Summary
Der auf der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Nachweis und die Quantifizierung der DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) ist eine empfindliche und genaue Methode zur Diagnose und Überwachung von HBV-Infektionen. Hier stellen wir ein Protokoll für den HBV-DNA-Nachweis und die Viruslastmessung einer Probe vor.
Abstract
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist weltweit eine der Hauptursachen für Lebererkrankungen. Es kann zu akuten oder chronischen Infektionen führen, was die Menschen sehr anfällig für tödliche Leberzirrhose und Leberkrebs macht. Der genaue Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA im Blut sind für die Diagnose und Überwachung einer HBV-Infektion unerlässlich. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis von HBV-DNA ist die Echtzeit-PCR, mit der das Virus nachgewiesen und die Viruslast beurteilt werden kann, um das Ansprechen auf eine antivirale Therapie zu überwachen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA in humanem Serum oder Plasma unter Verwendung eines IVD-markierten Real-Time-PCR-basierten Kits. Das Kit verwendet Primer und Sonden, die auf die hochkonservierte Kernregion des HBV-Genoms abzielen und alle HBV-Genotypen (A, B, C, D, E, F, G, H, I und J) genau quantifizieren können. Das Kit enthält auch eine endogene interne Kontrolle zur Überwachung einer möglichen PCR-Hemmung. Dieser Assay läuft über 40 Zyklen und sein Cutoff liegt bei 38 Ct. Für die Quantifizierung von HBV-DNA in klinischen Proben wird ein Satz von 5 Quantifizierungsstandards mit dem Kit geliefert. Die Standards enthalten bekannte Konzentrationen von HBV-spezifischer DNA, die gegen den 4. Internationalen Standard der WHO für HBV-DNA für den Nukleinsäuretest (NIBSC-Code 10/266) kalibriert sind. Die Standards werden verwendet, um die Funktionalität der HBV-spezifischen DNA-Amplifikation zu validieren und eine Standardkurve zu erstellen, die die Quantifizierung von HBV-DNA in einer Probe ermöglicht. HBV-DNA mit einem Gehalt von nur 2,5 IE/ml wurde mit dem PCR-Kit nachgewiesen. Die hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Kits machen es zu einem leistungsstarken Werkzeug in klinischen Labors, das medizinisches Fachpersonal bei der effektiven Diagnose und Behandlung von HBV-Infektionen unterstützt.
Introduction
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein teilweise doppelsträngiges DNA-Virus aus der Gattung Orthohepadnavirus und der Familie der Hepadnaviridae 1. Es kann eine chronische Infektion auslösen, die ein Leben lang anhält und möglicherweise zu Leberzirrhose und hepatozellulärem Karzinom führt 2,3,4. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) lebten im Jahr 2019 schätzungsweise 296 Millionen Menschen mit einer chronischen Hepatitis-B-Infektion, undjedes Jahr infizierten sich 1,5 Millionen Menschen neu 5.
Die Identifizierung und Messung von HBV-DNA in Serum- oder Plasmaproben dient als wertvolle Methode zum Nachweis von Personen mit einer laufenden Hepatitis-B-Infektion, zur Beurteilung der Wirksamkeit einer antiviralen Behandlung und zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolgs 6,7,8,9,10,11. Eine hohe Viruslast ist mit einem erhöhten Risiko für das Fortschreiten von Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Leberkrebs, verbunden12,13. Daher ist eine präzise Messung der Viruslast von entscheidender Bedeutung, um das Fortschreiten der HBV-Infektion zu verfolgen und Entscheidungen über die Behandlung zu treffen.
