Summary
B型肝炎ウイルス(HBV)DNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの検出および定量は、HBV感染を診断およびモニタリングするための高感度で正確な方法です。ここでは、HBV DNA検出とサンプルのウイルス量測定のプロトコルを紹介します。
Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)は、世界中の肝疾患の重要な原因です。急性または慢性感染症を引き起こす可能性があり、致命的な肝硬変や肝臓がんに非常にかかりやすくなります。血液中のHBV DNAの正確な検出と定量は、HBV感染の診断とモニタリングに不可欠です。HBV DNAを検出する最も一般的な方法はリアルタイムPCRであり、ウイルスを検出し、ウイルス量を評価して抗ウイルス療法への反応をモニターするために使用できます。ここでは、IVDマーク付きリアルタイムPCRベースのキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なプロトコルについて説明します。このキットは、HBVゲノムの高度に保存されたコア領域を標的とするプライマーとプローブを使用しており、すべてのHBV遺伝子型(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)を正確に定量できます。このキットには、PCR阻害の可能性を監視するための内因性内部コントロールも含まれています。このアッセイは 40 サイクル実行され、カットオフは 38 カラットです。 臨床サンプル中の HBV DNA を定量するために、5 種類の定量標準試料がキットに付属しています。この標準物質には、核酸検査用のHBV DNAに関するWHO第4国際 規格(NIBSCコード10/266)に照らして校正されたHBV特異的DNAの既知の濃度が含まれています。この標準試料は、HBV特異的DNA増幅の機能を検証し、検量線を作成するために使用され、サンプル中のHBV DNAの定量を可能にします。2.5 IU/mLという低濃度のHBV DNAをPCRキットを用いて検出しました。このキットは感度と再現性が高いため、臨床検査室での強力なツールとなり、医療従事者がHBV感染症を効果的に診断・管理するのに役立ちます。
Introduction
B型肝炎ウイルス(HBV)は、オルソヘパドナウイルス属およびヘパドナウイルス科1に属する部分二本鎖DNAウイルスです。生涯にわたって持続する慢性感染症を引き起こし、肝硬変や肝細胞癌を引き起こす可能性があります2,3,4。世界保健機関(WHO)によると、2019年には推定2億9,600万人が慢性B型肝炎に感染し、毎年150万人が新たに感染しています5。
血清または血漿サンプル中のHBV DNAの同定と測定は、進行中のB型肝炎感染患者を検出し、抗ウイルス治療の有効性を評価し、治療の成功確率を予測するための貴重な方法として機能します6,7,8,9,10,11。ウイルス量が多いと、肝硬変や肝がんなどの肝疾患の進行リスクが高まります12,13。したがって、ウイルス量の正確な測定は、HBV感染の進行を追跡し、治療に関する決定に情報を提供するために重要です。
定量的リアルタイムPCRアッセイは、従来のPCR技術よりも感度が高く、ダイナミックレンジが広く、HBV DNAの定量精度が高い14,15,16,17。血清または血漿サンプル中のHBV DNAを定量するための市販のリアルタイムPCRベースの分子診断キットがいくつか市場に出回っています。ここでは、市販のIVDマーク付きリアルタイムPCRベースキットを使用して、ヒト血清または血漿中のHBV DNAを検出および定量するための詳細なワークフローについて説明します。このキットは、広く使用されている18,19、低コストでありながら高感度のアッセイであり、その性能特性は、他の市販のCEマーク付きキットに匹敵します18。HBV標的領域の増幅とは別に、内在性内部制御遺伝子もキットに含まれており、サンプルの品質、抽出されたDNAの品質、PCR増幅、およびPCR阻害の可能性を検証します。
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Protocol
この研究には、ヒトの参加者や臨床サンプルは含まれていませんでした。使用された唯一の生物学的材料は、核酸検査用のHBV DNAに関する第4回 WHO国際基準(NIBSCコード10/266)でした。この規格は、個人情報や識別可能なデータを含まない、一般に入手可能な参考資料です。そのため、この研究には倫理的な承認は必要ありませんでした。
1. DNA抽出
- ヒト血清または血漿サンプルからウイルスDNAを抽出します。抽出したDNAは、PCRでさらに使用するまで-20°Cで保存してください。
注:DNA抽出用の血清または血漿の推奨容量は500 μLで、溶出量は50 μLです。本研究では、ウイルス核酸抽出キット(材料表)を用いてウイルスDNAを抽出した。
