Summary
Il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B (HBV) basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale sono un metodo sensibile e accurato per diagnosticare e monitorare l'infezione da HBV. Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento del DNA dell'HBV e la misurazione della carica virale di un campione.
Abstract
Il virus dell'epatite B (HBV) è una causa significativa di malattie del fegato in tutto il mondo. Può portare a infezioni acute o croniche, rendendo gli individui altamente suscettibili alla cirrosi fatale e al cancro al fegato. Il rilevamento e la quantificazione accurati del DNA dell'HBV nel sangue sono essenziali per la diagnosi e il monitoraggio dell'infezione da HBV. Il metodo più comune per rilevare il DNA dell'HBV è la PCR in tempo reale, che può essere utilizzata per rilevare il virus e valutare la carica virale per monitorare la risposta alla terapia antivirale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione e la quantificazione del DNA dell'HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato su PCR in tempo reale marcato IVD. Il kit utilizza primer e sonde che mirano alla regione centrale altamente conservata del genoma dell'HBV e possono quantificare con precisione tutti i genotipi di HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). Il kit include anche un controllo interno endogeno per monitorare l'eventuale inibizione della PCR. Questo test viene eseguito per 40 cicli e il suo cutoff è di 38 Ct. Per la quantificazione del DNA dell'HBV nei campioni clinici, con il kit viene fornito un set di 5 standard di quantificazione. Gli standard contengono concentrazioni note di DNA specifico per l'HBV che sono calibrate rispetto al 4° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Gli standard sono utilizzati per convalidare la funzionalità dell'amplificazione del DNA HBV-specifico e per generare una curva standard, consentendo la quantificazione del DNA dell'HBV in un campione. Il DNA dell'HBV fino a 2,5 UI/mL è stato rilevato utilizzando il kit PCR. L'elevata sensibilità e riproducibilità del kit lo rendono un potente strumento nei laboratori clinici, aiutando gli operatori sanitari a diagnosticare e gestire efficacemente le infezioni da HBV.
Introduction
Il virus dell'epatite B (HBV) è un virus a DNA parzialmente a doppio filamento del genere Orthohepadnavirus e della famiglia Hepadnaviridae 1. Può scatenare un'infezione cronica che persiste per tutta la vita, portando potenzialmente a cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare 2,3,4. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2019 una popolazione stimata di 296 milioni di persone conviveva con l'infezione cronica da epatite B e 1,5 milioni di persone venivano infettate ogni anno5.
L'identificazione e la misurazione del DNA dell'HBV in campioni di siero o plasma sono un metodo prezioso per rilevare gli individui con un'infezione da epatite B in corso, valutare l'efficacia del trattamento antivirale e prevedere la probabilità di successo del trattamento 6,7,8,9,10,11. Un'elevata carica virale è associata a un aumentato rischio di progressione della malattia epatica, tra cui cirrosi e cancro al fegato12,13. Pertanto, la misurazione precisa della carica virale è fondamentale per monitorare la progressione dell'infezione da HBV e prendere decisioni informate in merito al trattamento.
I saggi quantitativi di PCR in tempo reale hanno una maggiore sensibilità, un intervallo dinamico più ampio e una quantificazione più accurata del DNA dell'HBV rispetto alle tecniche di PCR convenzionali 14,15,16,17. Sul mercato sono disponibili diversi kit diagnostici molecolari commerciali basati sulla PCR in tempo reale per la quantificazione del DNA dell'HBV in campioni di siero o plasma. In questo articolo, descriviamo un flusso di lavoro dettagliato per il rilevamento e la quantificazione del DNA dell'HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato sulla PCR in tempo reale disponibile in commercio e marcato IVD. Il kit è un test18,19 ampiamente utilizzato, a basso costo, ma altamente sensibile, e le sue caratteristiche prestazionali sono paragonabili a quelle di altri kit con marchio CE disponibili in commercio18. Oltre all'amplificazione della regione bersaglio dell'HBV, nel kit è incluso anche un gene di controllo interno endogeno per verificare la qualità dei campioni, la qualità del DNA estratto, l'amplificazione della PCR e l'eventuale inibizione della PCR.