Quantitative Real-Time-PCR-Assays haben eine höhere Sensitivität, einen breiteren Dynamikbereich und eine genauere Quantifizierung der HBV-DNA als herkömmliche PCR-Techniken 14,15,16,17. Auf dem Markt sind mehrere kommerzielle real-time PCR-basierte molekulardiagnostische Kits für die Quantifizierung von HBV-DNA in Serum- oder Plasmaproben erhältlich. Hier beschreiben wir einen detaillierten Arbeitsablauf für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA in humanem Serum oder Plasma unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen, IVD-markierten Real-Time-PCR-basierten Kits. Bei dem Kit handelt es sich um einen weit verbreiteten, kostengünstigen und dennoch hochempfindlichen 18,19-Test, dessen Leistungsmerkmale mit denen anderer kommerziell erhältlicher CE-gekennzeichneter Kits vergleichbar sind18. Neben der Amplifikation der HBV-Zielregion ist auch ein endogenes internes Kontrollgen im Kit enthalten, um die Qualität der Proben, die Qualität der extrahierten DNA, die PCR-Amplifikation und eine mögliche PCR-Hemmung zu überprüfen.
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Protocol
An dieser Studie wurden keine menschlichen Teilnehmer oder klinischen Proben beteiligt. Das einzige biologische Material, das verwendet wurde, war der 4. Internationale Standard der WHO für HBV-DNA für Nukleinsäuretests (NIBSC-Code 10/266). Bei dieser Norm handelt es sich um ein öffentlich zugängliches Referenzmaterial, das keine personenbezogenen oder identifizierbaren Daten enthält. Daher war für diese Studie keine ethische Genehmigung erforderlich.
1. DNA-Extraktion
- Extrahieren Sie die virale DNA aus einer menschlichen Serum- oder Plasmaprobe. Lagern Sie die extrahierte DNA bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung in der PCR.
HINWEIS: Das empfohlene Serum- oder Plasmavolumen für die DNA-Extraktion beträgt 500 μl und das Elutionsvolumen 50 μl. In dieser Studie wurde die virale DNA mit einem viralen Nukleinsäure-Extraktionskit extrahiert (Materialtabelle).
2. Echtzeit-PCR
- Tauen Sie alle Reagenzien (Tabelle 1) des Real-Time-PCR-Kits bei Raumtemperatur (RT; 15-25 °C) auf, bevor Sie mit der PCR beginnen. Nach dem Auftauen werden die Komponenten durch Impulswirbeln für 10 s bei moderater Geschwindigkeit gemischt und bei 8.000 × g 15 s bei RT zentrifugiert. Alle aufgetauten Komponenten auf einem Kühlblock aufbewahren.
- Vorbereitung der Reaktion
- Bereiten Sie eine PCR-Mischung gemäß Tabelle 2 vor. Berechnen Sie das Volumen der hinzuzufügenden Reagenzien basierend auf der Anzahl der Proben, Standards und ohne Template-Kontrolle.
HINWEIS: Bei der Herstellung der PCR-Mischung sollten mindestens 10 % zusätzliches Volumen jedes Reagenzes hinzugefügt werden (z. B. wenn 10 Reaktionen erforderlich sind, rechnen Sie mit 11 Reaktionen). - Pipettieren Sie 15 μl der oben zubereiteten PCR-Mischung in jedes PCR-Röhrchen. Geben Sie dann 15 μl der extrahierten Proben-DNA hinzu. Fügen Sie 15 μl mindestens eines der Standards für HBV (HBV-Standard 1-5) als Positivkontrolle (PC) zum Nachweis von HBV-DNA und 15 μl nukleasefreies Wasser in PCR-Qualität als Negativkontrolle (NC) hinzu. Um eine Standardkurve zu erstellen, die für die Quantifizierung der HBV-DNA erforderlich ist, verwenden Sie für jeden PCR-Lauf alle 5 mit dem Kit gelieferten Quantifizierungsstandards (HBV-Standard 1-5).
- Verschließen Sie die Röhrchen, mischen Sie die Komponenten durch Pulswirbeln für 10 s bei moderater Geschwindigkeit und zentrifugieren Sie bei 8.000 × g für 15 s bei RT, bevor Sie zum Thermocycler gelangen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Reaktionsmischung befinden, da dies die Fluoreszenzdetektion beeinträchtigen kann.
- Bereiten Sie eine PCR-Mischung gemäß Tabelle 2 vor. Berechnen Sie das Volumen der hinzuzufügenden Reagenzien basierend auf der Anzahl der Proben, Standards und ohne Template-Kontrolle.
- Einrichtung des Programms
- Programmieren Sie den Thermocycler unter den in Tabelle 3 empfohlenen Zyklusbedingungen.
