Summary
B형 간염 바이러스(HBV) DNA의 실시간 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 검출 및 정량화는 B형 간염 바이러스 감염을 진단하고 모니터링하기 위한 민감하고 정확한 방법입니다. 여기에서는 HBV DNA 검출 및 샘플의 바이러스 부하 측정을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
B형 간염 바이러스(HBV)는 전 세계적으로 간 질환의 중요한 원인입니다. 급성 또는 만성 감염으로 이어질 수 있어 치명적인 간경변과 간암에 매우 취약합니다. 혈액 내 HBV DNA의 정확한 검출 및 정량화는 HBV 감염을 진단하고 모니터링하는 데 필수적입니다. HBV DNA를 검출하는 가장 일반적인 방법은 Real-Time PCR로, 바이러스를 검출하고 바이러스 부하를 평가하여 항바이러스 요법에 대한 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 IVD 마킹 Real-Time PCR 기반 키트를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 키트는 HBV 게놈의 고도로 보존된 핵심 영역을 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하며 모든 HBV 유전자형(A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J)을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 키트에는 가능한 PCR 억제를 모니터링하기 위한 내인성 내부 대조군도 포함되어 있습니다. 이 분석은 40 사이클 동안 실행되며 컷오프는 38 Ct입니다. 임상 샘플에서 HBV DNA의 정량을 위해 5가지 정량 표준물질 세트가 키트와 함께 제공됩니다. 이 표준물질에는 핵산 검사를 위한 HBV DNA에 대한 4번째 WHO 국제 표준(NIBSC 코드 10/266)에 따라 보정된 HBV 특이적 DNA의 알려진 농도가 포함되어 있습니다. 이 표준물질은 HBV 특이적 DNA 증폭의 기능을 검증하고 표준 곡선을 생성하는 데 사용되며, 이를 통해 샘플에서 HBV DNA를 정량화할 수 있습니다. PCR 키트를 사용하여 2.5IU/mL의 낮은 HBV DNA를 검출했습니다. 이 키트의 높은 감도와 재현성은 임상 실험실에서 강력한 도구가 되어 의료 전문가가 HBV 감염을 효과적으로 진단하고 관리하는 데 도움이 됩니다.
Introduction
B형 간염 바이러스(HBV)는 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus) 속과 헤파드나비리과(Hepadnaviridae family)1에 속하는 부분 이중 가닥 DNA 바이러스입니다. 이는 평생 지속되는 만성 감염을 유발할 수 있으며, 간경변증과 간세포암으로 이어질 수 있다 2,3,4. 세계보건기구(WHO)에 따르면 2019년 약 2억 9,600만 명의 인구가 만성 B형 간염 감염을 앓고 있었으며 매년 150만 명이 새로 감염되었습니다5.
혈청 또는 혈장 샘플에서 HBV DNA의 식별 및 측정은 진행 중인 B형 간염 감염자를 검출하고, 항바이러스 치료의 효능을 평가하고, 치료 성공 확률을 예측하는 데 유용한 방법입니다 6,7,8,9,10,11. 높은 바이러스 양은 간경변 및 간암을 포함한 간 질환 진행 위험 증가와 관련이 있습니다12,13. 따라서 바이러스 양을 정확하게 측정하는 것은 HBV 감염의 진행을 추적하고 치료에 관한 결정을 내리는 데 매우 중요합니다.
정량적 Real-Time PCR 분석은 기존 PCR 기술보다 더 높은 감도, 더 넓은 동적 범위 및 HBV DNA의 더 정확한 정량을 제공합니다 14,15,16,17. 혈청 또는 혈장 샘플에서 HBV DNA를 정량화하기 위한 여러 상용 Real-Time PCR 기반 분자 진단 키트가 시중에 나와 있습니다. 여기에서는 시판되는 IVD 표시 Real-Time PCR 기반 키트를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 자세한 워크플로우를 설명합니다. 이 키트는 널리 사용되는18,19, 저비용이지만 고감도 분석법이며, 그 성능 특성은 상업적으로 이용 가능한 다른 CE 마크 키트(들)18와 비슷합니다. HBV 표적 부위 증폭 외에도 내인성 내부 대조 유전자도 키트에 포함되어 샘플의 품질, 추출된 DNA의 품질, PCR 증폭 및 가능한 PCR 억제를 검증합니다.