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Protocol
Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani o campioni clinici. L'unico materiale biologico utilizzato è stato il 4° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Questo standard è un materiale di riferimento disponibile al pubblico che non contiene informazioni personali o dati identificabili. Pertanto, non è stata richiesta alcuna approvazione etica per questo studio.
1. Estrazione del DNA
- Estrarre il DNA virale da un campione di siero o plasma umano. Conservare il DNA estratto a -20 °C fino al successivo utilizzo in PCR.
NOTA: Il volume raccomandato di siero o plasma per l'estrazione del DNA è di 500 μL e il volume di eluizione è di 50 μL. In questo studio, il DNA virale è stato estratto utilizzando un kit di estrazione dell'acido nucleico virale (Table of Materials).
2. PCR in tempo reale
- Scongelare tutti i reagenti (Tabella 1) del kit di PCR in tempo reale a temperatura ambiente (RT; 15-25 °C) prima di iniziare la PCR. Una volta scongelati, miscelare i componenti mediante vortice a impulsi per 10 s a velocità moderata e centrifugare a 8.000 × g per 15 s a RT. Tenere tutti i componenti scongelati su un blocco di raffreddamento.
- Preparazione della reazione
- Preparare una miscela PCR secondo la Tabella 2. Calcolare il volume dei reagenti da aggiungere in base al numero di campioni, agli standard e all'assenza di controllo del modello.
NOTA: Quando si prepara la miscela PCR, è necessario aggiungere almeno il 10% in più di volume di ciascun reagente (ad esempio, se sono necessarie 10 reazioni, calcolare per 11 reazioni). - Pipettare 15 μL della miscela PCR preparata sopra in ciascuna provetta PCR. Quindi, aggiungere 15 μL del DNA del campione estratto. Aggiungere 15 μL di almeno uno degli standard per l'HBV (HBV Standard 1-5) come controllo positivo (PC) per la rilevazione del DNA dell'HBV e 15 μL di acqua priva di nucleasi di grado PCR come controllo negativo (NC). Per generare una curva standard richiesta per la quantificazione del DNA dell'HBV, utilizzare tutti e 5 gli standard di quantificazione forniti con il kit (HBV Standard 1-5) per ogni esecuzione della PCR.
- Chiudere le provette, miscelare i componenti mediante vortice a impulsi per 10 s a velocità moderata e centrifugare a 8.000 × g per 15 s a RT prima di procedere al termociclatore. Assicurarsi che non vi siano bolle nella miscela di reazione, in quanto potrebbe interferire con il rilevamento della fluorescenza.
- Preparare una miscela PCR secondo la Tabella 2. Calcolare il volume dei reagenti da aggiungere in base al numero di campioni, agli standard e all'assenza di controllo del modello.
- Impostazione del programma
- Programmare il termociclatore utilizzando le condizioni di ciclo consigliate nella Tabella 3.
- Selezione canale/fluoroforo
- Selezionare i coloranti fluorescenti per le piattaforme di PCR in tempo reale comunemente utilizzate, come indicato nella Tabella 4.
- Analisi dei dati
- Al termine dell'esecuzione, analizzare il grafico di amplificazione su scala lineare.
- Impostazione della soglia
- Impostare la soglia all'interno della fase esponenziale di una reazione PCR. I valori di soglia consigliati per il kit sono indicati nella Tabella 5. Essere coerenti con l'impostazione della soglia. Una volta determinata la soglia ottimale per il test, utilizzarla in modo coerente per tutti i campioni di una particolare macchina PCR. Ciò contribuirà a garantire che i risultati siano accurati e riproducibili.
NOTA: Se la soglia è impostata su un valore troppo basso, il segnale potrebbe essere inferiore al livello di rumore e il valore Ct sarà inaffidabile. Se la soglia è impostata su un valore troppo alto, il segnale potrebbe trovarsi nella fase di plateau della reazione, dove l'amplificazione non è altrettanto efficiente e il valore Ct potrebbe essere impreciso.