- Kanal-/Fluorophor-Auswahl
- Wählen Sie die Fluoreszenzfarbstoffe für häufig verwendete Real-Time-PCR-Plattformen aus, wie in Tabelle 4 beschrieben.
- Datenanalyse
- Analysieren Sie nach Abschluss des Laufs das Verstärkungsdiagramm auf einer linearen Skala.
- Einstellung des Schwellenwerts
- Legen Sie den Schwellenwert innerhalb der exponentiellen Phase einer PCR-Reaktion fest. Die empfohlenen Schwellenwerte für das Kit sind in Tabelle 5 aufgeführt. Halten Sie sich konsequent an die Einstellung des Schwellenwerts. Sobald der optimale Schwellenwert für den Assay bestimmt ist, verwenden Sie ihn konsistent für alle Proben für ein bestimmtes PCR-Gerät. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse genau und reproduzierbar sind.
HINWEIS: Wenn der Schwellenwert zu niedrig eingestellt ist, kann das Signal unter dem Rauschpegel liegen, und der Ct-Wert ist unzuverlässig. Wenn der Schwellenwert zu hoch eingestellt ist, kann sich das Signal in der Plateauphase der Reaktion befinden, in der die Verstärkung nicht so effizient ist, und der Ct-Wert kann ungenau sein.
- Legen Sie den Schwellenwert innerhalb der exponentiellen Phase einer PCR-Reaktion fest. Die empfohlenen Schwellenwerte für das Kit sind in Tabelle 5 aufgeführt. Halten Sie sich konsequent an die Einstellung des Schwellenwerts. Sobald der optimale Schwellenwert für den Assay bestimmt ist, verwenden Sie ihn konsistent für alle Proben für ein bestimmtes PCR-Gerät. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse genau und reproduzierbar sind.
- Abkürzung
- Führen Sie das Kit für 40 Amplifikationszyklen aus. Berücksichtigen Sie keine Verstärkung über 38 Zyklen hinaus für die Interpretation.
- Qualitative Ergebnisanalyse
- Verwenden Sie das Kit für den qualitativen Nachweis von HBV-DNA. Verwenden Sie Standard 2 als PC mit erwarteten Ct-Werten von 20 ± 2 für HBV und 24 ± 3 für IC.
- Stellen Sie sicher, dass keine Template-Kontrolle (NTC) keine Verstärkung sowohl für HBV- als auch für IC-Ziele (Internal Control Targets) aufweist. Wenn in der NTC-Reaktion eine Amplifikationsreaktion auftritt, kann es zu einer Probenkontamination gekommen sein.
- Da der Cutoff-Wert des Assays bei 38 liegt, sollte jede Amplifikation vor 38 Ct für das HBV-Ziel als HBV-positive Probe betrachtet werden. Wenn alle Kontrollen die oben genannten Anforderungen erfüllen, ist eine Probe gemäß den in Tabelle 6 genannten Interpretationen in Betracht zu ziehen.
- Quantitative Ergebnisanalyse
- Verwenden Sie den Satz von 5 Quantifizierungsstandards bekannter Konzentrationen für HBV-spezifische DNA, die anhand des 4. Internationalen Standards der WHO für HBV-DNA für Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)20 kalibriert sind (Tabelle 7).
- Verwenden Sie diese Standards, um eine Standardkurve zu erstellen. Verwenden Sie die Standardkurve, um die HBV-DNA einer unbekannten Probe zu quantifizieren.
HINWEIS: Die Real-Time-PCR-Software generiert eine Standardkurve mit den Ct-Werten, die für die HBV-Ziele aller 5 Standards und den entsprechenden Konzentrationen in internationalen Einheiten pro Mikroliter (IE/μl) erhalten wurden. - Interpretieren Sie die Werte für unbekannte Proben nur, wenn die Steigung der Standards zwischen -3,1 und -3,6 liegt, derR2-Wert zwischen 0,99 und 1,0 liegt, die PCR-Effizienz zwischen 90 % und 110 % (0,9-1,1) liegt und keine Amplifikation in der Negativkontrolle vorliegt.