2. リアルタイムPCR
- PCRを開始する前に、リアルタイムPCRキットのすべての試薬(表1)を室温(室温;15〜25°C)で解凍します。解凍したら、適度な速度で10秒間パルスボルテックスして成分を混合し、室温で8,000 × g で15秒間遠心分離します。
- 反応調製
- 表2に従ってPCRミックスを調製する。添加する試薬の量は、サンプル数、標準試料、テンプレートコントロールなしに基づいて計算します。
注:PCRミックスを調製する際には、各試薬の少なくとも10%の容量を追加する必要があります(例えば、10回の反応が必要な場合は、11回の反応について計算します)。 - 上記で調製したPCRミックス15μLを各PCRチューブにピペットでつなぎます。次に、抽出したサンプルDNAを15μL添加します。HBV DNAを検出するためのポジティブコントロール(PC)としてHBV用標準試料(HBV標準試料1-5)の少なくとも1つを15 μL、ネガティブコントロール(NC)としてPCRグレードのヌクレアーゼフリー水15 μLを加えます。HBV DNA の定量に必要な検量線を作成するには、キットに付属の 5 種類の定量標準試料(HBV 標準試料 1-5)をすべて PCR ランごとに使用します。
- チューブを閉じ、中程度の速度で10秒間パルスボルテックスして成分を混合し、室温で8,000 × g で15秒間遠心分離してから、サーマルサイクラーに進みます。反応液中に気泡が入っていないことを確認してください(気泡は蛍光検出に干渉する可能性があるため)。
- 表2に従ってPCRミックスを調製する。添加する試薬の量は、サンプル数、標準試料、テンプレートコントロールなしに基づいて計算します。
- プログラムのセットアップ
- サーマルサイクラーは、 表3で推奨されているサイクル条件を使用してプログラムします。
- チャンネル/蛍光色素の選択
- 表 4 に示すように、一般的に使用されるリアルタイム PCR プラットホーム用の蛍光色素を選択してください。
- データ解析
- 実行が完了したら、線形スケールで増幅プロットを解析します。
- 閾値設定
- PCR反応の指数関数的相内の閾値を設定します。キットの推奨閾値を 表5に示します。しきい値の設定と一致します。アッセイに最適な閾値が決定されたら、特定のPCRマシンのすべてのサンプルに一貫して使用してください。これにより、結果が正確で再現性のあるものになります。
注意: しきい値の設定が低すぎると、信号がノイズレベルを下回る可能性があり、Ct値は信頼できません。閾値の設定が高すぎると、シグナルが反応のプラトー相にあり、増幅効率が悪く、Ct値が不正確になる可能性があります。
- PCR反応の指数関数的相内の閾値を設定します。キットの推奨閾値を 表5に示します。しきい値の設定と一致します。アッセイに最適な閾値が決定されたら、特定のPCRマシンのすべてのサンプルに一貫して使用してください。これにより、結果が正確で再現性のあるものになります。
- 期限
- キットを40回の増幅サイクルで実行します。38サイクルを超える増幅は考慮しないでください。
- 定性的な結果分析
- HBV DNAの定性検出にキットをご使用ください。標準 2 を PC として使用し、HBV では 20 ± 2、IC では 24 ± 3 の期待値を使用します。
- テンプレートコントロール(NTC)がHBVと内部コントロール(IC)の両方のターゲットで増幅を示さないことを確認します。NTC反応で増幅反応が起こると、試料のコンタミネーションが起きている可能性があります。
- アッセイのカットオフは 38 であるため、HBV 陽性サンプルとしての HBV ターゲットの 38 Ct より前の増幅を検討してください。すべてのコントロールが上記の要件を満たしている場合は、 表 6 に記載されている解釈に従って標本を検討してください。
- 定量的な結果分析
- 核酸増幅技術(NAT)20 の HBV DNA に関する 4 番目の WHO 国際標準に照らして較正された、HBV 特異的 DNA の既知の濃度の 5 つの定量標準試料のセットを使用します(表 7)。
- これらの標準を使用して、検量線を生成します。検量線を利用して、未知サンプルのHBV DNAを定量します。
注:リアルタイム PCR ソフトウェアは、5 つの標準試料すべての HBV ターゲットについて得られた Ct 値と、それに対応する国際単位/マイクロリットル(IU/μL)での濃度を使用して、検量線を生成します。 - 標準試料の傾きが -3.1 から -3.6 の間にあり、R2 値が 0.99 から 1.0 の間にあり、PCR 効率が 90%-110%(0.9-1.1)の間にあり、ネガティブコントロールに増幅がない場合にのみ、未知のサンプルの値を解釈します。
- ソフトウェアは、各HBV陽性サンプルの濃度をマイクロリットルあたりの国際単位(IU / μL)で計算します。ウイルス量(IU/μLから国際単位/ミリリットル[IU/mL]への変換)を計算するには、次の式を使用します。