- Impostare la soglia all'interno della fase esponenziale di una reazione PCR. I valori di soglia consigliati per il kit sono indicati nella Tabella 5. Essere coerenti con l'impostazione della soglia. Una volta determinata la soglia ottimale per il test, utilizzarla in modo coerente per tutti i campioni di una particolare macchina PCR. Ciò contribuirà a garantire che i risultati siano accurati e riproducibili.
- Taglio
- Eseguire il kit per 40 cicli di amplificazione. Non considerare alcuna amplificazione oltre i 38 cicli per qualsiasi interpretazione.
- Analisi qualitativa dei risultati
- Utilizzare il kit per la rilevazione qualitativa del DNA dell'HBV. Utilizzare lo standard 2 come PC con valori di Ct attesi a 20 ± 2 per HBV e 24 ± 3 per IC.
- Assicurarsi che nessun controllo del modello (NTC) non presenti alcuna amplificazione sia per l'HBV che per i target di controllo interno (IC). Se si verifica una reazione di amplificazione nella reazione NTC, è possibile che si sia verificata una contaminazione del campione.
- Poiché il cutoff del test è 38, considerare qualsiasi amplificazione prima di 38 Ct per il target dell'HBV come un campione HBV-positivo. Quando tutti i controlli soddisfano i requisiti di cui sopra, prendere in considerazione un campione secondo le interpretazioni di cui alla tabella 6.
- Analisi quantitativa dei risultati
- Utilizzare l'insieme di 5 standard di quantificazione delle concentrazioni note per il DNA specifico dell'HBV calibrati rispetto al 4° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici (NAT)20 (Tabella 7).
- Utilizzate questi standard per generare una curva standard. Utilizzare la curva standard per quantificare il DNA dell'HBV di un campione sconosciuto.
NOTA: Il software di PCR in tempo reale genererà una curva standard utilizzando i valori Ct ottenuti per i target HBV di tutti e 5 gli standard e le loro corrispondenti concentrazioni in unità internazionali per microlitro (UI/μL). - Interpretare i valori per i campioni sconosciuti solo se la pendenza degli standard è compresa tra -3,1 e -3,6, il valore di R2 è compreso tra 0,99 e 1,0, l'efficienza della PCR è compresa tra il 90% e il 110% (0,9-1,1) e non vi è amplificazione nel controllo negativo.
- Il software calcolerà la concentrazione di ciascun campione HBV-positivo in unità internazionali per microlitro (UI/μL). Per calcolare la carica virale (conversione di UI/μL in unità internazionali per millilitro [UI/mL]), utilizzare la seguente equazione:
Risultato (UI/mL) = (Risultato [UI/μL] x Volume di eluizione [μL])/ Volume del campione (mL)
NOTA: Il 4° standard internazionale dell'OMS per il DNA HBV, codice NIBSC 10/266, è stato estratto per la purificazione del DNA virale da 0,5 mL di plasma, ha eluito il DNA virale purificato in 50 μL di tampone di eluizione e utilizzato con il kit PCR come campione di riferimento insieme ai 5 standard HBV e NTC. La carica virale dell'HBV del campione di riferimento (codice NIBSC 10/266) è stata calcolata come (6659 UI/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6,65,900 UI/mL.
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Representative Results
Nella Figura 1 è mostrato un diagramma schematico del flusso di lavoro per rilevare e quantificare il DNA dell'HBV dal plasma/siero umano. Nella Figura 2 è mostrato un grafico di amplificazione dello Standard 2 (utilizzato come PC) e NTC sia per HBV che per IC. La Figura 3 mostra le curve di amplificazione per un campione HBV-positivo, un campione HBV-negativo e un campione con inibizione della PCR. La curva di amplificazione, il valore Ct per l'HBV e la concentrazione di HBV ottenuta in unità internazionali per microlitro (UI/μL) per il codice NIBSC 10/266 sono mostrati nella Figura 4. Le curve di amplificazione per il target HBV di tutti e 5 gli standard HBV del kit e una curva standard rappresentativa per lo stesso sono mostrate nella Figura 5. La pendenza della curva standard è -3,361, R2 è 0,99996 e l'efficienza è 0,98. Le curve di amplificazione per il target IC di tutti e 5 gli standard HBV sono mostrate nella Figura 6.