- Die Software berechnet die Konzentration jeder HBV-positiven Probe in internationalen Einheiten pro Mikroliter (IE/μl). Um die Viruslast (Umrechnung von IE/μl in internationale Einheiten pro Milliliter [IE/ml]) zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung:
Ergebnis (IE/ml) = (Ergebnis [IE/μl] x Elutionsvolumen [μl])/ Probenvolumen (mL)
ANMERKUNG: Der 4. Internationale Standard der WHO für HBV-DNA, NIBSC-Code 10/266, wurde für die virale DNA-Aufreinigung aus 0,5 ml Plasma extrahiert, die gereinigte virale DNA in 50 μl Elutionspuffer eluiert und mit dem PCR-Kit als Referenzprobe zusammen mit den 5 HBV-Standards und NTC verwendet. Die HBV-Viruslast der Referenzprobe (NIBSC-Code 10/266) wurde wie folgt berechnet: (6659 IE/μL x 50 μL)/0,5 mL = 6.65.900 IE/mL.
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Representative Results
Ein schematisches Diagramm des Arbeitsablaufs zum Nachweis und zur Quantifizierung von HBV-DNA aus menschlichem Plasma/Serum ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Verstärkungsdiagramm von Standard 2 (als PC verwendet) und NTC für HBV und IC ist in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Amplifikationskurven für eine HBV-positive, eine HBV-negative Probe und eine Probe mit PCR-Inhibition. Die Amplifikationskurve, der Ct-Wert für HBV und die erhaltene HBV-Konzentration in internationalen Einheiten pro Mikroliter (IE/μl) für den NIBSC-Code 10/266 sind in Abbildung 4 dargestellt. Amplifikationskurven für das HBV-Ziel aller 5 HBV-Standards des Kits und eine repräsentative Standardkurve für dasselbe sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Steigung der Standardkurve beträgt -3,361,R2 0,99996 und der Wirkungsgrad 0,98. Die Amplifikationskurven für das IC-Target aller 5 HBV-Standards sind in Abbildung 6 dargestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs zum Nachweis und zur Quantifizierung von HBV-DNA aus humanen Plasma-/Serumproben. Extrahieren Sie virale DNA aus menschlicher Serum-/Plasmaprobe einer HBV-verdächtigen Person. Bereiten Sie die PCR-Mischung vor, indem Sie jede PCR-Komponente mit Ausnahme der Template-DNA/des Standards/der Standards. Geben Sie es in PCR-Röhrchen/Wells. Fügen Sie die extrahierte(n) virale(n) DNA/Standard(e) als Template-DNA hinzu und verschließen Sie die PCR-Röhrchen. Laden Sie es in ein Echtzeit-PCR-Gerät, starten Sie den PCR-Lauf und analysieren Sie das Ergebnis nach Abschluss des Laufs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Amplifikationsdiagramm von Standard 2 (als PC verwendet) und NTC. Ein Amplifikationsdiagramm des HBV-Standards 2 ist hier sowohl für das HBV- als auch für das IC-Target dargestellt. Für die qualitative Ergebnisanalyse kann Standard 2 als Positivkontrolle verwendet werden. Für NTC wurde für keines der Ziele eine Amplifikation beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Amplifikationsdiagramme für HBV-positive Probe, HBV-negative Probe und eine Probe mit PCR-Inhibition. Hier sind Amplifikationsdiagramme für drei verschiedene Proben dargestellt: HBV-positiv (Fall 1), HBV-negativ (Fall 2) und eine Probe, die PCR-Inhibitoren enthält (Fall 3). Im Falle der HBV-positiven Probe werden beide Targets amplifiziert, während für die HBV-negative Probe nur IC amplifiziert wurde und für das HBV-Target keine Amplifikation wie erwartet