結果(IU/mL) = (結果 [IU/μL] x 溶出量 [μL])/サンプル量(mL)
注:HBV DNAに関するWHO国際標準第4回NIBSCコード10/266は、0.5 mLの血漿からウイルスDNA精製用に抽出し、精製したウイルスDNAを50 μLの溶出バッファーに溶出し、5つのHBV標準およびNTCとともにPCRキットとともに参照サンプルとして使用しました。参照サンプル(NIBSC コード 10/266)の HBV ウイルス量は、(6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL として計算されました。
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Representative Results
ヒト血漿/血清からHBV DNAを検出および定量するワークフローの概略図を 図1に示します。 図2に、HBVとICの両方について、標準2(PCとして使用)とNTCの増幅プロットを示します。 図3 は、HBV陽性サンプル、HBV陰性サンプル、およびPCR阻害サンプルの増幅曲線を示しています。NIBSCコード10/266の増幅曲線、HBVのCt値、および得られたHBV濃度(国際単位/マイクロリットル(IU/μL))を 図4に示します。キットの 5 つの HBV 標準試料すべての HBV ターゲットの増幅曲線と、その代表的な標準曲線を 図 5 に示します。検量線の傾きは-3.361、R2 は0.99996、効率は0.98です。5つのHBV規格すべてのICターゲットの増幅曲線を 図6に示します。
図1:ヒト血漿/血清サンプルからHBV DNAを検出および定量するワークフローの概略図。 HBVが疑われる個人のヒト血清/血漿サンプルからウイルスDNAを抽出します。テンプレートDNA/標準品を除く各PCR成分を添加して、PCRミックスを調製します。PCRチューブ/ウェルに分注します。抽出したウイルスDNA/標準試料をテンプレートDNAとして添加し、PCRチューブを閉じます。リアルタイムPCRマシンにロードし、PCRランを開始し、ラン完了後に結果を解析します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:標準試料2(PCとして使用)とNTCの増幅プロット。 HBV標準試料2の増幅プロットを、HBVターゲットとICターゲットの両方について示しています。定性結果分析では、標準試料 2 をポジティブコントロールとして使用できます。NTCでは、いずれの標的についても増幅は観察されませんでした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:HBV陽性サンプル、HBV陰性サンプル、およびPCR阻害サンプルの増幅プロット。 HBV陽性(ケース1)、HBV陰性(ケース2)、PCR阻害剤を含むサンプル(ケース3)の3つの異なるサンプルの増幅プロットをここに示します。HBV陽性サンプルの場合、両方のターゲットが増幅されたのに対し、HBV陰性サンプルではICのみが増幅され、HBVターゲットの増幅は期待どおりに観察されませんでした。ケース3ではHBVもICも増幅されなかったため、PCRテンプレートとして用いたDNAサンプルにPCR阻害剤が存在するため、PCR阻害が発生したことになります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:増幅曲線、HBVのCt値、およびNIBSCコード10/266で得られたHBV濃度(IU/μL)。 NIBSC コード 10/266 の抽出ウイルス DNA を、5 つの HBV 標準試料および NTC とともに実行しました。HBVターゲットの増幅曲線は、NIBSCコード10/266サンプルについて上部パネルに示されています。HBVのCt値は18.94で、計算された濃度は6659IU/μLです(下段)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:5つのHBV標準試料すべてのHBVターゲットの増幅曲線と標準曲線。 5 つの HBV 標準試料すべての HBV ターゲット(緑チャンネル)の増幅曲線を上部パネルに示します。標準曲線とその傾き(3.361)、R2 値(0.99996)、PCR効率(0.98)を下部パネルに示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:5つのHBV規格すべてのICターゲットの増幅曲線。 ここでは、IC(黄色チャンネル)の5つのHBV規格の増幅曲線を示します。予想通り、それらは同様のCt値で同じように見えます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:5つのHBV標準試料およびNTCのHBVターゲットの増幅曲線を3回に分けて実行しました。 