Figura 1: Diagramma schematico del flusso di lavoro per rilevare e quantificare il DNA dell'HBV da campioni di plasma/siero umano. Estrarre il DNA virale da un campione di siero/plasma umano di un individuo sospetto di HBV. Preparare la miscela PCR aggiungendo ogni componente della PCR ad eccezione del DNA/standard stampo. Erogarlo in provette/pozzetti PCR. Aggiungere il DNA/gli standard virali estratti come DNA modello e chiudere le provette della PCR. Caricalo in una macchina PCR in tempo reale, avvia l'esecuzione della PCR e analizza il risultato dopo il completamento dell'esecuzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Grafico di amplificazione dello Standard 2 (usato come PC) e NTC. Un grafico di amplificazione dello standard 2 dell'HBV è mostrato qui per entrambi i target dell'HBV e dell'IC. Per l'analisi qualitativa dei risultati, lo Standard 2 può essere utilizzato come controllo positivo. Per NTC, non è stata osservata alcuna amplificazione per nessuno dei due bersagli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Grafici di amplificazione per un campione HBV positivo, un campione HBV negativo e un campione con inibizione della PCR. Di seguito sono riportati i grafici di amplificazione per tre diversi campioni: HBV positivo (Caso 1), HBV negativo (Caso 2) e un campione contenente inibitori della PCR (Caso 3). Nel caso del campione HBV positivo, entrambi i bersagli sono amplificati, mentre solo l'IC è stato amplificato per il campione HBV negativo e non è stata osservata alcuna amplificazione per il target HBV come previsto. Né l'HBV né l'IC sono stati amplificati per il Caso 3, il che significa che l'inibizione della PCR si è verificata a causa degli inibitori della PCR presenti nel campione di DNA utilizzato come modello PCR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curva di amplificazione, valore Ct per HBV e concentrazione di HBV ottenuta (UI/μL) per il codice NIBSC 10/266. Il DNA virale estratto del codice NIBSC 10/266 è stato analizzato insieme ai 5 standard HBV e NTC. La curva di amplificazione per il target HBV è mostrata per il campione con codice NIBSC 10/266 nel pannello superiore. Il suo valore Ct per l'HBV è 18,94 e la concentrazione calcolata è 6659 UI/μL, mostrata nel pannello inferiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Curve di amplificazione per il target HBV di tutti e 5 gli standard HBV e la curva standard. Le curve di amplificazione per il target HBV (canale verde) di tutti e 5 gli standard HBV sono mostrate nel pannello superiore. Nel pannello inferiore viene mostrata una curva standard con la sua pendenza (3,361), il valore R2 (0,99996) e l'efficienza PCR (0,98). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Curve di amplificazione per il target IC di tutti e 5 gli standard HBV. Di seguito sono riportate le curve di amplificazione di 5 standard HBV per l'IC (canale giallo). Come previsto, hanno lo stesso aspetto con valori Ct simili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Le curve di amplificazione per il target HBV di tutti e 5 gli standard HBV e NTC sono state eseguite in triplice copia. I grafici di amplificazione di tre repliche per il target HBV (canale verde) dei 5 standard HBV mostrano risultati simili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Curve di amplificazione per il target HBV del codice NIBSC 10/266, del codice NIBSC 14/198 e delle sue cinque diluizioni. Di seguito sono riportate le curve di amplificazione per il target HBV (canale verde) dei campioni di riferimento codice NIBSC 10/266, codice NIBSC 14/198 e le sue cinque diluizioni (1,25 UI/mL, 2,5 UI/mL, 5 UI/mL, 25 UI/mL e 50 UI/mL). Nessuna amplificazione è stata rilevata per 1,25 UI/mL, mentre altre diluizioni hanno mostrato curve di amplificazione corrette prima di 38 Ct. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Descrizione: __________ |
| Mix master multiplex | Tampone PCR, DNA polimerasi Taq Hot Start e altri componenti PCR |
| Miscela di sonde di primer HBV | Primer e miscela di sonde per il rilevamento dell'HBV |
| Miscela di sonde primer IC endogene | Primer e miscela di sonde per il rilevamento del controllo interno endogeno (IC) |
| Norme per l'HBV | · HBV Standard 1 |