beobachtet wurde. Für Fall 3 wurden weder HBV noch IC amplifiziert, was bedeutet, dass eine PCR-Hemmung aufgrund der PCR-Inhibitoren auftrat, die in der DNA-Probe vorhanden waren, die als PCR-Template verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Amplifikationskurve, Ct-Wert für HBV und erhaltene HBV-Konzentration (IE/μL) für den NIBSC-Code 10/266. Die extrahierte virale DNA des NIBSC-Codes 10/266 wurde zusammen mit den 5 HBV-Standards und NTC durchgeführt. Die Amplifikationskurve für das HBV-Target ist für die NIBSC-Code-Probe 10/266 im oberen Bereich dargestellt. Der Ct-Wert für HBV beträgt 18,94 und die berechnete Konzentration beträgt 6659 IE/μl, wie im unteren Bereich dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Amplifikationskurven für das HBV-Ziel aller 5 HBV-Standards und die Standardkurve. Im oberen Bereich sind die Amplifikationskurven für das HBV-Target (grüner Kanal) aller 5 HBV-Standards dargestellt. Im unteren Bereich ist eine Standardkurve mit ihrer Steigung (3,361), demR2-Wert (0,99996) und der PCR-Effizienz (0,98) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Verstärkungskurven für das IC-Target aller 5 HBV-Standards. Hier sind Verstärkungskurven von 5 HBV-Standards für den IC (gelber Kanal) dargestellt. Erwartungsgemäß sehen sie mit ähnlichen Ct-Werten gleich aus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Die Amplifikationskurven für das HBV-Target aller 5 HBV-Standards und NTC wurden dreifach durchgeführt. Die Amplifikationsdiagramme von drei Replikaten für das HBV-Target (Grüner Kanal) der 5 HBV-Standards zeigen ähnliche Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Amplifikationskurven für das HBV-Target des NIBSC-Codes 10/266, des NIBSC-Codes 14/198 und seiner fünf Verdünnungen. Die Amplifikationskurven für das HBV-Target (grüner Kanal) der Referenzproben NIBSC-Code 10/266, NIBSC-Code 14/198 und ihre fünf Verdünnungen (1,25 IE/ml, 2,5 IE/ml, 5 IE/ml, 25 IE/ml und 50 IE/ml) sind hier dargestellt. Für 1,25 IE/ml wurde keine Amplifikation festgestellt, während andere Verdünnungen korrekte Amplifikationskurven vor 38 ct zeigten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reagenz | Beschreibung |
| Multiplex-Mastermix | PCR-Puffer, Hot-Start-Taq-DNA-Polymerase und andere PCR-Komponenten |
| HBV-Primersonden-Mix | Primer und Sondenmischung für den HBV-Nachweis |
| Endogener IC-Primer-Sonden-Mix | Primer und Sondenmischung für die endogene interne Kontrolle (IC) |
| Normen für HBV | · HBV-Standard 1 |
| · HBV-Standard 2 | |
| · HBV-Standard 3 | |
| · HBV-Standard 4 | |
| · HBV-Standard 5 | |
| Negativkontrolle | Nukleasefreies Wasser in PCR-Qualität |
Tabelle 1: Reagenzien, die mit dem Real-Time-PCR-Kit geliefert werden, und ihre Beschreibung
| Reagenz | Volumen pro Reaktion |
| Multiplex-Mastermix | 11 μl |
| HBV-Primersonden-Mix | 2 μl |
| Endogener IC-Primer-Sonden-Mix | 2 μl |
| Gesamtes Reaktionsvolumen | 15 μl |
Tabelle 2: Volumen der einzelnen Reagenzien, die pro Reaktion für die PCR-Mischungsherstellung zugegeben werden müssen
| Schritt | Temperatur (°С) | Zeit | Datensammlung | Zyklen |
| Anfängliche Denaturierung | 94 | 10 min | - | 1 |
| PCR-Zyklus | 94 | 15 Sek. | - | 40 |
| 55 | 60 Sek. | Auf | ||
| 72 | 15 Sek. | - |
Tabelle 3: PCR-Zyklusbedingungen
| Ziel | Rotor-Gen Q* | CFX 96 | ABI real-time PCR# |
