Summary
Real-time polymerasekædereaktion (PCR)-baseret påvisning og kvantificering af hepatitis B-virus (HBV) DNA er en følsom og præcis metode til diagnosticering og overvågning af HBV-infektion. Her præsenterer vi en protokol til HBV DNA-detektion og viral belastningsmåling af en prøve.
Abstract
Hepatitis B-virus (HBV) er en væsentlig årsag til leversygdom på verdensplan. Det kan føre til akutte eller kroniske infektioner, hvilket gør individer meget modtagelige for dødelig skrumpelever og leverkræft. Nøjagtig påvisning og kvantificering af HBV-DNA i blodet er afgørende for diagnosticering og overvågning af HBV-infektion. Den mest almindelige metode til påvisning af HBV-DNA er PCR i realtid, som kan bruges til at detektere virussen og vurdere virusbelastningen for at overvåge responsen på antiviral behandling. Her beskriver vi en detaljeret protokol til påvisning og kvantificering af HBV-DNA i humant serum eller plasma ved hjælp af et IVD-mærket PCR-baseret sæt i realtid. Sættet bruger primere og sonder, der er målrettet mod den meget bevarede kerneregion i HBV-genomet og kan nøjagtigt kvantificere alle HBV-genotyper (A, B, C, D, E, F, G, H, I og J). Sættet indeholder også en endogen intern kontrol til overvågning af mulig PCR-hæmning. Dette assay løber i 40 cyklusser, og dets afskæring er 38 Ct. Til kvantificering af HBV-DNA i kliniske prøver leveres et sæt på 5 kvantificeringsstandarder med sættet. Standarderne indeholder kendte koncentrationer af HBV-specifikt DNA, der er kalibreret mod den 4. WHO-internationale standard for HBV-DNA til nukleinsyretesten (NIBSC-kode 10/266). Standarderne bruges til at validere funktionaliteten af den HBV-specifikke DNA-amplifikation og til at generere en standardkurve, der muliggør kvantificering af HBV-DNA i en prøve. HBV-DNA så lavt som 2,5 IE/ml blev påvist ved hjælp af PCR-sættet. Sættets høje følsomhed og reproducerbarhed gør det til et kraftfuldt værktøj i kliniske laboratorier, der hjælper sundhedspersonale med effektivt at diagnosticere og håndtere HBV-infektioner.
Introduction
Hepatitis B-virus (HBV) er en delvist dobbeltstrenget DNA-virus fra slægten Orthohepadnavirus og Hepadnaviridae-familien 1. Det kan udløse en kronisk infektion, der vedvarer hele livet, hvilket potentielt kan føre til levercirrose og hepatocellulært karcinom 2,3,4. Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) levede en anslået befolkning på 296 millioner mennesker med kronisk hepatitis B-infektion i 2019, og 1,5 millioner mennesker blev nyligt inficeret hvert år5.
Identifikation og måling af HBV-DNA i serum- eller plasmaprøver tjener som en værdifuld metode til påvisning af personer med en igangværende hepatitis B-infektion, vurdering af effekten af antiviral behandling og forudsigelse af sandsynligheden for behandlingssucces 6,7,8,9,10,11. Høj viral belastning er forbundet med en øget risiko for leversygdomsprogression, herunder skrumpelever og leverkræft 12,13. Derfor er præcis måling af viral belastning afgørende for at spore udviklingen af HBV-infektion og informere beslutninger om behandling.