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Protocol
이 연구는 인간 참가자나 임상 샘플을 포함하지 않았습니다. 유일하게 사용된 생물학적 물질은 핵산 검사용 HBV DNA에 대한 4번째 WHO 국제 표준(NIBSC 코드 10/266)이었습니다. 이 표준은 개인 정보나 식별 가능한 데이터를 포함하지 않는 공개적으로 사용 가능한 참조 자료입니다. 따라서 이 연구에는 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.
1. DNA 추출
- 인간 혈청 또는 혈장 샘플에서 바이러스 DNA를 추출합니다. 추출된 DNA를 PCR에서 추가로 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
참고: DNA 추출을 위한 혈청 또는 혈장의 권장 부피는 500μL이고 용출량은 50μL입니다. 본 연구에서는 바이러스 핵산 추출 키트(Table of Materials)를 이용하여 바이러스 DNA를 추출하였다.
2. Real-time PCR
- PCR을 시작하기 전에 Real-Time PCR 키트의 모든 시약(표 1)을 실온(RT, 15-25°C)에서 해동합니다. 해동되면 적당한 속도로 10초 동안 펄스 와류로 구성 요소를 혼합하고 RT에서 15초 동안 8,000× g 에서 원심분리기로 구성 요소를 혼합합니다. 해동된 모든 구성 요소를 냉각 블록에 보관합니다.
- 반응 준비
- 표 2에 따라 PCR 혼합물을 준비한다. 시료 수, 표준물질 및 템플릿 대조군 없음을 기준으로 추가할 시약의 부피를 계산합니다.
참고: PCR 혼합물을 준비할 때 각 시약의 최소 10% 추가 부피를 추가해야 합니다(예: 10회 반응이 필요한 경우 11회 반응으로 계산). - 위에서 준비한 PCR 혼합물 15μL를 각 PCR 튜브에 피펫합니다. 그런 다음 추출된 샘플 DNA 15μL를 추가합니다. HBV DNA 검출을 위한 양성 대조군(PC)으로 HBV 표준물질(HBV Standard 1-5) 중 하나 이상의 15μL를 추가하고 음성 대조군(NC)으로 PCR 등급 뉴클레아제가 없는 물 15μL를 추가합니다. HBV DNA의 정량 분석에 필요한 표준 곡선을 생성하기 위해, 각 PCR 실행에 대해 키트와 함께 제공된 5가지 정량 표준물질(HBV 표준물질 1-5)을 모두 사용하십시오.
- 튜브를 닫고, 적당한 속도로 10초 동안 펄스 와류로 구성 요소를 혼합하고, 열 순환기로 진행하기 전에 RT에서 15초 동안 8,000× g 으로 원심분리합니다. 형광 검출을 방해할 수 있으므로 반응 혼합물에 기포가 없는지 확인하십시오.
- 표 2에 따라 PCR 혼합물을 준비한다. 시료 수, 표준물질 및 템플릿 대조군 없음을 기준으로 추가할 시약의 부피를 계산합니다.
- 프로그램 설정
- 표 3에서 권장하는 대로 순환 조건을 사용하여 열 순환기를 프로그래밍합니다.
- 채널/형광단 선택
- 표 4에 언급된 바와 같이 일반적으로 사용되는 Real-Time PCR 플랫폼에 사용할 형광 염료를 선택하십시오.
- 데이터 분석
- 실행이 완료되면 선형 스케일에서 증폭 플롯을 분석합니다.