| HBV | Grün | FAM | FAM |
| ISCH | Gelb | FLUCH | VIC |
| *Einrichtung der Auto-Gain-Optimierung - Wählen Sie "Optimierung vor der 1. Erfassung durchführen" | |||
| #Wählen Sie nur für die Real-Time-PCR-Maschinen von Applied Biosystems ROX als "Passive Referenz"-Farbe während des Platten-Setups, da der Mastermix des Kits ROX enthält | |||
Tabelle 4: Farbstoffauswahl für verschiedene Real-Time-PCR-Plattformen
| Echtzeit-PCR-Gerät | Farbstoff | Schwellwertbereich§ |
| ABI-Real-Time-PCR¶ | FAM | 0.2–0.25 |
| VIC | 0.05–0.12 | |
| Bio-Rad CFX-96† | FAM | 100–800 |
| FLUCH | 50–400 | |
| Rotor-Gen Q | Grün | 0.015–0.03 |
| Gelb | 0.01–0.02 | |
| §Ein absoluter Schwellenwert variiert von Gerät zu Gerät je nach Alter, Modell und Kalibrierungsstatus des Geräts | ||
| ¶Diese Schwellenwerte sind anwendbar, wenn ROX als "passiver Referenzfarbstoff" ausgewählt wird | ||
| †Die relative Fluoreszenz wird um etwa das 2- bis 5-fache erhöht, wenn die weißen PCR-Röhrchen von Bio-Rad anstelle von durchsichtigen Röhrchen verwendet werden. Der Schwellenwert sollte also entsprechend festgelegt werden | ||
Tabelle 5: Empfohlene Schwellenwerte für verschiedene Real-Time-PCR-Plattformen
| Art der Probe | Fall | Verstärkungssignal in | Interpretation der Ergebnisse | |||
| FAM/Grün | HEX/VIC/Gelb | |||||
| Steuerung | Standard 2/PC | Ja (20 ± 2) | Ja (24 ± 3) | Standard 2/PC funktioniert einwandfrei | ||
| NTC | Nein | Nein | NTC funktioniert einwandfrei | |||
| Probe | 1 | Ja | Ja / Nein* | HBV-spezifische DNA nachgewiesen | ||
| 2 | Nein | Ja | HBV-spezifische DNA nicht nachgewiesen. Die Probe enthält keine nachweisbare Menge an HBV-spezifischer DNA | |||
| 3 | Nein | Nein | Mögliche Hemmung der PCR, Verdünnung der DNA-Probe (1:10) / erneute Extraktion der DNA aus der Originalprobe und Wiederholung der PCR | |||
| *Die Erkennung der internen Kontrolle ist nicht erforderlich, wenn das HBV-Ziel erkannt wird. Eine hohe HBV-DNA-Belastung in der Probe kann zu einer Verringerung oder zum Fehlen eines internen Kontrollsignals führen | ||||||
Tabelle 6: Ergebnisinterpretation von positiven, negativen und PCR-Inhibitoren mit minderwertigen Proben
| Norm | Konzentration (IE/μl) | Gewünschtes CT | |
| HBV | ISCH | ||
| (FAM/ Grün) | (HEX/VIC/Gelb) | ||
| HBV-Standard 1 | 5 x 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-Standard 2 | 5 X 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-Standard 3 | 5 x 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-Standard 4 | 5 X 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV-Standard 5 | 5 x 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
Tabelle 7: HBV-Standards und ihre Konzentration auf das HBV-Ziel und die gewünschten Ct-Werte
| Probe | Erwartete Ct | Erhaltenes Ct für HBV | Durchschnittlicher Ct-Wert | Standardabweichung | CV % | ||
| Replizieren 1 | Replizieren 2 | Replizieren 3 | |||||
| HBV-Standard 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV-Standard 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV-Standard 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV-Standard 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV-Standard 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
Tabelle 8: Erhaltene Ct-Werte, Durchschnitt, Standardabweichung und Variationskoeffizient (CV%) von 5 HBV-Standards.