5 つの HBV 標準試料の HBV ターゲット(緑チャンネル)の 3 回の繰り返しの増幅プロットでも、同様の結果が得られます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:NIBSCコード10/266、NIBSCコード14/198のHBVターゲットとその5つの希釈率の増幅曲線。 参照サンプルの NIBSC コード 10/266、NIBSC コード 14/198、およびその 5 つの希釈倍率(1.25 IU/mL、2.5 IU/mL、5 IU/mL、25 IU/mL、50 IU/mL)の HBV ターゲット(緑色のチャネル)の増幅曲線をここに示します。1.25 IU/mL では増幅は検出されませんでしたが、他の希釈液では 38 Ct より前に適切な増幅曲線が示されました 。
| 試薬 | 説明: __________ |
| マルチプレックスマスターミックス | PCRバッファー、Hot Start Taq DNAポリメラーゼ、およびその他のPCRコンポーネント |
| HBVプライマープローブミックス | HBV検出用のプライマーとプローブミックス |
| 内因性ICプライマープローブミックス | 内因性内部制御(IC)検出用のプライマーとプローブミックス |
| HBVの基準 | · HBVスタンダード1 |
| · HBVスタンダード2 | |
| · HBVスタンダード3 | |
| · HBVスタンダード4 | |
| · HBVスタンダード5 | |
| ネガティブコントロール | PCRグレードのヌクレアーゼフリー水 |
表1:リアルタイムPCRキットに付属する試薬とその説明
| 試薬 | 反応あたりの容量 |
| マルチプレックスマスターミックス | 11 μL |
| HBVプライマープローブミックス | 2 μL |
| 内因性ICプライマープローブミックス | 2 μL |
| 総反応量 | 15 μL |
表2:PCRミックス調製のために反応ごとに添加される各試薬の量
| 歩 | 温度(°C) | 時間 | データ収集 | サイクル |
| 初期変性 | 94 | 10分 | - | 1 |
| PCRサイクリング | 94 | 15秒 | - | 40 |
| 55 | 60秒 | オン | ||
| 72 | 15秒 | - |
表3:PCRサイクル条件
| ターゲット | ローター遺伝子Q* | CFXの 96 | ABI リアルタイム PCR# |
| HBVの | 緑 | FAMの | FAMの |
| 集積回路 | 黄色 | 16 進 | ビクトリア 州 |
| *自動ゲイン最適化設定 - 「Perform Optimisation Before 1st Acquisition」を選択します。 | |||
| #Applied Biosystems のリアルタイム PCR マシンの場合のみ、キットのマスターミックスには ROX が含まれているため、プレートセットアップ時に「Passive Reference」色素として ROX を選択してください | |||
表 4:さまざまなリアルタイム PCR プラットホームにおける色素の選択
| リアルタイムPCR装置 | 染料 | 閾値範囲§ |
| ABI リアルタイム PCR¶ | FAMの | 0.2–0.25 |
| ビクトリア 州 | 0.05–0.12 | |
| バイオ・ラッド CFX-96† | FAMの | 100–800 |
| 16 進 | 50–400 | |
| ローター遺伝子Q | 緑 | 0.015–0.03 |
| 黄色 | 0.01–0.02 | |
| §絶対閾値は、機器の使用年数、モデル、校正状況に応じて機器ごとに異なります | ||
| ¶これらの閾値は、ROXが「Passive Reference」色素として選択されている場合に適用できます | ||
| †透明チューブの代わりにバイオ・ラッドの白色PCRチューブを使用すると、相対蛍光が約2〜5倍増加します。したがって、しきい値はそれに応じて決定する必要があります | ||
表 5:さまざまなリアルタイム PCR プラットホームの推奨閾値
| サンプルの種類 | ケース | 増幅信号入力 | 結果の解釈 | |||
| FAM/グリーン | HEX/VIC/イエロー | |||||
| コントロール | スタンダード2台/パソコン | はい (20 ± 2) | はい (24 ± 3) | Standard 2/PCは正常に動作している | ||
| NTCの | いいえ | いいえ | NTCは正常に動作しています | |||
| 見本 | 1 | はい | はい/いいえ* | HBV特異的DNAが検出されました | ||
| 2 | いいえ | はい | HBV特異的DNAは検出されませんでした。サンプルには、検出可能な量のHBV特異的DNAが含まれていません | |||
| 3 | いいえ | いいえ | PCRの阻害の可能性、DNAサンプルの希釈(1:10)/元のサンプルからDNAを再抽出し、PCRを繰り返す | |||