- 임계값 설정
- PCR 반응의 지수 단계 내에서 임계값을 설정합니다. 키트의 권장 임계값은 표 5에 언급되어 있습니다. 임계값 설정과 일관성을 유지합니다. 분석을 위한 최적의 임계값이 결정되면 특정 PCR 기계의 모든 샘플에 일관되게 사용합니다. 이렇게 하면 결과가 정확하고 재현 가능한지 확인하는 데 도움이 됩니다.
알림: 임계값을 너무 낮게 설정하면 신호가 노이즈 수준보다 낮을 수 있으며 Ct 값을 신뢰할 수 없습니다. 임계값이 너무 높게 설정되면 신호는 증폭이 효율적이지 않고 Ct 값이 부정확할 수 있는 반응의 안정기에 있을 수 있습니다.
- PCR 반응의 지수 단계 내에서 임계값을 설정합니다. 키트의 권장 임계값은 표 5에 언급되어 있습니다. 임계값 설정과 일관성을 유지합니다. 분석을 위한 최적의 임계값이 결정되면 특정 PCR 기계의 모든 샘플에 일관되게 사용합니다. 이렇게 하면 결과가 정확하고 재현 가능한지 확인하는 데 도움이 됩니다.
- 컷오프
- 40회 증폭 주기 동안 키트를 실행합니다. 어떤 해석을 위해 38주기를 초과하는 증폭을 고려하지 마십시오.
- 정성적 결과 분석
- HBV DNA의 정성적 검출을 위해 키트를 사용하십시오. HBV의 경우 20 ± 2, IC의 경우 24 ± 3의 예상 Ct 값을 가진 PC로 표준 2를 사용하십시오.
- 템플릿 제어(NTC)가 HBV 및 내부 제어(IC) 대상 모두에 대해 증폭을 나타내지 않는지 확인합니다. NTC 반응에서 증폭 반응이 발생하면 샘플 오염이 발생했을 수 있습니다.
- 분석 컷오프가 38이므로 HBV 표적에 대해 38Ct 이전의 증폭을 HBV 양성 샘플로 고려하십시오. 모든 대조군이 위에서 언급한 요구 사항을 충족하는 경우 표 6에 언급된 해석에 따라 표본을 고려하십시오.
- 정량적 결과 분석
- 핵산 증폭 기술(NAT)을 위한 HBV DNA에 대한 4차 WHO 국제 표준에 따라 보정된 HBV 특이적 DNA에 대해 알려진 농도의 5가지 정량 표준물질 세트를 사용합니다(표 7).
- 이러한 표준을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선을 활용하여 알려지지 않은 샘플의 HBV DNA를 정량화합니다.
참고: Real-Time PCR 소프트웨어는 5가지 표준물질 모두의 HBV 표적에 대해 얻은 Ct 값과 마이크로리터당 국제 단위(IU/μL)의 해당 농도를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. - 표준물질의 기울기가 -3.1에서 -3.6 사이이고,R2 값이 0.99에서 1.0 사이이고, PCR 효율이 90%-110%(0.9-1.1)이고, 음성 대조군에서 증폭이 없는 경우에만 알려지지 않은 샘플에 대한 값을 해석합니다.
- 이 소프트웨어는 각 HBV 양성 샘플의 농도를 마이크로리터당 국제 단위(IU/μL)로 계산합니다. 바이러스 부하(IU/μL를 밀리리터당 국제 단위[IU/mL]로 변환)를 계산하려면 다음 방정식을 사용합니다.
결과(IU/mL) = (결과[IU/μL] x 용리 부피[μL])/ 시료 부피(mL)
참고: HBV DNA에 대한 4번째 WHO 국제 표준인 NIBSC 코드 10/266은 0.5mL 혈장에서 바이러스 DNA 정제를 위해 추출하고, 정제된 바이러스 DNA를 50μL의 용출 완충액으로 용출한 후 5가지 HBV 표준물질 및 NTC와 함께 PCR 키트와 함께 참조 샘플로 사용했습니다. 참조 샘플(NIBSC 코드 10/266)의 HBV 바이러스 양은 (6659IU/μL x 50μL)/0.5mL = 6,65,900IU/mL로 계산되었습니다.