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Discussion
Dem NIBSC-Code 10/266 wurde eine Einheit von 9.55.000 IE/ml zugewiesen, wenn er in 0,5 ml nukleasefreiem Wasser gemäß den Lieferanteninformationen21 rekonstituiert wird. Dies kann als hochbelastete HBV-positive Probe betrachtet werden. Die HBV-Viruslast, die mit dem in dieser Studie verwendeten Viruslast-Kit bestimmt wurde, betrug 6.65.900 IE/ml (Abbildung 4). Da die DNA-Extraktionseffizienz eines DNA-Extraktionskits nicht 100 % beträgt, geht während des Reinigungsprozesses oft ein Teil der DNA verloren. Obwohl die durch das Kit ermittelte Viruslast etwas niedriger ist als der vom Reagenzlieferanten (NIBSC-Code 10/266) zugewiesene Wert, sind die Daten dennoch zufriedenstellend, da die log10-Differenz zwischen den beiden Werten nur 0,157 beträgt, was weniger als der Cutoff-Wert (0,5)22 ist.
Das in diesem Protokoll verwendete Viruslast-Kit ist sehr robust und liefert reproduzierbare Daten, wie in Abbildung 7 dargestellt. In diesem Experiment wurden alle 5 Standards und NTC dreifach ausgeführt, und ihre Ct-Werte, der Durchschnitt, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient (CV%) sind in Tabelle 8 dargestellt. Ein niedrigerer CV% von weniger als 1 %, wie in Tabelle 8 erwähnt, deutet darauf hin, dass das Experiment zuverlässiger ist und sehr genaue Ergebnisse liefert.
Eine Referenzprobe mit sehr niedriger Last (NIBSC-Code: 14/198)23 wurde mit dem Kit verwendet, um die LoD zu überprüfen. Der NIBSC-Code 14/198 enthält gemäß den Lieferanteninformationen weniger als 50 IE/ml HBV-DNA. Die DNA wurde aus dem NIBSC-Code 14/198 extrahiert und mehrere Verdünnungen (1,25 IE/ml, 2,5 IE/ml, 5 IE/ml und 25 IE/ml) der DNA wurden hergestellt. Das Kit verwendete alle Verdünnungen und 5 HBV-Standards als Template-DNA. Es wurde beobachtet, dass dieses Kit alle Verdünnungen bis zu 2,5 IE/ml HBV-DNA nachweisen kann (Abbildung 8) und genau mit der LoD des Viruslast-Kits übereinstimmt. Daher ist das Viruslast-Kit ein hochempfindliches und reproduzierbares Werkzeug, das molekulardiagnostische Labore verwenden können, um medizinisches Fachpersonal bei der Diagnose und Behandlung von HBV-Infektionen effektiv zu unterstützen.
Benutzer sollten die folgenden kritischen Schritte beachten, wenn sie das Verfahren durchführen. Die Benutzer dürfen nur hochwertig extrahierte DNA als PCR-Vorlage verwenden, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Es ist wichtig, mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen (nicht mehr als 3 Mal) der Reagenzien zu vermeiden. Die PCR-Mischung sollte nicht über einen längeren Zeitraum mit Licht bestrahlt werden, da sie die lichtempfindliche Fluoreszenzsonde und den passiven Referenzfarbstoff ROX enthält. Es ist wichtig, bei jedem Lauf keine Vorlagensteuerung und Standards einzubeziehen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Es müssen immer kalibrierte Pipetten mit steril filtrierten Spitzen verwendet werden. Die Template-DNA und die Standards müssen in einem separaten Bereich mit einer anderen Pipette als im Bereich der Reaktionsvorbereitung zugegeben werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
Im Folgenden finden Sie einige allgemeine Tipps zur Fehlerbehebung für den PCR-basierten Nachweis und die Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA. Das Verstärkungssignal in der Negativkontrolle kann aufgrund einer Kreuzkontamination während des Reaktionsaufbaus auftreten. Daher sollte der Benutzer die Komponenten des Kits auf Kontamination überprüfen. Aus folgenden Gründen kann kein Amplifikationssignal mit Standards auftreten: (i) Falsche PCR-Mischung verwendet. Der Benutzer sollte überprüfen, ob alle Komponenten korrekt zugegeben wurden oder nicht. (ii) Verwendung abgelaufener Reagenzien. Der Benutzer muss das Verfallsdatum überprüfen, bevor die Reaktion eingerichtet wird. iii) Unsachgemäße Lagerung von Reagenzien. Stellen Sie sicher, dass die Reagenzien bei -20 °C oder darunter gelagert werden und während des Reaktionsaufbaus nicht über einen längeren Zeitraum bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. (iv) Es wurde eine falsche PCR-Zyklusbedingung verwendet. In einem solchen Fall empfiehlt es sich, die PCR mit dem richtigen Programm zu wiederholen. (iv) Aufgrund der hohen HBV-Last in der Probe und der PCR-Hemmung kann ein schwaches oder gar kein Signal der internen Kontrolle für Proben auftreten. Der Benutzer konnte die DNA-Probe verdünnen (1:10) und den Assay für eine hohe HBV-Belastung in der Probe wiederholen. Im Falle der PCR-Hemmung muss die Proben-DNA mit hochwertigen Reagenzien erneut extrahiert und der Assay wiederholt werden.