Kvantitative PCR-assays i realtid har højere følsomhed, bredere dynamisk område og mere nøjagtig kvantificering af HBV-DNA end konventionelle PCR-teknikker 14,15,16,17. Flere kommercielle realtids PCR-baserede molekylære diagnostiske kits til kvantificering af HBV-DNA i serum- eller plasmaprøver er tilgængelige på markedet. Her beskriver vi en detaljeret arbejdsgang til påvisning og kvantificering af HBV-DNA i humant serum eller plasma ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt, IVD-mærket PCR-baseret sæt i realtid. Sættet er et meget anvendt18,19, billigt, men alligevel meget følsomt assay, og dets ydeevneegenskaber kan sammenlignes med andre kommercielt tilgængelige CE-mærkede sæt18. Bortset fra HBV-målregionamplifikationen er et endogent internt kontrolgen også inkluderet i sættet for at verificere kvaliteten af prøver, kvaliteten af ekstraheret DNA, PCR-amplifikation og mulig PCR-hæmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse involverede ingen menneskelige deltagere eller kliniske prøver. Det eneste biologiske materiale, der blev anvendt, var den 4. internationale WHO-standard for HBV-DNA til nukleinsyretest (NIBSC-kode 10/266). Denne standard er et offentligt tilgængeligt referencemateriale, der ikke indeholder personlige oplysninger eller identificerbare data. Som sådan var der ikke behov for etisk godkendelse til denne undersøgelse.
1. DNA-ekstraktion
- Uddrag det virale DNA fra human serum- eller plasmaprøve. Det ekstraherede DNA opbevares ved -20 °C indtil yderligere anvendelse i PCR.
BEMÆRK: Det anbefalede volumen serum eller plasma til DNA-ekstraktion er 500 μL, og elueringsvolumen er 50 μL. I denne undersøgelse blev det virale DNA ekstraheret ved hjælp af et viralt nukleinsyreekstraktionssæt (materialetabel).
2. PCR i realtid
- Optø alle reagenserne (tabel 1) i PCR-sættet i realtid ved stuetemperatur (RT; 15-25 °C), inden PCR startes. Når de er optøet, blandes komponenterne ved pulshvirvel i 10 s ved moderat hastighed og centrifugeres ved 8.000 × g i 15 s ved RT. Opbevar alle de optøede komponenter på en køleblok.
- Forberedelse af reaktion
- Forbered en PCR-blanding i henhold til tabel 2. Beregn volumenet af de reagenser, der skal tilføjes, baseret på antallet af prøver, standarder og ingen skabelonkontrol.
BEMÆRK: Ved tilberedning af PCR-blandingen skal der tilsættes mindst 10% ekstra volumen af hvert reagens (hvis der f.eks. kræves 10 reaktioner, beregnes for 11 reaktioner). - Der pipetteres 15 μL af ovennævnte PCR-blanding i hvert PCR-rør. Derefter tilsættes 15 μL af det ekstraherede prøve-DNA. Der tilsættes 15 μL af mindst én af standarderne for HBV (HBV-standard 1-5) som positiv kontrol (PC) til påvisning af HBV-DNA og 15 μL nukleasefrit vand af PCR-kvalitet som negativ kontrol (NC). For at generere en standardkurve, der kræves til kvantificering af HBV-DNA'et, skal du bruge alle 5 kvantificeringsstandarder, der følger med sættet (HBV Standard 1-5) for hver PCR-kørsel.
- Luk rørene, bland komponenterne ved pulshvirvler i 10 s ved moderat hastighed, og centrifuger ved 8.000 × g i 15 s ved RT, før du fortsætter til termisk cyklist. Sørg for, at der ikke er bobler i reaktionsblandingen, da det kan forstyrre fluorescensdetektion.
- Forbered en PCR-blanding i henhold til tabel 2. Beregn volumenet af de reagenser, der skal tilføjes, baseret på antallet af prøver, standarder og ingen skabelonkontrol.
- Opsætning af program
- Programmér den termiske cyklist ved hjælp af cykelforholdene som anbefalet i tabel 3.
- Valg af kanal/fluorofor
- Vælg fluorescerende farvestoffer til almindeligt anvendte PCR-platforme i realtid, som nævnt i tabel 4.
- Analyse af data
- Når kørslen er afsluttet, skal du analysere forstærkningsplottet i lineær skala.
- Indstilling af tærskel
- Indstil tærsklen inden for den eksponentielle fase af en PCR-reaktion. Anbefalede tærskelværdier for sættet er nævnt i tabel 5. Vær konsekvent med tærskelindstillingen. Når den optimale tærskel for analysen er bestemt, skal du bruge den konsekvent til alle prøverne til en bestemt PCR-maskine. Dette vil bidrage til at sikre, at resultaterne er nøjagtige og reproducerbare.