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Representative Results
인간 혈장/혈청에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 워크플로우의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. HBV와 IC에 대한 표준 2(PC로 사용됨) 및 NTC의 증폭 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. 그림 3 은 HBV 양성 검체, HBV 음성 검체 및 PCR 억제 검체의 증폭 곡선을 보여줍니다. NIBSC 코드 10/266에 대한 증폭 곡선, HBV에 대한 Ct 값 및 마이크로리터당 국제 단위(IU/μL)의 HBV 농도는 그림 4에 나와 있습니다. 키트의 5가지 HBV 표준물질 모두의 HBV 표적에 대한 증폭 곡선과 이에 대한 대표적인 표준 곡선이 그림 5에 나와 있습니다. 표준 곡선의 기울기는 -3.361,R2 는 0.99996, 효율은 0.98입니다. 5가지 HBV 표준물질의 IC 표적에 대한 증폭 곡선은 그림 6에 나와 있습니다.
그림 1: 인간 혈장/혈청 샘플에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 워크플로우의 개략도. HBV 의심자의 인간 혈청/혈장 샘플에서 바이러스 DNA를 추출합니다. 템플릿 DNA/표준물질을 제외한 각 PCR 구성 요소를 추가하여 PCR 혼합물을 준비합니다. PCR 튜브/웰에 분주합니다. 추출된 바이러스 DNA/표준물질을 템플릿 DNA로 추가하고 PCR 튜브를 닫습니다. Real-Time PCR 머신에 로드하고, PCR 실행을 시작하고, 실행 완료 후 결과를 분석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 표준 2(PC로 사용됨) 및 NTC의 증폭 플롯. HBV 표준 2의 증폭 플롯은 HBV 및 IC 표적 모두에 대해 여기에 나와 있습니다. 정성적 결과 분석의 경우 표준 2를 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다. NTC의 경우 두 대상 중 하나에 대해 증폭이 관찰되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HBV 양성 샘플, HBV 음성 샘플, PCR 억제 샘플에 대한 증폭 플롯. HBV 양성(사례 1), HBV 음성(사례 2) 및 PCR 억제제가 포함된 샘플(사례 3)의 세 가지 샘플에 대한 증폭 플롯이 여기에 나와 있습니다. HBV 양성 샘플의 경우, 두 표적 모두 증폭된 반면, HBV 음성 샘플은 IC만 증폭되었고, HBV 표적에 대한 증폭은 예상대로 관찰되지 않았습니다. 사례 3에서는 HBV와 IC 모두 증폭되지 않았는데, 이는 PCR 주형으로 사용된 DNA 샘플에 존재하는 PCR 억제제로 인해 PCR 억제가 발생했음을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 증폭 곡선, HBV에 대한 Ct 값, NIBSC 코드 10/266에 대해 얻은 HBV 농도(IU/μL). NIBSC 코드 10/266의 추출된 바이러스 DNA를 5가지 HBV 표준 및 NTC와 함께 실행했습니다. HBV 표적에 대한 증폭 곡선은 상단 패널에 NIBSC 코드 10/266 샘플에 대해 표시됩니다. HBV의 Ct 값은 18.94이며, 계산된 농도는 6659IU/μL입니다(하단 패널 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 5가지 HBV 표준물질의 HBV 표적 증폭 곡선과 표준 곡선. 5가지 HBV 표준물질의 HBV 타겟(녹색 채널)에 대한 증폭 곡선이 상단 패널에 표시되어 있습니다. 