| · HBV Standard 2 | |
| · HBV Standard 3 | |
| · HBV Standard 4 | |
| · HBV Standard 5 | |
| Controllo negativo | Acqua priva di nucleasi di grado PCR |
Tabella 1: Reagenti forniti con il kit di PCR in tempo reale e loro descrizione
| Reagente | Volume per reazione |
| Mix master multiplex | 11 μL |
| Miscela di sonde di primer HBV | 2 μL |
| Miscela di sonde primer IC endogene | 2 μL |
| Volume totale di reazione | 15 μL |
Tabella 2: Volume di ciascun reagente da aggiungere per reazione per la preparazione della miscela PCR
| Passo | Temperatura (°С) | Ore | Raccolta dei dati | Cicli |
| Denaturazione iniziale | 94 | 10 minuti | - | 1 |
| Cicli PCR | 94 | 15 secondi | - | 40 |
| 55 | Anni '60 | Su | ||
| 72 | 15 secondi | - |
Tabella 3: Condizioni del ciclo PCR
| Bersaglio | Rotore-Gene Q* | CFX 96 | PCR in tempo reale ABI# |
| HBV | Verde | FAM | FAM |
| IC | Giallo | MALOCCHIO | VIC |
| *Impostazione dell'ottimizzazione del guadagno automatico: selezionare "Esegui ottimizzazione prima della 1a acquisizione" | |||
| #Solo per le macchine per PCR in tempo reale di Applied Biosystems, selezionare ROX come colorante di "riferimento passivo" durante la configurazione della piastra, poiché la miscela principale del kit contiene ROX | |||
Tabella 4: Selezione del colorante per diverse piattaforme di PCR in tempo reale
| Strumento PCR in tempo reale | Coloranti | Intervallo di valori di soglia§ |
| PCR in tempo reale ABI¶ | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| MALOCCHIO | 50–400 | |
| Rotore-Gene Q | Verde | 0.015–0.03 |
| Giallo | 0.01–0.02 | |
| §Un valore di soglia assoluto varia da strumento a strumento a seconda dell'età, del modello e dello stato di calibrazione dello strumento | ||
| ¶Questi valori soglia sono applicabili quando ROX è selezionato come colorante "Riferimento passivo" | ||
| †La fluorescenza relativa aumenta da 2 a 5 volte quando si utilizzano le provette PCR bianche di Bio-Rad al posto delle provette trasparenti. Pertanto, il valore soglia dovrebbe essere determinato di conseguenza | ||
Tabella 5: Valori soglia raccomandati per diverse piattaforme di PCR in tempo reale
| Tipo di campione | Caso | Segnale di amplificazione in ingresso | Interpretazione dei risultati | |||
| FAM/Verde | HEX/VIC/Giallo | |||||
| Controllo | Standard 2/PC | Sì (20 ± 2) | Sì (24 ± 3) | Standard 2/PC funziona correttamente | ||
| NTC | No | No | NTC funziona correttamente | |||
| Campione | 1 | Sì | Sì / No* | Rilevato DNA specifico per l'HBV | ||
| 2 | No | Sì | DNA specifico per l'HBV non rilevato. Il campione non contiene una quantità rilevabile di DNA specifico per l'HBV | |||
| 3 | No | No | Possibile inibizione della PCR, diluire il campione di DNA (1:10) / riestrarre il DNA dal campione originale e ripetere la PCR | |||
| *Il rilevamento del controllo interno non è necessario quando viene rilevato il bersaglio dell'HBV. Un'elevata carica di HBV DNA nel campione può portare alla riduzione o all'assenza del segnale di controllo interno | ||||||
Tabella 6: Interpretazione dei risultati di inibitori positivi, negativi e PCR contenenti campioni di scarsa qualità
| Standard | Concentrazione (UI/μl) | Ct desiderata | |
| HBV | IC | ||
| (FAM/ Verde) | (HEX/VIC/Giallo) | ||
| HBV Standard 1 | 5 X 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 2 | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 3 | 5 X 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 4 | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 5 | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tabella 7: Standard dell'HBV e sua concentrazione dell'HBV target e valori di Ct desiderati
| Campione | Ct atteso | Ct ottenuto per HBV | Ct medio | Deviazione standard | CV % | ||
| Replica 1 | Replica 2 | Replica 3 | |||||
| HBV Standard 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV Standard 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV Standard 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV Standard 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV Standard 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tabella 8: Valori Ct ottenuti, media, deviazione standard e coefficiente di variazione (CV%) di 5 standard HBV.