BEMÆRK: Hvis tærsklen er indstillet for lavt, kan signalet være under støjniveauet, og Ct-værdien vil være upålidelig. Hvis tærsklen er indstillet for højt, kan signalet være i reaktionens plateaufase, hvor forstærkningen ikke er så effektiv, og Ct-værdien kan være unøjagtig.
- Indstil tærsklen inden for den eksponentielle fase af en PCR-reaktion. Anbefalede tærskelværdier for sættet er nævnt i tabel 5. Vær konsekvent med tærskelindstillingen. Når den optimale tærskel for analysen er bestemt, skal du bruge den konsekvent til alle prøverne til en bestemt PCR-maskine. Dette vil bidrage til at sikre, at resultaterne er nøjagtige og reproducerbare.
- Cutoff
- Kør sættet i 40 forstærkningscyklusser. Overvej ikke nogen forstærkning ud over 38 cyklusser for nogen fortolkning.
- Kvalitativ resultatanalyse
- Brug sættet til kvalitativ påvisning af HBV-DNA. Brug Standard 2 som pc med forventede Ct-værdier ved 20 ± 2 for HBV og 24 ± 3 for IC.
- Sørg for, at ingen skabelonkontrol (NTC) ikke udviser nogen forstærkning for både HBV- og interne kontrolmål (IC). Hvis der opstår en amplifikationsreaktion i NTC-reaktionen, kan prøvekontaminering have fundet sted.
- Da analyseafskæringen er 38, skal enhver forstærkning før 38 Ct for HBV-målet betragtes som en HBV-positiv prøve. Når alle kontroller opfylder ovennævnte krav, overvejes en prøve efter fortolkningerne i tabel 6.
- Kvantitativ resultatanalyse
- Brug sættet med 5 kvantificeringsstandarder for kendte koncentrationer for HBV-specifikt DNA, der er kalibreret i forhold til WHO's 4. internationale standard for HBV-DNA for nukleinsyreamplifikationsteknikker (NAT)20 (tabel 7).
- Anvend disse standarder til at generere en standardkurve. Brug standardkurven til at kvantificere HBV-DNA'et i en ukendt prøve.
BEMÆRK: PCR-softwaren i realtid genererer en standardkurve ved hjælp af Ct-værdierne opnået for HBV-målene for alle 5 standarder og deres tilsvarende koncentrationer i internationale enheder pr. mikroliter (IE / μL). - Fortolk kun værdierne for ukendte prøver, hvis standardernes hældning falder mellem -3,1 og -3,6,R2-værdien er mellem 0,99 og 1,0, PCR-effektiviteten er mellem 90% -110% (0,9-1,1), og der er ingen forstærkning i den negative kontrol.
- Softwaren beregner koncentrationen af hver HBV-positiv prøve i internationale enheder pr. mikroliter (IE/μL). For at beregne virusbelastningen (omregning af IE / μL til internationale enheder pr. milliliter [IE / ml]) skal du bruge følgende ligning:
Resultat (IE/ml) = (resultat [IU/μL] x elueringsvolumen [μL])/prøvevolumen (ml)
BEMÆRK: Den 4. WHO International Standard for HBV DNA, NIBSC-kode 10/266, blev ekstraheret til viral DNA-oprensning fra 0,5 ml plasma, elueret det oprensede virale DNA til 50 μL elueringsbuffer og anvendt med PCR-sættet som referenceprøve sammen med de 5 HBV-standarder og NTC. HBV-virusbelastningen i referenceprøven (NIBSC-kode 10/266) blev beregnet som (6659 IE/μL x 50 μL)/0,5 ml = 6,65,900 IE/ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 indeholder et skematisk diagram over arbejdsgangen til påvisning og kvantificering af HBV-DNA fra humant plasma/serum. Et forstærkningsplot af Standard 2 (brugt som pc) og NTC for både HBV og IC er vist i figur 2. Figur 3 viser amplifikationskurverne for en HBV-positiv prøve, en HBV-negativ prøve og en prøve med PCR-hæmning. Amplifikationskurven, Ct-værdien for HBV og den opnåede HBV-koncentration i internationale enheder pr. mikroliter (IE/μL) for NIBSC-koden 10/266 er vist i figur 4. Forstærkningskurver for HBV-målet for alle sættets 5 HBV-standarder og en repræsentativ standardkurve for samme er vist i figur 5. Standardkurvens hældning er -3, 361,R2 er 0, 99996, og effektiviteten er 0, 98. Forstærkningskurver for IC-målet for alle 5 HBV-standarder er vist i figur 6.