기울기(3.361),R2 값(0.99996) 및 PCR 효율(0.98)과 함께 표준 곡선이 하단 패널에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 5가지 HBV 표준물질의 IC 표적에 대한 증폭 곡선. IC(황색 채널)에 대한 5가지 HBV 표준의 증폭 곡선이 여기에 나와 있습니다. 예상대로 비슷한 Ct 값으로 동일하게 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 5가지 HBV 표준물질 모두와 NTC의 HBV 표적에 대한 증폭 곡선을 세 번 실행했습니다. 5가지 HBV 표준물질의 HBV 표적(녹색 채널)에 대한 3회 반복실험의 증폭 플롯에서도 유사한 결과가 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: NIBSC 코드 10/266, NIBSC 코드 14/198 및 5가지 희석액의 HBV 표적에 대한 증폭 곡선. 참조 샘플 NIBSC 코드 10/266, NIBSC 코드 14/198 및 5가지 희석액(1.25IU/mL, 2.5IU/mL, 5IU/mL, 25IU/mL 및 50IU/mL)의 HBV 표적(녹색 채널)에 대한 증폭 곡선이 여기에 나와 있습니다. 1.25 IU/mL에 대해서는 증폭이 검출되지 않았으며, 다른 희석액은 38 Ct 이전에 적절한 증폭 곡선을 보였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 묘사 |
| 멀티플렉스 마스터 믹스 | PCR 완충액, Hot Start Taq DNA 중합효소 및 기타 PCR 성분 |
| HBV 프라이머 프로브 믹스 | HBV 검출을 위한 프라이머 및 프로브 믹스 |
| 내인성 IC 프라이머 프로브 믹스 | 내인성 내부 제어(IC) 검출을 위한 프라이머 및 프로브 믹스 |
| B형 간염 바이러스에 대한 표준 | · HBV 표준 1 |
| · HBV 표준 2 | |
| · HBV 표준 3 | |
| · HBV 표준 4 | |
| · HBV 표준 5 | |
| 네거티브 컨트롤 | PCR 등급 뉴클레아제가 없는 물 |
표 1: Real-Time PCR 키트와 함께 제공되는 시약 및 설명
| 시약 | 반응당 부피 |
| 멀티플렉스 마스터 믹스 | 11 μL |
| HBV 프라이머 프로브 믹스 | 2 μL |
| 내인성 IC 프라이머 프로브 믹스 | 2 μL |
| 총 반응량 | 15 μL |
표 2: PCR 혼합물 준비를 위해 반응당 첨가할 각 시약의 부피
| 걸음 | 온도(°С) | 시간 | 데이터 수집 | 사이클 |
| 초기 변성 | 94 | 10분 | - | 1 |
| PCR 사이클링 | 94 | 15들 | - | 40 |
| 55 | 60들 | 에 | ||
| 72 | 15들 | - |
표 3: PCR 순환 조건
| 과녁 | 로터 유전자 Q* | CFX 96 시리즈 | ABI Real-Time PCR# |
| HBV (간염염) | 녹색 | 팸 | 팸 |
| 집적회로 | 황색 | 16 진수 | 빅 |
| *Auto-Gain Optimization Setup- 'Perform Optimization Before 1st Acquisition'을 선택합니다. | |||
| #Applied Biosystems의 Real-Time PCR 기계의 경우, 키트의 마스터 믹스에 ROX가 포함되어 있으므로 플레이트 설정 중에 ROX를 '패시브 참조' 염료로 선택하십시오. | |||
표 4: 다양한 Real-Time PCR 플랫폼을 위한 염료 선택
| 실시간 PCR 기기 | 염료 | 임계값 범위§ |
| ABI Real-Time PCR¶ | 팸 | 0.2–0.25 |