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Discussion
Al codice NIBSC 10/266 è stata assegnata un'unità di 9,55,000 UI/mL quando ricostituito in 0,5 mL di acqua priva di nucleasi secondo le informazioni del fornitore21. Questo può essere considerato un campione positivo all'HBV ad alto carico. La carica virale dell'HBV determinata dal kit di carica virale utilizzato in questo studio è stata di 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Poiché l'efficienza di estrazione del DNA di qualsiasi kit di estrazione del DNA non è del 100%, una parte del DNA viene spesso persa durante il processo di purificazione. Sebbene la carica virale determinata dal kit sia leggermente inferiore al valore assegnato dal fornitore del reagente (codice NIBSC 10/266), i dati sono comunque soddisfacenti in quanto la differenza log10 tra i due valori è solo 0,157, che è inferiore al valore di cutoff (0,5)22.
Il kit per la carica virale utilizzato in questo protocollo è molto robusto e fornisce dati riproducibili, come mostrato nella Figura 7. In questo esperimento, tutti e 5 gli standard e le NTC sono stati eseguiti in triplice copia e i loro valori Ct, la media, la deviazione standard e il coefficiente di variazione (CV%) sono mostrati nella Tabella 8. Un CV% inferiore a meno dell'1%, come indicato nella Tabella 8, indica che l'esperimento è più affidabile e produce risultati altamente accurati.
Un campione di riferimento a carico molto basso (codice NIBSC: 14/198)23 è stato utilizzato con il kit per verificarne il LoD. Il codice NIBSC 14/198 contiene meno di 50 UI/mL di DNA HBV secondo le informazioni del fornitore. Il DNA è stato estratto dal codice NIBSC 14/198 e sono state preparate diluizioni multiple (1,25 UI/mL, 2,5 UI/mL, 5 UI/mL e 25 UI/mL) del DNA. Il kit utilizzava tutte le diluizioni e 5 standard di HBV come DNA stampo. È stato osservato che quel kit è in grado di rilevare tutte le diluizioni fino a 2,5 UI/mL di HBV DNA (Figura 8) e corrisponde esattamente al LoD del kit di carica virale. Pertanto, il kit per la carica virale è uno strumento altamente sensibile e riproducibile che i laboratori di diagnostica molecolare possono utilizzare per aiutare gli operatori sanitari a diagnosticare e gestire efficacemente le infezioni da HBV.
Gli utenti devono tenere a mente i seguenti passaggi critici quando eseguono la procedura. Gli utenti devono utilizzare solo DNA estratto di alta qualità come modello PCR per garantire risultati accurati. È importante evitare cicli multipli di gelo-scongelamento (non più di 3 volte) dei reagenti. La miscela PCR non deve essere esposta alla luce per lungo tempo in quanto contiene la sonda fluorescente sensibile alla luce e il colorante di riferimento passivo ROX. È fondamentale non includere sempre alcun controllo del modello e standard in ogni esecuzione per garantire l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati. Le pipette calibrate con puntali filtrati sterili devono essere sempre utilizzate. Il DNA e gli standard del modello devono essere aggiunti in un'area separata con una pipetta diversa dall'area di preparazione della reazione per evitare la contaminazione incrociata.