Figur 1: Skematisk diagram over arbejdsgangen til påvisning og kvantificering af HBV-DNA fra humane plasma-/serumprøver. Uddrag viralt DNA fra human serum / plasmaprøve af HBV-mistænkt individ. Forbered PCR-blandingen ved at tilføje hver PCR-komponent undtagen skabelon-DNA/standard(er). Dispenser det i PCR-rør/brønde. Tilføj det ekstraherede virale DNA / standard (er) som skabelon-DNA, og luk PCR-rørene. Indlæs den i en PCR-maskine i realtid, start PCR-kørslen, og analyser resultatet efter afslutningen af kørslen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forstærkningsplot af Standard 2 (brugt som pc) og NTC. Et forstærkningsplot af HBV-standard 2 vises her for både HBV- og IC-målene. Til kvalitativ resultatanalyse kan Standard 2 bruges som en positiv kontrol. For NTC blev der ikke observeret nogen forstærkning for nogen af målene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Amplifikationsdiagrammer for HBV-positiv prøve, HBV-negativ prøve og en prøve med PCR-hæmning. Amplifikationsplots for tre forskellige prøver: HBV-positive (tilfælde 1), HBV-negative (tilfælde 2) og en prøve indeholdende PCR-hæmmere (tilfælde 3) er vist her. For HBV-positiv prøve er begge mål amplificeret, mens kun IC blev amplificeret for HBV-negativ prøve, og der blev ikke observeret amplifikation for HBV-målet som forventet. Hverken HBV eller IC blev amplificeret til tilfælde 3, hvilket betyder, at PCR-hæmning opstod på grund af PCR-hæmmere til stede i DNA-prøven, der blev brugt som PCR-skabelon. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Amplifikationskurve, Ct-værdi for HBV og opnået HBV-koncentration (IE/μL) for NIBSC-kode 10/266. Ekstraheret viralt DNA af NIBSC-kode 10/266 blev kørt sammen med de 5 HBV-standarder og NTC. Forstærkningskurven for HBV-målet vises for NIBSC-koden 10/266-prøven i det øverste panel. Dens Ct-værdi for HBV er 18,94, og den beregnede koncentration er 6659 IE / μL, vist i det nederste panel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Forstærkningskurver for HBV-målet for alle 5 HBV-standarder og standardkurven. Forstærkningskurver for HBV-målet (grøn kanal) for alle 5 HBV-standarder vises i det øverste panel. En standardkurve sammen med dens hældning (3,361),R2-værdi (0,99996) og PCR-effektivitet (0,98) vises i det nederste panel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Forstærkningskurver for IC-målet for alle 5 HBV-standarder. Forstærkningskurver for 5 HBV-standarder for IC (gul kanal) er vist her. Som forventet ser de ens ud med lignende Ct-værdier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Forstærkningskurverne for HBV-målet for alle 5 HBV-standarder og NTC blev kørt i tre eksemplarer. Forstærkningsplottene for tre replikater for HBV-målet (grøn kanal) i de 5 HBV-standarder viser lignende resultater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Forstærkningskurver for HBV-målet for NIBSC-kode 10/266, NIBSC-kode 14/198 og dens fem fortyndinger. Forstærkningskurverne for HBV-målet (grøn kanal) for referenceprøverne NIBSC-kode 10/266, NIBSC-kode 14/198 og dens fem fortyndinger (1,25 IE/ml, 2,5 IE/ml, 5 IE/ml, 25 IE/ml og 50 IE/ml) er vist her. Der blev ikke påvist amplifikation for 1,25 IE/ml, mens andre fortyndinger viste korrekte amplifikationskurver før 38 Ct. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Beskrivelse |
| Multiplex master mix | PCR-buffer, Hot Start Taq DNA-polymerase og andre PCR-komponenter |