| 빅 | 0.05–0.12 | |
| 바이오 라드 CFX-96† | 팸 | 100–800 |
| 16 진수 | 50–400 | |
| 로터 유전자 Q | 녹색 | 0.015–0.03 |
| 황색 | 0.01–0.02 | |
| §절대 임계값은 기기의 수명, 모델 및 교정 상태에 따라 기기마다 다릅니다 | ||
| ¶이러한 임계값은 ROX가 'Passive Reference' 염료로 선택되었을 때 적용할 수 있습니다 | ||
| †상대 형광은 투명 튜브 대신 Bio-Rad의 백색 PCR 튜브를 사용할 때 약 2배에서 5배 증가합니다. 따라서 임계값은 그에 따라 결정되어야 합니다 | ||
표 5: 다양한 Real-Time PCR 플랫폼에 대한 권장 임계값
| 시료 유형 | 경우 | 증폭 신호 입력 | 결과 해석 | |||
| FAM/그린 | 육각/빅/옐로우 | |||||
| 제어 | 표준 2/PC | 예(20 ± 2) | 예(24 ± 3) | 표준 2/PC가 제대로 작동하고 있습니다. | ||
| 증권 시세 표시기 | 아니요 | 아니요 | NTC가 제대로 작동하고 있습니다. | |||
| 견본 | 1 | 예 | 예 / 아니오* | HBV 특이적 DNA 검출 | ||
| 2 | 아니요 | 예 | HBV 특이적 DNA가 검출되지 않았습니다. 샘플에는 검출 가능한 양의 HBV 특이적 DNA가 포함되어 있지 않습니다. | |||
| 3 | 아니요 | 아니요 | PCR 억제 가능, DNA 샘플 희석(1:10) / 원본 샘플에서 DNA를 다시 추출하고 PCR을 반복합니다. | |||
| *HBV 표적이 감지될 때 내부 통제의 탐지는 필요하지 않습니다. 샘플의 HBV DNA 부하가 높으면 내부 제어 신호가 감소하거나 없을 수 있습니다. | ||||||
표 6: 품질이 낮은 샘플을 포함하는 양성, 음성 및 PCR 억제제의 결과 해석
| 표준 | 농도 (IU / μl) | 희망 Ct | |
| HBV (간염염) | 집적회로 | ||
| (FAM/그린) | (헥스/빅/옐로우) | ||
| HBV 표준 1 | 5 엑스 104 | 17 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV 표준 2 | 5 엑스 103 | 20 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV 표준 3 | 5 엑스 102 | 23 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV 표준 4 | 5 엑스 101 | 27 ± 2 | 24 ± 3 |
| HBV 표준 5 | 5 엑스 100 | 31 ± 2 | 24 ± 3 |
표 7: HBV 표준물질과 HBV 목표치의 농도 및 원하는 Ct 값
| 견본 | 예상 Ct | B형 간염 바이러스에 대한 Ct 획득 | 평균 Ct | 표준 편차 | 이력서 % | ||
| 반복실험 1 | 복제실험 2 | 복제실험 3 | |||||
| HBV 표준 1 | 17 ± 2 | 17.01 | 16.89 | 17.07 | 16.99 | 0.09 | 0.54 |
| HBV 표준 2 | 20 ± 2 | 20.29 | 20.32 | 20.34 | 20.32 | 0.03 | 0.12 |
| HBV 표준 3 | 23 ± 2 | 23.61 | 23.88 | 23.73 | 23.74 | 0.14 | 0.57 |
| HBV 표준 4 | 27 ± 2 | 26.95 | 27.03 | 27.12 | 27.03 | 0.09 | 0.31 |
| HBV 표준 5 | 31 ± 2 | 30.58 | 30.91 | 31 | 30.83 | 0.22 | 0.72 |
표 8: 5가지 HBV 표준물질의 Ct 값, 평균, 표준편차 및 변동계수(CV%)를 구한 결과.
