktas som ett positivt HBV-prov med hög belastning. HBV-virusmängden som bestämdes av det virusmängdskit som användes i denna studie var 6,65,900 IE/ml (Figur 4). Eftersom DNA-extraktionseffektiviteten för alla DNA-extraktionssatser inte är 100 %, går en del DNA ofta förlorat under reningsprocessen. Även om virusmängden som bestäms av satsen är något lägre än reagensleverantörens (NIBSC-kod 10/266) tilldelade värde, är uppgifterna fortfarande tillfredsställande eftersom log10-skillnaden mellan de två värdena endast är 0,157, vilket är mindre än gränsvärdet (0,5)22.
Det virusmängdskit som används i detta protokoll är mycket robust och ger reproducerbara data, som visas i figur 7. I detta experiment kördes alla 5 standarder och NTC i tre exemplar, och deras Ct-värden, medelvärde, standardavvikelse och variationskoefficient (CV%) visas i tabell 8. En lägre CV % på mindre än 1 %, som nämns i tabell 8, indikerar att experimentet är mer tillförlitligt och ger mycket exakta resultat.
Ett referensprov med mycket låg belastning (NIBSC-kod: 14/198)23 användes med satsen för att kontrollera dess LoD. NIBSC-kod 14/198 innehåller mindre än 50 IE/ml HBV-DNA enligt leverantörsinformationen. DNA extraherades från NIBSC-kod 14/198 och flera utspädningar (1,25 IE/ml, 2,5 IE/ml, 5 IE/ml och 25 IE/ml) av DNA framställdes. Satsen använde alla spädningar och 5 HBV-standarder som mall-DNA. Det observerades att detta kit kan detektera alla utspädningar upp till 2,5 IE/ml HBV-DNA (figur 8), och det matchar exakt LoD för virusmängdsatsen. Därför är virusbelastningskitet ett mycket känsligt och reproducerbart verktyg som molekylära diagnostiska laboratorier kan använda för att hjälpa vårdpersonal att diagnostisera och hantera HBV-infektioner effektivt.
Användare bör tänka på följande kritiska steg när de utför proceduren. Användarna måste endast använda extraherat DNA av hög kvalitet som PCR-mall för att säkerställa korrekta resultat. Det är viktigt att undvika flera frys-upptiningscykler (inte mer än 3 gånger) av reagenserna. PCR-blandningen bör inte utsättas för ljus under en längre tid eftersom den innehåller den ljuskänsliga fluorescerande sonden och det passiva referensfärgämnet ROX. Det är viktigt att alltid inkludera ingen mallkontroll och standarder i varje körning för att säkerställa resultatens noggrannhet och tillförlitlighet. Kalibrerade pipetter med sterila filtrerade spetsar måste alltid användas. Mall-DNA och standarder måste läggas till i ett separat område med en annan pipett än reaktionsförberedelseområdet för att undvika korskontaminering.
Följande är några vanliga felsökningstips för PCR-baserad detektion och kvantifiering av hepatit B-virus-DNA i realtid. Amplifieringssignal i negativ kontroll kan inträffa på grund av korskontaminering under reaktionsinställningen. Så användaren bör kontrollera om det finns kontaminering av kitkomponenter. Ingen amplifieringssignal med standarder kan uppstå på grund av följande skäl: (i) Felaktig PCR-blandning används. Användaren bör kontrollera om alla komponenter är korrekt tillsatta eller inte. ii) Användning av utgångna reagenser. Användaren måste kontrollera utgångsdatumet innan reaktionen ställs in. iii) Felaktig förvaring av reagenser. Se till att reagenserna förvaras vid -20 °C eller lägre och inte förvaras i rumstemperatur under en längre tid under reaktionsinställningen. iv) Fel PCR-cykelförhållande användes. I ett sådant fall rekommenderas att upprepa PCR med rätt program. iv) Svag eller ingen signal om intern kontroll för prover kan förekomma på grund av hög HBV-belastning i provet och PCR-hämning. Användaren kan späda ut DNA-provet (1:10) och upprepa analysen för hög HBV-belastning i provet. Vid PCR-hämning måste provets DNA extraheras på nytt med reagenser av god kvalitet och analysen måste upprepas.
PCR-baserad detektion och kvantifiering av hepatit B-virus DNA i realtid är en mycket känslig och specifik teknik, men den har vissa begränsningar som kostnad och komplexitet. PCR-instrument och reagenser i realtid kan vara dyra, och kostnaden för testning kan vara ett hinder för vissa patienter och sjukvårdssystem. Realtids-PCR är en komplex teknik som kräver utbildad personal för att utföra analysen och tolka resultaten. Det är en indirekt mätning av virusmängden, så både kvaliteten på standarderna och mall-DNA kan påverka resultatet. Ny genotyp av HBV och/eller mutation(er) i primer-probregionen kan leda till falskt negativa resultat.
PCR-baserad detektion och kvantifiering av HBV-DNA i realtid är en mycket känslig och specifik metod som kan detektera låga nivåer av virus-DNA. I jämförelse med andra metoder som serologiska tester (ELISA och lateral flödesanalys) har realtids-PCR flera fördelar. För det första är det känsligare än de serologiska testerna. För det andra kan den kvantifiera mängden HBV-DNA som finns i ett prov, medan serologiska tester bara kan ge ett kvalitativt resultat. Slutligen är realtids-PCR mindre benägen att få falskt positiva resultat än de serologiska testerna24. Sammantaget är realtids-PCR den mest känsliga, specifika och kvantitativa metoden som finns tillgänglig för detektion och kvantifiering av HBV-DNA. Det är också en relativt snabb teknik, vilket gör den idealisk för klinisk användning.
PCR-baserad detektion och kvantifiering av hepatit B-virus DNA i realtid är ett kraftfullt verktyg med flera framtida tillämpningar, inklusive utveckling av nya antivirala terapier och patientnära tester. Tekniken kan användas för att screena nya antivirala läkemedel och för att övervaka effekten av dessa läkemedel i kliniska prövningar. Detta skulle kunna leda till utveckling av effektivare och mindre toxiska behandlingar för HBV-infektion. Realtids-PCR-instrument blir mindre och mer portabla, vilket gör det möjligt att utföra HBV-virusbelastningstester vid vårdtillfället. Detta skulle kunna förbättra tillgången till testning och leda till tidigare diagnos och behandling av HBV-infektion. Regenterna i detta realtids-PCR-baserade kit kan anpassas med digital PCR för absolut kvantifiering för mer exakt övervakning av flaskans belastning.
Utöver dessa specifika tillämpningar kommer realtids-PCR-baserad detektion och kvantifiering av HBV-DNA sannolikt att spela en viktig roll i forskning och utveckling av nya verktyg och strategier för att förebygga, diagnostisera och behandla HBV-infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är associerade med Kilpest India Limited, tillverkaren av HBV-virusbelastningskitet som används i denna studie.
Acknowledgments
Vi tackar Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita och Shikha för deras tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