| HBV primer sonde mix | Primere og sondeblanding til HBV-detektion |
| Endogen IC primer sonde mix | Primere og sondeblanding til endogen intern kontrol (IC) detektion |
| Standarder for HBV | · HBV Standard 1 |
| · HBV Standard 2 | |
| · HBV Standard 3 | |
| · HBV Standard 4 | |
| · HBV Standard 5 | |
| Negativ kontrol | PCR-nukleasefrit vand |
Tabel 1: Reagenser, der leveres med PCR-sættet i realtid, og deres beskrivelse
| Reagens | Volumen pr. reaktion |
| Multiplex master mix | 11 μL |
| HBV primer sonde mix | 2 μL |
| Endogen IC primer sonde mix | 2 μL |
| Samlet reaktionsvolumen | 15 μL |
Tabel 2: Volumen af hvert reagens, der skal tilsættes pr. reaktion til PCR-blandingspræparation
| Skridt | Temperatur (°є) | Tidspunkt | Dataindsamling | Cykler |
| Indledende denaturering | 94 | 10 minutter | - | 1 |
| PCR-cykling | 94 | 15 sek | - | 40 |
| 55 | 60 s | På | ||
| 72 | 15 sek | - |
Tabel 3: PCR-cykelforhold
| Mål | Rotor-gen Q* | CFX 96 | ABI PCR i realtid# |
| HBV | Grøn | FAM | FAM |
| IC | Gul | HEX | VIC |
| *Automatisk optimering af gevinst - vælg 'Udfør optimering før 1. anskaffelse' | |||
| #Kun for Applied Biosystems' PCR-maskiner i realtid skal du vælge ROX som 'passiv reference'-farvestof under pladeopsætning, da masterblandingen af sættet indeholder ROX | |||
Tabel 4: Valg af farvestof til forskellige PCR-platforme i realtid
| PCR-instrument i realtid | Farvestoffer | Tærskelværdiinterval§ |
| ABI PCR¶ i realtid | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| HEX | 50–400 | |
| Rotor-gen Q | Grøn | 0.015–0.03 |
| Gul | 0.01–0.02 | |
| §En absolut tærskelværdi varierer fra instrument til instrument afhængigt af instrumentets alder, model og kalibreringsstatus | ||
| ¶Disse tærskelværdier gælder, når ROX vælges som farvestoffet 'passiv reference' | ||
| †Relativ fluorescens øges med ca. 2 til 5 gange, når Bio-Rads hvide PCR-rør anvendes i stedet for klare rør. Så tærskelværdien bør bestemmes i overensstemmelse hermed | ||
Tabel 5: Anbefalede tærskelværdier for forskellige PCR-platforme i realtid
| Eksempel type | Tilfælde | Forstærkningssignal ind | Resultat fortolkning | |||
| FAM/Grøn | HEX/VIC/gul | |||||
| Kontrol | Standard 2/PC | Ja (20 ± 2) | Ja (24 ± 3) | Standard 2/PC fungerer korrekt | ||
| NTC | Nej | Nej | NTC fungerer korrekt | |||
| Prøve | 1 | Ja | Ja / Nej* | HBV-specifikt DNA påvist | ||
| 2 | Nej | Ja | HBV-specifikt DNA ikke påvist. Prøven indeholder ikke påviselig mængde HBV-specifikt DNA | |||
| 3 | Nej | Nej | Mulig hæmning af PCR, fortynd DNA-prøven (1:10) / ekstraher DNA igen fra den oprindelige prøve og gentag PCR | |||
| *Registrering af den interne kontrol er ikke påkrævet, når HBV-målet registreres. Høj HBV DNA-belastning i prøven kan føre til reduktion eller fravær af internt kontrolsignal | ||||||
Tabel 6: Resultatfortolkning af positive, negative og PCR-hæmmere, der indeholder prøver af dårlig kvalitet
| Norm | Koncentration (IE/μl) | Ønsket Ct | |
| HBV | IC | ||
| (FAM/ Grøn) | (HEX/VIC/gul) | ||
| HBV Standard 1 | 5 X 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 2 | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 3 | 5 X 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 4 | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV Standard 5 | 5 X 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tabel 7: HBV-standarder og dens koncentration af HBV-målet og de ønskede Ct-værdier