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Discussion
NIBSC 코드 10/266은 공급업체 정보21에 따라 0.5mL의 뉴클레아제가 없는 물에서 재구성할 때 9,55,000IU/mL의 단위가 할당되었습니다. 이것은 고부하 HBV 양성 샘플로 간주될 수 있습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 부하 키트로 측정된 HBV 바이러스 양은 6,65,900IU/mL였습니다(그림 4). DNA 추출 키트의 DNA 추출 효율이 100%가 아니기 때문에 정제 과정에서 일부 DNA가 손실되는 경우가 많습니다. 키트에 의해 측정된 바이러스 부하가 시약(NIBSC 코드 10/266) 공급업체가 할당한 값보다 약간 낮지만, 두 값 간의 log10 차이가 컷오프 값(0.5)22보다 작은 0.157에 불과하기 때문에 데이터는 여전히 만족스럽습니다.
이 프로토콜에 사용된 바이러스 로드 키트는 매우 견고하며 그림 7과 같이 재현 가능한 데이터를 제공합니다. 본 실험에서는 5가지 표준물질과 NTC를 모두 3중으로 실행하였으며, 이들의 Ct 값, 평균, 표준편차 및 변동계수(CV%)를 표 8에 나타내었다. 표 8에 언급된 바와 같이 CV%가 1% 미만으로 낮으면 실험의 신뢰성이 높고 매우 정확한 결과를 산출한다는 것을 나타냅니다.
매우 낮은 부하 참조 샘플(NIBSC 코드: 14/198)23 을 키트와 함께 사용하여 LoD를 확인했습니다. NIBSC 코드 14/198은 공급업체 정보에 따라 50IU/mL 미만의 HBV DNA를 함유하고 있습니다. NIBSC 코드 14/198로부터 DNA를 추출하고, DNA의 다중 희석액(1.25 IU/mL, 2.5 IU/mL, 5 IU/mL 및 25 IU/mL)을 준비하였다. 이 키트는 모든 희석액과 5가지 HBV 표준물질을 템플릿 DNA로 사용했습니다. 이 키트는 HBV DNA를 최대 2.5IU/mL까지 모든 희석액을 검출할 수 있으며(그림 8), 바이러스 로드 키트의 LoD와 정확히 일치하는 것으로 관찰되었습니다. 따라서 바이러스 로드 키트는 분자 진단 실험실에서 의료 전문가가 HBV 감염을 효과적으로 진단하고 관리하는 데 도움을 줄 수 있는 매우 민감하고 재현 가능한 도구입니다.
사용자는 절차를 수행할 때 다음과 같은 중요한 단계를 염두에 두어야 합니다. 사용자는 정확한 결과를 보장하기 위해 고품질의 추출된 DNA만 PCR 템플릿으로 사용해야 합니다. 시약의 여러 동결-해동 주기(3회 이하)를 피하는 것이 중요합니다. PCR 혼합물은 빛에 민감한 형광 프로브와 수동 참조 염료 ROX를 포함하므로 장시간 빛에 노출되어서는 안 됩니다. 결과의 정확성과 신뢰성을 보장하기 위해 각 실행에 항상 템플릿 제어 및 표준을 포함하지 않는 것이 중요합니다. 멸균 필터 팁이 있는 교정된 피펫은 항상 사용해야 합니다. 템플릿 DNA와 표준물질은 교차 오염을 방지하기 위해 반응 준비 영역과 다른 피펫을 사용하여 별도의 영역에 추가해야 합니다.