Di seguito sono riportati alcuni suggerimenti comuni per la risoluzione dei problemi per il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B basati sulla PCR in tempo reale. Il segnale di amplificazione nel controllo negativo può verificarsi a causa della contaminazione incrociata durante l'impostazione della reazione. Pertanto, l'utente dovrebbe verificare la presenza di contaminazione dei componenti del kit. Non può verificarsi alcun segnale di amplificazione con gli standard per i seguenti motivi: (i) Miscela PCR errata utilizzata. L'utente deve verificare se tutti i componenti sono stati aggiunti correttamente o meno. (ii) Uso di reagenti scaduti. L'utente deve controllare la data di scadenza prima di impostare la reazione. (iii) Conservazione impropria dei reagenti. Assicurarsi che i reagenti siano conservati a una temperatura pari o inferiore a -20 °C e non mantenuti a temperatura ambiente per lungo tempo durante la preparazione della reazione. (iv) È stata utilizzata una condizione di ciclo PCR errata. In tal caso, si consiglia di ripetere la PCR con il programma corretto. iv) Può verificarsi un segnale debole o assente del controllo interno per i campioni a causa dell'elevato carico di HBV nel campione e dell'inibizione della PCR. L'utente potrebbe diluire il campione di DNA (1:10) e ripetere il test per un elevato carico di HBV nel campione. In caso di inibizione della PCR, il DNA del campione deve essere riestratto con reagenti di buona qualità e il test deve essere ripetuto.
Il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B mediante PCR in tempo reale è una tecnica molto sensibile e specifica, ma presenta alcune limitazioni come il costo e la complessità. Gli strumenti e i reagenti per PCR in tempo reale possono essere costosi e il costo dei test può rappresentare un ostacolo per alcuni pazienti e sistemi sanitari. La PCR in tempo reale è una tecnica complessa che richiede personale addestrato per eseguire il test e interpretare i risultati. Si tratta di una misurazione indiretta della carica virale, quindi sia la qualità degli standard che il DNA modello possono influenzare il risultato. Il nuovo genotipo dell'HBV e/o la mutazione nella regione primer-sonda possono portare a risultati falsi negativi.
Il rilevamento e la quantificazione del DNA dell'HBV basati sulla PCR in tempo reale sono un metodo altamente sensibile e specifico in grado di rilevare bassi livelli di DNA virale. Rispetto ad altri metodi come i test sierologici (ELISA e test a flusso laterale), la PCR in tempo reale presenta diversi vantaggi. In primo luogo, è più sensibile dei test sierologici. In secondo luogo, può quantificare la quantità di DNA dell'HBV presente in un campione, mentre i test sierologici possono fornire solo un risultato qualitativo. Infine, la PCR in tempo reale è meno soggetta a falsi positivi rispetto ai test sierologici24. Nel complesso, la PCR in tempo reale è il metodo più sensibile, specifico e quantitativo disponibile per la rilevazione e la quantificazione del DNA dell'HBV. È anche una tecnica relativamente veloce, il che la rende ideale per l'uso clinico.
Il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B basati sulla PCR in tempo reale sono uno strumento potente con diverse applicazioni future, tra cui lo sviluppo di nuove terapie antivirali e test point-of-care. La tecnica può essere utilizzata per lo screening di nuovi farmaci antivirali e per monitorare l'efficacia di questi farmaci negli studi clinici. Ciò potrebbe portare allo sviluppo di trattamenti più efficaci e meno tossici per l'infezione da HBV. Gli strumenti di PCR in tempo reale stanno diventando sempre più piccoli e portatili, rendendo possibile l'esecuzione del test della carica virale dell'HBV presso il punto di cura. Ciò potrebbe migliorare l'accesso ai test e portare a una diagnosi e a un trattamento più precoci dell'infezione da HBV. I reggenti di questo kit basato sulla PCR in tempo reale possono essere adattati con la PCR digitale per una quantificazione assoluta per un monitoraggio più accurato del carico della fiala.
Oltre a queste applicazioni specifiche, è probabile che la rilevazione e la quantificazione del DNA dell'HBV basate sulla PCR in tempo reale svolgano un ruolo importante nella ricerca e nello sviluppo di nuovi strumenti e strategie per la prevenzione, la diagnosi e il trattamento dell'infezione da HBV.
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Disclosures
Gli autori sono associati a Kilpest India Limited, il produttore del kit per la carica virale dell'HBV utilizzato in questo studio.
Acknowledgments
Ringraziamo Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita e Shikha per la loro assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
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