| *HBV対象物を検知した場合、内部統制の検知は不要です。サンプル中のHBV DNA負荷が高いと、内部コントロールシグナルの減少または欠如につながる可能性があります | ||||||
表6:質の悪いサンプルを含む陽性、陰性、およびPCR阻害剤の結果の解釈
| 標準 | 濃度(IU/μl) | 希望のCt | |
| HBVの | 集積回路 | ||
| (FAM/グリーン) | (HEX/VIC/イエロー) | ||
| HBVスタンダード1 | 5×104 | 2±17日 | 3±24 |
| HBVスタンダード2 | 5×103 | 20±2 | 3±24 |
| HBVスタンダード3 | 5×102 | 2±23日 | 3±24 |
| HBVスタンダード4 | 5×101 | 2±27日 | 3±24 |
| HBVスタンダード5 | 5×100 | 31 ± 2 | 3±24 |
表7:HBV標準物質とHBVターゲットの濃度および所望のCt値
| 見本 | 予想Ct | HBVのCtを取得 | 平均Ct | 標準偏差 | CV % | ||
| レプリケート 1 | レプリケート 2 | レプリケート 3 | |||||
| HBVスタンダード1 | 2±17日 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBVスタンダード2 | 20±2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBVスタンダード3 | 2±23日 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBVスタンダード4 | 2±27日 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBVスタンダード5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
表8:得られたCt値、平均値、標準偏差、および5つのHBV標準の変動係数(CV%)。
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Discussion
NIBSC コード 10/266 には、サプライヤー情報21 に従って 9,55,000 mL のヌクレアーゼフリー水に再構成した場合、0.5 IU/mL の単位が割り当てられています。これは、高負荷のHBV陽性サンプルと見なすことができます。この研究で使用したウイルス量キットで測定したHBVウイルス量は6,65,900 IU/mLでした(図4)。DNA抽出キットのDNA抽出効率は100%ではないため、精製プロセス中に一部のDNAが失われることがよくあります。キットによって決定されたウイルス量は、試薬(NIBSCコード10/266)サプライヤーの割り当て値よりもわずかに低いですが、2つの値の間のlog10の差はわずか0.157であり、カットオフ値(0.5)22よりも小さいため、データは満足のいくものです。
このプロトコルで使用されるウイルス量キットは、 図7に示すように、非常に頑健で再現性のあるデータを提供します。この実験では、5 つの標準試料と NTC を 3 回に分けて分析し、それらの Ct 値、平均、標準偏差、および変動係数(CV%)を 表 8 に示します。 表8に示すように、CV%が1%未満と低い場合は、実験の信頼性が高く、精度の高い結果が得られることを示しています。
非常に低負荷のリファレンスサンプル(NIBSCコード:14/198)23 をキットとともに使用し、LoDを確認しました。NIBSC コード 14/198 には、サプライヤー情報に従って 50 IU/mL 未満の HBV DNA が含まれています。NIBSC コード 14/198 から DNA を抽出し、DNA の複数回希釈液(1.25 IU/mL、2.5 IU/mL、5 IU/mL、および 25 IU/mL)を調製しました。このキットでは、すべての希釈液と 5 つの HBV 標準試料をテンプレート DNA として使用しました。このキットは、2.5 IU/mL までのすべての希釈液の HBV DNA を検出でき(図 8)、ウイルス量キットの LoD と完全に一致することが観察されました。したがって、ウイルス量キットは、分子診断ラボが医療従事者がHBV感染を効果的に診断および管理するのを支援するために使用できる、高感度で再現性の高いツールです。
ユーザーは、手順を実行する際に、次の重要な手順に留意する必要があります。ユーザーは、正確な結果を確保するために、PCRテンプレートとして高品質の抽出されたDNAのみを採用する必要があります。試薬の凍結融解サイクルを複数回(3回以内)避けることが重要です。PCRミックスには、感光性蛍光プローブとパッシブリファレンス色素ROXが含まれているため、長時間光にさらさないでください。結果の正確性と信頼性を確保するために、各分析にテンプレート管理と標準を常に含めないことが重要です。滅菌フィルターチップ付きの校正済みピペットは、常に使用する必要があります。テンプレートDNAと標準物質は、クロスコンタミネーションを避けるために、反応調製エリアとは別のピペットで別のエリアに追加する必要があります。