다음은 B형 간염 바이러스 DNA의 Real-Time PCR 기반 검출 및 정량화를 위한 몇 가지 일반적인 문제 해결 팁입니다. 음성 대조군의 증폭 신호는 반응 설정 중 교차 오염으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서 사용자는 키트 구성 요소의 오염을 확인해야 합니다. 다음과 같은 이유로 표준물질이 있는 증폭 신호가 발생하지 않을 수 있습니다: (i) 잘못된 PCR 혼합물이 사용되었습니다. 사용자는 모든 구성 요소가 올바르게 추가되었는지 확인해야 합니다. (ii) 만료된 시약의 사용. 사용자는 반응을 설정하기 전에 만료 날짜를 확인해야 합니다. (iii) 시약의 부적절한 보관. 시약은 -20°C 이하에서 보관하고 반응 설정 중에 실온에서 장기간 보관하지 마십시오. (iv) 잘못된 PCR 순환 조건이 사용되었습니다. 이 경우 올바른 프로그램으로 PCR을 반복하는 것이 좋습니다. (iv) 검체에 대한 내부 대조군의 신호가 약하거나 전혀 없는 것은 검체의 높은 HBV 부하 및 PCR 억제로 인해 발생할 수 있습니다. 사용자는 DNA 샘플을 희석하고(1:10) 샘플에서 높은 HBV 부하에 대한 분석을 반복할 수 있습니다. PCR 억제의 경우 샘플 DNA를 양질의 시약으로 다시 추출하고 분석을 반복해야 합니다.
B형 간염 바이러스 DNA의 실시간 PCR 기반 검출 및 정량화는 매우 민감하고 특이적인 기술이지만 비용 및 복잡성과 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. Real-Time PCR 기기 및 시약은 비용이 많이 들 수 있으며 테스트 비용은 일부 환자와 의료 시스템에 장벽이 될 수 있습니다. Real-Time PCR은 교육을 받은 직원이 분석을 수행하고 결과를 해석해야 하는 복잡한 기술입니다. 이는 바이러스 부하의 간접적인 측정이므로 표준물질의 품질과 템플릿 DNA가 모두 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. HBV의 새로운 유전자형 및/또는 프라이머-프로브 영역의 돌연변이는 위음성 결과를 초래할 수 있습니다.
HBV DNA의 실시간 PCR 기반 검출 및 정량화는 낮은 수준의 바이러스 DNA를 검출할 수 있는 매우 민감하고 특이적인 방법입니다. 혈청학적 검사(ELISA 및 측면 유동 분석)와 같은 다른 방법과 비교할 때 Real-Time PCR에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 혈청학적 검사보다 더 민감합니다. 둘째, 검체에 존재하는 HBV DNA의 양을 정량화할 수 있는 반면, 혈청학적 검사는 정성적 결과만 제공할 수 있습니다. 마지막으로, Real-Time PCR은 혈청학적 검사보다 위양성(false positive)이 발생할 가능성이 적다(24). 전반적으로, Real-Time PCR은 HBV DNA의 검출 및 정량화에 사용할 수 있는 가장 민감하고 특이적이며 정량적인 방법입니다. 또한 비교적 빠른 기술이므로 임상적 사용에 이상적입니다.
B형 간염 바이러스 DNA의 실시간 PCR 기반 검출 및 정량은 새로운 항바이러스 치료법 개발 및 현장 진료 검사를 포함하여 향후 여러 응용 분야에서 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 기술은 새로운 항바이러스제를 스크리닝하고 임상 시험에서 이러한 약물의 효능을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 HBV 감염에 대한 보다 효과적이고 독성이 적은 치료법의 개발로 이어질 수 있습니다. Real-Time PCR 기기는 점점 더 작아지고 휴대성이 향상되어 진료 현장에서 HBV 바이러스 부하 검사를 수행할 수 있게 되었습니다. 이를 통해 검사에 대한 접근성을 개선하고 HBV 감염을 조기에 진단하고 치료할 수 있습니다. 이 Real-Time PCR 기반 키트의 리젠트는 바이알 부하를 보다 정확하게 모니터링하기 위해 절대 정량을 위해 디지털 PCR로 조정할 수 있습니다.
이러한 특정 응용 분야 외에도 HBV DNA의 실시간 PCR 검출 및 정량 분석은 HBV 감염 예방, 진단 및 치료를 위한 새로운 도구 및 전략의 연구 및 개발에 중요한 역할을 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 연구에 사용된 HBV 바이러스 로드 키트의 제조업체인 Kilpest India Limited와 관련이 있습니다.
Acknowledgments
기술 지원을 해주신 Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita 및 Shikha에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
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