Der Echtzeit-PCR-basierte Nachweis und die Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA ist eine sehr empfindliche und spezifische Technik, die jedoch einige Einschränkungen wie Kosten und Komplexität mit sich bringt. Echtzeit-PCR-Instrumente und -Reagenzien können teuer sein, und die Kosten für Tests können für einige Patienten und Gesundheitssysteme ein Hindernis darstellen. Die Real-Time-PCR ist eine komplexe Technik, die geschultes Personal erfordert, um den Assay durchzuführen und die Ergebnisse zu interpretieren. Es handelt sich um eine indirekte Messung der Viruslast, so dass sowohl die Qualität der Standards als auch die Template-DNA das Ergebnis beeinflussen können. Ein neuer Genotyp des HBV und/oder eine Mutation(en) in der Primer-Sonden-Region können zu falsch negativen Ergebnissen führen.
Der Echtzeit-PCR-basierte Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA ist eine hochempfindliche und spezifische Methode, mit der geringe Mengen an viraler DNA nachgewiesen werden können. Im Vergleich zu anderen Methoden wie serologischen Tests (ELISA und Lateral-Flow-Assay) hat die Real-Time-PCR mehrere Vorteile. Erstens ist es empfindlicher als die serologischen Tests. Zweitens kann es die Menge der in einer Probe vorhandenen HBV-DNA quantifizieren, während serologische Tests nur ein qualitatives Ergebnis liefern können. Schließlich ist die Real-Time-PCR weniger anfällig für falsch positive Ergebnisse als die serologischen Tests24. Insgesamt ist die Real-Time-PCR die sensitivste, spezifischste und quantitativste Methode für den Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA. Es ist auch eine relativ schnelle Technik, was sie ideal für den klinischen Einsatz macht.
Der PCR-basierte Nachweis und die Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA in Echtzeit ist ein leistungsstarkes Werkzeug mit mehreren zukünftigen Anwendungen, darunter die Entwicklung neuer antiviraler Therapien und Point-of-Care-Tests. Die Technik kann verwendet werden, um neue antivirale Medikamente zu screenen und die Wirksamkeit dieser Medikamente in klinischen Studien zu überwachen. Dies könnte zur Entwicklung wirksamerer und weniger toxischer Behandlungen für HBV-Infektionen führen. Real-Time-PCR-Geräte werden immer kleiner und tragbarer, so dass HBV-Viruslasttests am Point-of-Care durchgeführt werden können. Dies könnte den Zugang zu Tests verbessern und zu einer früheren Diagnose und Behandlung einer HBV-Infektion führen. Die Regenten dieses Real-Time-PCR-basierten Kits können mit digitaler PCR zur absoluten Quantifizierung für eine genauere Überwachung der Fläschchenbeladung angepasst werden.
Zusätzlich zu diesen spezifischen Anwendungen wird der Echtzeit-PCR-basierte Nachweis und die Quantifizierung von HBV-DNA wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Erforschung und Entwicklung neuer Werkzeuge und Strategien zur Prävention, Diagnose und Behandlung von HBV-Infektionen spielen.
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Disclosures
Die Autoren sind mit Kilpest India Limited verbunden, dem Hersteller des HBV-Viruslast-Kits, das in dieser Studie verwendet wurde.
Acknowledgments
Wir danken Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita und Shikha für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
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