| Prøve | Forventet Ct | Opnået Ct for HBV | Gennemsnitlig Ct | Standardafvigelse | CV % | ||
| Repliker 1 | Repliker 2 | Repliker 3 | |||||
| HBV Standard 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV Standard 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV Standard 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV Standard 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV Standard 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tabel 8: Opnåede Ct-værdier, gennemsnit, standardafvigelse og variationskoefficient (CV%) på 5 HBV-standarder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIBSC-kode 10/266 er blevet tildelt en enhed på 9,55,000 IE / ml, når den rekonstitueres i 0,5 ml nukleasefrit vand i henhold til leverandøroplysningerne21. Dette kan betragtes som en HBV-positiv prøve med høj belastning. HBV-virusbelastningen bestemt af det virale belastningssæt, der blev brugt i denne undersøgelse, var 6,65,900 IE / ml (figur 4). Da DNA-ekstraktionseffektiviteten af ethvert DNA-ekstraktionssæt ikke er 100%, går noget DNA ofte tabt under rensningsprocessen. Selvom den virale belastning bestemt af kittet er lidt lavere end reagensleverandørens (NIBSC-kode 10/266) leverandørens tildelte værdi, er dataene stadig tilfredsstillende, da log10-forskellen mellem de to værdier kun er 0.157, hvilket er mindre end afskæringsværdien (0.5)22.
Det virale belastningssæt, der anvendes i denne protokol, er meget robust og giver reproducerbare data, som vist i figur 7. I dette eksperiment blev alle 5 standarder og NTC kørt i tre eksemplarer, og deres Ct-værdier, gennemsnit, standardafvigelse og variationskoefficient (CV%) er vist i tabel 8. En lavere CV% på mindre end 1%, som nævnt i tabel 8, indikerer, at eksperimentet er mere pålideligt og giver meget nøjagtige resultater.
En referenceprøve med meget lav belastning (NIBSC-kode: 14/198)23 blev brugt sammen med sættet til at kontrollere dets LoD. NIBSC-kode 14/198 indeholder mindre end 50 IE/ml HBV-DNA ifølge leverandøroplysningerne. DNA blev ekstraheret fra NIBSC-kode 14/198, og flere fortyndinger (1,25 IE / ml, 2,5 IE / ml, 5 IE / ml og 25 IE / ml) af DNA'et blev fremstillet. Sættet brugte alle fortyndinger og 5 HBV-standarder som skabelon-DNA. Det blev observeret, at dette kit kan detektere alle fortyndinger op til 2,5 IE / ml HBV-DNA (figur 8), og det matcher nøjagtigt LoD for det virale belastningssæt. Derfor er det virale belastningssæt et meget følsomt og reproducerbart værktøj, som molekylære diagnostiske laboratorier kan bruge til at hjælpe sundhedspersonale med at diagnosticere og håndtere HBV-infektioner effektivt.
Brugere skal huske følgende kritiske trin, når de udfører proceduren. Brugerne må kun anvende ekstraheret DNA af høj kvalitet som PCR-skabelon for at sikre nøjagtige resultater. Det er vigtigt at undgå flere fryse-optøningscyklusser (ikke mere end 3 gange) af reagenserne. PCR-blandingen bør ikke udsættes for lys i lang tid, da den indeholder den lysfølsomme fluorescerende sonde og det passive referencefarvestof ROX. Det er vigtigt altid at medtage ingen skabelonkontrol og standarder i hver kørsel for at sikre resultaternes nøjagtighed og pålidelighed. Kalibrerede pipetter med sterilt filtrerede spidser skal altid anvendes. Skabelon-DNA og standarder skal tilsættes i et separat område med en anden pipette end reaktionsforberedelsesområdet for at undgå krydskontaminering.