以下は、B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムPCRベースの検出および定量に関する一般的なトラブルシューティングのヒントです。ネガティブコントロールでの増幅シグナルは、反応セットアップ中のクロスコンタミネーションが原因で発生する可能性があります。そのため、ユーザーはキットコンポーネントの汚染を確認する必要があります。以下の理由により、標準物質による増幅シグナルが発生しないことがあります:(i)誤ったPCR混合物が使用されている。ユーザーは、すべての成分が正しく添加されているかどうかを確認する必要があります。 (ii)期限切れの試薬の使用。ユーザーは、反応を設定する前に有効期限を確認する必要があります。(iii)試薬の不適切な保管。反応セットアップ中は、試薬を-20°C以下で保存し、室温で長時間保管しないでください。(iv)間違ったPCRサイクリング条件が使用されました。このような場合は、正しいプログラムでPCRを繰り返すことをお勧めします。(iv)サンプル中のHBV負荷が高く、PCRが阻害されるため、サンプルの内部コントロールの信号が弱い、またはまったくない可能性があります。ユーザーはDNAサンプルを希釈し(1:10)、サンプル中のHBV負荷が高い場合、アッセイを繰り返すことができます。PCR阻害の場合、サンプルDNAを良質の試薬で再抽出し、アッセイを繰り返す必要があります。
B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムPCRベースの検出と定量は、非常に感度が高く特異的な技術ですが、コストや複雑さなどの制限があります。リアルタイムPCR機器や試薬は高価になる可能性があり、検査のコストは一部の患者や医療システムにとって障壁となる可能性があります。リアルタイムPCRは複雑な技術であり、アッセイを実施して結果を解釈するために訓練を受けた担当者が必要です。これはウイルス量の間接的な測定であるため、標準試料の品質とテンプレートDNAの両方が結果に影響を与える可能性があります。HBVの新しい遺伝子型および/またはプライマープローブ領域の変異は、偽陰性の結果につながる可能性があります。
HBV DNAのリアルタイムPCRベースの検出および定量は、低レベルのウイルスDNAを検出できる高感度で特異的な方法です。血清学的検査(ELISAやラテラルフローアッセイ)などの他の方法と比較して、リアルタイムPCRにはいくつかの利点があります。まず、血清学的検査よりも感度が高いです。第二に、血清学的検査は定性的な結果しか提供できないのに対し、サンプル中に存在するHBV DNAの量を定量化できます。最後に、リアルタイムPCRは血清学的検査よりも偽陽性になりにくい24。全体として、リアルタイムPCRは、HBV DNAの検出と定量に利用できる最も感度が高く、特異的で定量的な方法です。また、比較的高速な技術であるため、臨床使用に最適です。
B型肝炎ウイルスDNAのリアルタイムPCRベースの検出と定量は、新しい抗ウイルス療法やポイントオブケア検査の開発など、将来的にいくつかの用途が期待できる強力なツールです。この技術は、新しい抗ウイルス薬をスクリーニングし、臨床試験でこれらの薬の有効性を監視するために使用できます。これは、HBV感染症に対するより効果的で毒性の低い治療法の開発につながる可能性があります。リアルタイムPCR装置は小型化と携帯性が向上しており、ポイントオブケアでHBVウイルス量検査を行うことが可能になっています。これにより、検査へのアクセスが改善され、HBV感染症の早期診断と治療につながる可能性があります。このリアルタイムPCRベースのキットのリージェントは、バイアル負荷のより正確なモニタリングのために、絶対定量のためのデジタルPCRに適合させることができます。
これらの特定のアプリケーションに加えて、HBV DNAのリアルタイムPCRベースの検出と定量は、HBV感染を予防、診断、および治療するための新しいツールと戦略の研究開発において重要な役割を果たす可能性があります。
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Disclosures
著者らは、この研究で使用されたHBVウイルス量キットの製造元であるKilpest India Limitedと関係があります。
Acknowledgments
技術支援をしてくれたPraveen氏、Kusum氏、Chandan氏、Isha氏、Rashmi氏、Babli氏、Shivani氏、Ankita氏、Shikha氏に感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
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