Følgende er nogle almindelige fejlfindingstip til PCR-baseret påvisning og kvantificering af hepatitis B-virus-DNA i realtid. Forstærkningssignal i negativ kontrol kan ske på grund af krydskontaminering under reaktionsopsætning. Så brugeren skal kontrollere for forurening af kitkomponenter. Der kan ikke forekomme forstærkningssignal med standarder på grund af følgende årsager: (i) Forkert PCR-blanding anvendt. Brugeren skal kontrollere, om alle komponenter er tilføjet korrekt eller ej. ii) Anvendelse af udløbne reagenser. Brugeren skal kontrollere udløbsdatoen, før reaktionen oprettes. iii) Ukorrekt opbevaring af reagenser. Sørg for, at reagenserne opbevares ved -20 °C eller derunder og ikke opbevares ved stuetemperatur i lang tid under reaktionsopsætningen. (iv) Der blev anvendt forkerte PCR-cykelforhold. I et sådant tilfælde anbefales det at gentage PCR med det korrekte program. iv) Der kan forekomme svagt eller intet signal om intern kontrol af prøver på grund af høj HBV-belastning i prøven og PCR-hæmning. Brugeren kan fortynde DNA-prøven (1:10) og gentage analysen for høj HBV-belastning i prøven. I tilfælde af PCR-hæmning skal prøve-DNA'et ekstraheres igen med reagenser af god kvalitet, og analysen skal gentages.
PCR-baseret påvisning og kvantificering i realtid af hepatitis B-virus-DNA er en meget følsom og specifik teknik, men den har nogle begrænsninger som omkostninger og kompleksitet. PCR-instrumenter og reagenser i realtid kan være dyre, og omkostningerne ved test kan være en barriere for nogle patienter og sundhedssystemer. PCR i realtid er en kompleks teknik, der kræver uddannet personale til at udføre analysen og fortolke resultaterne. Det er en indirekte måling af virusbelastningen, så både kvaliteten af standarderne og skabelon-DNA kan påvirke resultatet. Ny genotype af HBV og/eller mutation(er) i primersonderegionen kan føre til falsk negative resultater.
PCR-baseret påvisning og kvantificering af HBV-DNA i realtid er en meget følsom og specifik metode, der kan detektere lave niveauer af viralt DNA. Sammenlignet med andre metoder som serologiske tests (ELISA og lateral flow assay) har PCR i realtid flere fordele. For det første er det mere følsomt end de serologiske test. For det andet kan det kvantificere mængden af HBV-DNA i en prøve, mens serologiske tests kun kan give et kvalitativt resultat. Endelig er PCR i realtid mindre tilbøjelig til falske positive end de serologiske test24. Samlet set er PCR i realtid den mest følsomme, specifikke og kvantitative metode, der er tilgængelig til påvisning og kvantificering af HBV-DNA. Det er også en relativt hurtig teknik, hvilket gør den ideel til klinisk brug.
PCR-baseret påvisning og kvantificering i realtid af hepatitis B-virus-DNA er et kraftfuldt værktøj med flere fremtidige anvendelser, herunder udvikling af nye antivirale terapier og point-of-care-test. Teknikken kan bruges til at screene nye antivirale lægemidler og til at overvåge effektiviteten af disse lægemidler i kliniske forsøg. Dette kan føre til udvikling af mere effektive og mindre toksiske behandlinger for HBV-infektion. PCR-instrumenter i realtid bliver mindre og mere bærbare, hvilket gør det muligt at udføre HBV-virusbelastningstest på behandlingsstedet. Dette kan forbedre adgangen til testning og føre til tidligere diagnosticering og behandling af HBV-infektion. Regenterne i dette PCR-baserede sæt i realtid kan tilpasses med digital PCR til absolut kvantificering for mere nøjagtig overvågning af hætteglassets belastning.
Ud over disse specifikke anvendelser vil PCR-baseret påvisning og kvantificering i realtid af HBV-DNA sandsynligvis spille en vigtig rolle i forskning og udvikling af nye værktøjer og strategier til forebyggelse, diagnosticering og behandling af HBV-infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er forbundet med Kilpest India Limited, producenten af HBV viral load kit, der anvendes i denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi anerkender Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita og Shikha for deres tekniske assistance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
